檢測(cè)馬鈴薯環(huán)腐病菌的PCR_ELISA和DNA雜交等方法的比較

1、檢測(cè)馬鈴薯環(huán)腐病菌的 PCR 、 ELISA 和 DNA 雜交等方法的比較 S. A. Slack 等著 劉學(xué)敏譯盡管在種用馬鈴薯中 , 對(duì)細(xì)菌性環(huán)腐病 的不容許殘留 限制超過(guò) 了 50年 , 但 在北美 洲 , 該病仍然是馬鈴薯種薯的主要限制因素。 由于實(shí)施不容許殘留限制主要是通過(guò)觀察大 量種用馬鈴薯 , 因而檢測(cè)這種病害時(shí)干擾觀 察者能力的因素如無(wú)癥狀侵染、 對(duì)癥狀發(fā)展 不利的環(huán)境條件、 栽培品種對(duì)馬鈴薯環(huán)腐病 菌 (Clavibacter michiganensis subsp. sepe-donicus 反應(yīng)的變異、 以及其它病害的干擾或 寄主直接自然衰老等都影響檢測(cè)的有效性。 只基于

2、癥狀表現(xiàn)來(lái)診斷細(xì)菌性環(huán)腐病的困難 使得幾種檢測(cè)方法得到運(yùn)用和發(fā)展 , 其中包 括革蘭氏染色 , 茄子生物檢測(cè)和幾種血清試 驗(yàn) , 如膠乳凝集作用 , 免疫熒光 , 酶聯(lián)免疫吸 附測(cè)定 (ELISA 。雖然已經(jīng)證實(shí)這些方法是 有用的 , 但它們的使用受勞動(dòng)力、 空間、 靈敏 度或特異 性以及檢測(cè)所 需時(shí)間等因 素的限 制。最近 , DNA 雜交測(cè)定 (DHAs 法在檢測(cè) 和診斷細(xì)菌性環(huán)腐病中顯示出了魅力。這種 方法對(duì)于馬鈴薯環(huán)腐病菌的檢測(cè)是高度特異 的 , 但其檢測(cè)靈敏度是個(gè)限制因素?？朔@ 個(gè)問(wèn)題的方法是利用聚合酶鏈反應(yīng) (PCR 。 本研究詳述了利用 PCR 檢測(cè)和診斷田間生 長(zhǎng)馬鈴薯粗提取

3、液中細(xì)菌性環(huán)腐病的調(diào)查結(jié) 果 , 并提供了 PCR 同 ELISA 和 DHA 的比較 數(shù)據(jù) , 這個(gè)數(shù)據(jù)的報(bào)告已發(fā)表。1材料和方法1. 1細(xì)菌培養(yǎng)和接種體的準(zhǔn)備馬鈴薯 環(huán)腐病菌菌株 SS43在 7g /100g 的蛋白胨和 7g/100g 的蔗糖溶液中以凍干的 形式保 存 , 于室溫 下 (接近 23e 在肉汁 -酵 母瓊脂培養(yǎng)基上 (NBY 培養(yǎng)。生長(zhǎng) 5d7d 后 , 細(xì)菌被轉(zhuǎn)移到裝有 500m l NBY 培養(yǎng)液的 1L 燒瓶中 , 室溫下在 Labline3520搖床上以 150r/m in 的速度振蕩培養(yǎng) 1周。于 4e , 以 15000x g 離心 30min 收集菌體 , 重

4、新懸浮于 0105mol/LpH712的磷 酸緩沖溶 液 (PB 中 , 根據(jù) A 600相當(dāng)于 110108CFU/m l 調(diào)整懸浮 液濃度為 104CFU /ml 或 1011CFU /ml 。 1. 2試驗(yàn)設(shè)計(jì)和準(zhǔn)備接種劑量和栽培品種 (32 因子處理采 用完全隨 機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì) , 由 6個(gè)小 區(qū) (每小區(qū) 15株 組成 , 試驗(yàn)在北達(dá)克他州法戈和紐約 州伊薩卡進(jìn)行。種薯準(zhǔn)備和接種在伊薩卡進(jìn) 行 , 種薯在法戈種植 , 隔夜郵遞。經(jīng)過(guò)檢驗(yàn)的 馬鈴 薯 種薯 (品 種 Bel Rus 和 Russet Bur -bank 切割前 1周從冷藏中取出 , 切下含有單 個(gè)芽眼同樣大小的種薯 (約

5、40g 保存于紙袋 中 , 紙袋用 3g/L Penncozeb 溶液浸濕并酸化 2d3d 。在種塊發(fā)芽的一側(cè)以 15b 角插入移 液管尖端 , 用 10L l 細(xì)菌懸浮液接種 , 最終接 種劑量為 102或 109CFU, 對(duì) 照植株 用 10L l 無(wú)菌 PB 接種。接種 后 , 將種 子送回前面所 述的紙袋中 , 于室溫下貯存直至種植。 1. 3樣品準(zhǔn)備和試驗(yàn)定植后 35d 和 90d, 在每個(gè)小 區(qū)選取 5株地上或土中的主莖樣本 , 在北達(dá)克他收集 的樣本通過(guò)特快郵遞送至紐約 , 樣品用冷自收稿日期 :1997-04-025680(5 :國(guó)外農(nóng)學(xué) 雜糧作物 1998, 18(1 :49

6、52來(lái)水沖洗 , 按先前描述的方法直接用尼龍膜 吸印 , 然 后 樣 品密 封 于 塑 料 袋 中 , 保 存 在 -135e 下。至少 24h 后把樣品從冷凍中取 出 , 緩緩融化 , 再在尼龍膜上吸印 , 尼龍膜按 前面描述的方法進(jìn)行雜交 , 然后 , 從樣品上切 下一小塊 (110g 放入 2ml TE 溶液 (10mmol/L Tris -H Cl, 110m mol/L EDTA, pH 810 中研 磨 , 準(zhǔn)備進(jìn)行 ELISA 和 PCR 試驗(yàn)。這些提 取液放在微形試管中于 -80e 下保存。用于 ELISA 檢測(cè)的樣品 , 先將 100ml TE 提取液 加入 900ml 提取

7、緩 沖溶液中 014g /100g 牛 血 清 白蛋白 (BSA , 2g/100g 聚乙烯 基吡咯 烷 酮 mol/L r 2400040000, 0113g/100gNa 2H PO 4, 0102g/100g KH 2PO 4, 0102g/100gKCl, 0105g/100g 吐溫 20, pH714根據(jù) 制造者提供的方案進(jìn)行檢測(cè)。用于本研究的 ELISA 系統(tǒng)是以 De Boen 等 (1989和 1988 描述的馬鈴薯環(huán)腐病菌的單克隆抗體 (1H3 為基礎(chǔ)的。1. 4 聚合酶鏈反應(yīng)一個(gè) 合 成 的 20-bp 低 聚 核 苷 酸 引 物 CSRS -C (5p -GGCCATGA

8、CGTTG -GTGACAC 用于擴(kuò)增一個(gè)細(xì)菌質(zhì)粒 pCS1的 重復(fù)序列的 11054-kb 片斷 , 將 2L l TE 提取 的原始樣品加入 198L l 蒸餾水中 , 輕輕混勻。 取 20L l 稀釋的提取液 , 加到 20L l 新配制的溶 菌緩沖 溶液 1125g/100g 十 二 烷基 磺 酸鈉 (SDS , 015m mol/LNaOH 中 , 于 90e 下加熱 15min, 取 5L l 溶胞懸浮液加到 45L l PCR 混 合物 (50mmol/L KCl, 10m mol/L Tris -HCl, pH 813, 200mmol/L dNTP, 1mmol/L 引 物

9、CSRS -C,20g/100g去 離 子 乙 酰 胺 ,1125UAmpliTaq DNA 聚合酶 , 3m mol/L Mg -Cl 2, 0175g/100g 吐溫 20 中 , 上面 覆蓋礦物 油。 PCR 反應(yīng)在 Perkin -ElmerDNA 熱 循環(huán) 儀 480上 按下 面 程序 循 環(huán) 36次 :循環(huán) 1:94e /3min, 50e /60s, 73e /90s; 循環(huán) 236:94e /60s, 50e /60s, 73e /90s 。 PCR 反應(yīng)產(chǎn) /溴化乙錠染色 , 在紫外燈下觀察。 1. 5 數(shù)據(jù)分析測(cè)定結(jié)果以二進(jìn)制變量輸入計(jì)算機(jī)并用 邏輯算符 (如和 , 如果

10、, 或 進(jìn)行比較 , 根據(jù)制 造者 的 推 薦 , A 405=012的 吸 收 值 作 為 ELISA 樣 品的 界 限值 , 記為 陽(yáng) 性。 PCR 和 DHA 樣品分別以在凝膠上存在相應(yīng)大小的 譜帶或放射性自顯影上產(chǎn)生明顯的標(biāo)志記為 陽(yáng)性。所有樣品的分析結(jié)果用 Cochran 測(cè)驗(yàn) 進(jìn)行比較。接種劑量、 品種、 地點(diǎn)和取樣日期 對(duì)每種方法檢測(cè)性能的影響利用 SAS 系統(tǒng) 中的 PROC GLM 程序分析 協(xié)方差確 定 , 除 非另有記錄 , 本文數(shù)據(jù)為所有樣品的最終測(cè) 驗(yàn)結(jié)果。2 結(jié)果和討論我們的 PCR 反應(yīng)程序中使用了一個(gè) 20-bp 低聚核苷酸引物 (CSRS -C 該引物是帶有

11、質(zhì)粒 pCS1中一個(gè)長(zhǎng)度為 11078-kb S mal 片 斷的重復(fù)序 列的 , 除 P40外 , 測(cè)驗(yàn) 的所有馬 鈴薯環(huán)腐病菌菌株都含有這個(gè)質(zhì)粒。這個(gè)重 復(fù)序列含有所有的倒置重復(fù) , 因此用于擴(kuò)增 僅需單個(gè)引物。引物結(jié)合到 S mal 片斷的核 苷酸 20bp39bp(互補(bǔ)鏈的同源部分 處 , 擴(kuò) 增時(shí)產(chǎn)生一個(gè) 11054kb 的產(chǎn)物 , 這個(gè)產(chǎn)物代 表原始 Sm al 片斷的 剩余 20bp1073bp 部 分 , 這個(gè)引物是從用于 DHA 研究的同一個(gè) DNA 序列上得到的。從純細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)獲得的結(jié)果與前面報(bào) 道的 DHA 結(jié)果一樣。所有的馬鈴薯環(huán)腐病 菌菌株試驗(yàn)都得到陽(yáng)性 PCR 結(jié)

12、果。除了馬 鈴薯環(huán)腐病菌的 4個(gè)菌株外 , 與一些棒狀桿 菌以及其它細(xì)菌的細(xì)菌環(huán)腐病 PCR 試驗(yàn)的 預(yù)計(jì)陽(yáng)性 PCR 相比 , 其它棒狀桿菌的結(jié)果都 沒(méi)有導(dǎo)致非特異性 PCR 產(chǎn)物 , 它能明顯地區(qū) 分于馬鈴薯環(huán)腐病菌的 PCR 產(chǎn)物 , 其在凝膠 上的 帶大 小和 數(shù) 量不 同。 在 Curtobacteri-um , 歐氏桿菌屬和假單胞桿菌屬的試驗(yàn)中產(chǎn) #50#國(guó)外農(nóng)學(xué) 雜糧作物 第 18卷當(dāng)一系列馬鈴薯環(huán)腐病菌的純培養(yǎng)稀釋 用于測(cè)試時(shí) , 我們發(fā)現(xiàn)普遍用于檢測(cè)細(xì)菌性 環(huán)腐病的方法中 PCR 是最靈敏的 , 在這些試 驗(yàn)中 , 每個(gè)反應(yīng) PCR 常規(guī)檢測(cè)少于 10CFU 。 在純培養(yǎng)極高

13、稀釋情況下 (如小于 1CFU/反 應(yīng) , 結(jié)果不一致 , 可能是由于反應(yīng)混合物中 目標(biāo) DNA 概率較低造成的。 PCR 似乎不受 馬鈴薯環(huán)腐病菌菌系的影響 , 因?yàn)槲覀兛梢?以相同的靈敏度檢測(cè)這個(gè)細(xì)菌的流動(dòng)的和非 流動(dòng)的菌株 , 這與根據(jù)馬鈴薯環(huán)腐病菌胞外 抗原產(chǎn)物的血清學(xué)檢測(cè)的結(jié)果相反。測(cè)試原始植物材料方案的最初過(guò)程顯示 出 PCR 反應(yīng)混合液中 M gCl 2和 SDS 的濃度 對(duì)于檢測(cè)的成功是很關(guān)鍵的 , 還發(fā)現(xiàn)粗樣的 稀釋對(duì) 于排除 PCR 反 應(yīng)的抑 制是必 需的。 運(yùn)用試 驗(yàn)原 始植物 材料 的最 適方 案 , 證明 PCR 是特異而靈敏的檢測(cè)田間樣品的方法。 本研究中 , 使

14、用了所有檢測(cè)馬鈴薯環(huán)腐病菌 的方 法 , 716個(gè)樣 品 中 2412%得 到 了陽(yáng) 性 PCR 反 應(yīng) , 對(duì)應(yīng) 的 ELISA 和 DHA 分別 是 2319%和 2019%(PCR, ELISA 和 DHA 的接 種樣品分別為 3612%, 3518%, 2911% ?？?之 , 在 檢 測(cè) 中 觀 察 到 的 差 異 統(tǒng) 計(jì) 顯 著 (Cochran 測(cè)驗(yàn) , P<010001 , PCR 和 ELISA 與 DHA 相 比 具 有 明 顯 較 高 的 檢 測(cè) 率 (Cochran 測(cè)驗(yàn) , P 01001 ?？傮w上 , 在 DHA 檢測(cè)中 , 當(dāng)樣品在尼龍膜上吸印前經(jīng)過(guò)冷凍 時(shí)

15、 , 所獲得的陽(yáng)性反應(yīng)數(shù)目有略微顯著的增 加 , 大概冷凍提高了植物組織中細(xì)菌的釋放。 田間小區(qū)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)是在大范圍條件下 進(jìn)行樣品檢測(cè) , 會(huì)遇到種子自身檢驗(yàn)和 /或診 斷 , 以及包括 /最好情況 0和 /最壞情況 0在內(nèi) 的各種情況。例如 , 高 接種劑量、 易 感品種 (Russet Burbank 和取樣日期晚的組合就與 低接種劑量 , 耐性品種 (Bel Rus 和取樣日期 早的組合截然不同。本研究采用的每一檢測(cè) 手段均受接種劑量、 品種和取樣日期的顯著 影響 (協(xié)方差分析每一種 檢測(cè) P=010001 , 素時(shí) , 通常用 PCR 比用其它的檢測(cè)方法具有 更大的檢測(cè)頻率。在 /最

16、好情況 0下。來(lái)自紐 約和北達(dá)可他的樣品馬鈴薯環(huán)腐病菌的檢出 率分別 為 70%和 9313%, 而在 /最 壞情況 0下 , 檢出率較低 , 甚至根本檢測(cè)不出細(xì)菌。一 些處理組合中 , 檢出率低是令人擔(dān)憂的。然 而是否陰性試驗(yàn)結(jié)果就說(shuō)明了在植物中不能 檢測(cè)出群體數(shù)量低的細(xì)菌 , 或是否接種后不 能侵染還不清楚。數(shù)據(jù)表明后者的解釋可以 說(shuō)明許多陰性的試驗(yàn)結(jié)果。對(duì)照植株的大部 分 (96% 的 ELISA 值 在 -01025A 405 01038范圍內(nèi)。接種植 株的 84%由 ELISA 檢測(cè)為陰性的 , 其吸收值在此范圍內(nèi)。因此 , 可能是真正的陰性。前人的研究表明侵染植 株的細(xì)菌群體數(shù)量在

17、生長(zhǎng)季節(jié)早期即達(dá)到檢 測(cè)水平 , 我們觀察確定播種后 35d 能檢測(cè)到 細(xì)菌。本研究中包括了許多處理組合 (如北 達(dá)科他州樣 品和 低接 種 劑量 的 Bel Rus 植 株 , 然而隨著生長(zhǎng)季節(jié)的進(jìn)程 , 陽(yáng)性植株的 數(shù)量不是持續(xù)增加 , 表明受侵染的植株趨向 于擴(kuò)增細(xì)菌的數(shù)量。此外 , 接種劑量、 地點(diǎn)、 品種或取樣日期與被侵染植株體內(nèi)的細(xì)菌數(shù) 量之間沒(méi)有明顯的關(guān)系 , 這與前人報(bào)道的耐 性品種體內(nèi)馬鈴薯環(huán)腐病菌數(shù)量低 , 并且這 能反映這些品種具有對(duì)侵染的一些抗性的結(jié) 論相反。檢測(cè)馬鈴薯環(huán)腐病菌的能力的地區(qū) 間差異可 以表明抗侵染 能力受制 于環(huán)境條 件 , 這可以幫助我們解釋環(huán)境對(duì)癥狀

18、表達(dá)的 影響。盡管 PCR 比 ELISA 有較高的 檢測(cè)率 , 但這種差 異統(tǒng)計(jì) 不顯 著 (Cochran 測(cè)驗(yàn) P= 015639 。然而發(fā)現(xiàn) ELISA 的性能主要依賴 于區(qū)分所 采用樣品是陽(yáng) 性還是陰 性的界限 值。正如 DeBoer 所述 , 對(duì) 細(xì)菌 性環(huán)腐 病用 ELISA 檢測(cè)的樣品 在低的和高的 吸收讀數(shù) 間傾向于形成連續(xù)性 , 而不是對(duì)確定界限呈 理想的雙峰分布。本研究中可以觀察到對(duì)照 和接種植株得到的吸收值間大量的交迭 , 如 ,# 51 #第 1期 S. A. Slack 等 :檢測(cè)馬鈴薯環(huán)腐病菌的 PCR 、 EL ISA 和 DNA 雜交提高雜交玉米種子質(zhì)量和產(chǎn)量

19、的探討 趙桂萍(遼寧省鐵嶺市種子管理站 鐵嶺 112000玉米雜交種子現(xiàn)在已普遍應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生 產(chǎn) , 全國(guó)每年需玉米雜交種約 8105t 9 105t, 可見(jiàn)雜交玉米種子質(zhì)量的好壞、 產(chǎn)量的 高低直接影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及糧食產(chǎn)量。 玉米雜種優(yōu)勢(shì)的充分利用 , 關(guān)鍵取決于 種子的質(zhì)量 , 而高質(zhì)量的種子一是要有遺傳 力強(qiáng)、 高純度、 高配合力的親本自交系組配 ; 二是嚴(yán)格掌握制種技術(shù) , 玉米制種技術(shù)包括 種子質(zhì)量與種子產(chǎn)量?jī)蓚€(gè)方面。 1保證種子質(zhì)量1. 1親本純度的高低是決定種子質(zhì)量的最 關(guān)鍵因素 如果親本純度本身不達(dá)標(biāo) , 特別 是父本 , 在制種的其它環(huán)節(jié) , 無(wú)論怎樣嚴(yán)格也 將無(wú)濟(jì)于事 , 所

20、以選擇親本時(shí)一定要注意純 度 , 有必要用電泳或種植手段進(jìn)行純度鑒定。 1. 2安排好隔離區(qū)是提高種子質(zhì)量的前提 隔離區(qū)要求空間距離在 300m 以上 , 時(shí)間 隔離在 40d 以上 (指春播 , 高稈作物或自然收稿日期 :1997-12-10性 , 使用高界值 (如 A 405=012 完全排除了記 錄對(duì)照植株是陽(yáng)性的問(wèn)題 , 但試驗(yàn)結(jié)果中潛 在的錯(cuò)誤的陰性結(jié)果數(shù)量增加。相反 , PCR 和 DHA 的結(jié)果在瓊脂糖凝膠或放射性自顯 影上非常清晰 , 或有一強(qiáng)信號(hào)或無(wú)信號(hào)。在 植株樣品試驗(yàn)中只觀察到了馬鈴薯環(huán)腐病菌 11054kb PCR 產(chǎn)物用緩沖液接種植株試驗(yàn) , PCR 或 DHA 都不是陽(yáng)性。本研究采用的檢測(cè)方法具有一致性。這 表明絕大多數(shù)供試樣品獲得了明確的試驗(yàn)結(jié) 果。通常這些結(jié)果是經(jīng)過(guò)重復(fù)試驗(yàn)而加以肯 定的。然而 28個(gè)樣品 (占