原位雜交操作流程(共8頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上原位雜交操作流程1、使用地高辛標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行石蠟切片的RNA原位雜交第一天1） 二甲苯于37脫蠟2次，每次15分鐘；2） 無水乙醇浸泡2次，每次3分鐘；3） 95%乙醇浸泡2次，每次3分鐘；4） PBS清洗3分鐘；5） 2%焦碳酸二乙酯室溫下浸泡10分鐘；6） PBS清洗10分鐘；7） 加入胃蛋白酶25ul/ml，37孵育15分鐘；8） PBS清洗2次，每次3分鐘；9） 0.2N的HCl孵育30分鐘；10）PBS清洗2次，每次3分鐘；11）0.25%無水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分鐘；12）PBS清洗2次，每次5分鐘；13）預(yù)雜交緩沖液孵育30分鐘；14）準(zhǔn)備

2、核酸探針混合物：使用預(yù)雜交緩沖液稀釋探針，85加熱5分鐘，置于冰塊中10分鐘；15）雜交；第二天16）將玻片置于SSC中2次，每次5分鐘以去除封片；17）PBS清洗3分鐘；18）RNA酶A溶液中（或0.1-1ng/mlPBS中），37孵育30分鐘；19）PBS清洗5分鐘；20）室溫，2×SSC清洗10分鐘；21）37，1×SSC清洗10分鐘；22）37，0.5×SSC清洗10分鐘；23）緩沖液A孵育10分鐘；24）緩沖液A（1%正常綿羊血清和0.03%三重氫核X-100）孵育30分鐘；25）加入抗地高辛抗體（1/200的上述緩沖液，來自Boehringer Man

3、nheim），37孵育3 小時(shí)；26）緩沖液A清洗2次，每次10分鐘；27）緩沖液B清洗2次，每次5分鐘；28）制成NBT/BCIP暗處保存30-60分鐘，顯微鏡下進(jìn)行觀察，如果背景尚佳，顯色時(shí)間可延長(zhǎng)到16小時(shí)；29）停止緩沖液B的反應(yīng)，用水進(jìn)行簡(jiǎn)單的清洗；30）固紅，脫水以及封片進(jìn)行核的復(fù)染。2、使用地高辛標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行石蠟切片的原位DNA雜交第一天1） 二甲苯于37脫蠟2次，每次15分鐘；2） 無水乙醇浸泡2次，每次5分鐘；3） 95%乙醇浸泡2次，每次5分鐘；4） PBS清洗5分鐘；5） 2%焦碳酸二乙酯室溫下浸泡10分鐘；6） PBS清洗5分鐘；7） 加入胃蛋白酶25ul/m

4、l，37孵育10分鐘；8） PBS清洗2次，每次5分鐘；9） 0.2N的HCl孵育30分鐘；10）PBS清洗2次，每次5分鐘；11）0.25%無水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分鐘；12）PBS清洗5分鐘；13）預(yù)雜交緩沖液孵育30分鐘；14）準(zhǔn)備寡核苷酸探針混合物：使用預(yù)雜交緩沖液稀釋探針； 15）雜交；第二天16）將玻片置于SSC中以去除封片；17）室溫，2×SSC清洗10分鐘；18）37，1×SSC清洗10分鐘；19）37，0.5×SSC清洗10分鐘；20）緩沖液A孵育10分鐘；21）緩沖液A孵育30分鐘；22）加入抗地高辛抗體37孵育3小時(shí)；23）緩沖液A

5、清洗2次，每次5分鐘；24）緩沖液B清洗2次，每次5分鐘；25）制成NBT/BCIP暗處保存30-60分鐘，顯微鏡下進(jìn)行觀察，如果背景尚佳，顯色時(shí)間可長(zhǎng)到16小時(shí)；26）停止緩沖液B的反應(yīng)，用水進(jìn)行簡(jiǎn)單的清洗；27）固紅，脫水以及封片進(jìn)行核的復(fù)染。 FISH步驟 1、脫蠟：1）二甲苯脫蠟3次，每次5min；2）100酒精兩次，每次2min；3）移出酒精，斜置切片，標(biāo)記末段向下，空氣干燥。2、蛋白酶處理:1）每個(gè)染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中預(yù)熱。將消化酶液加入管內(nèi)，搖動(dòng)直到酶溶解。2） 37水浴槽中預(yù)熱染色缸和蛋白酶K溶

6、液。37孵育20min。3） ×SSC在室溫下漂洗切片3次，每次1min。4）梯度酒精脫水（-20預(yù)冷）。3、變性：1）每一個(gè)立式染色缸配制40ml變性溶液；2）78水浴槽中平衡預(yù)熱混合液染色缸；3）78孵育8min；4） 即移入-20預(yù)冷70%酒精的染色缸內(nèi)2min，再依次移入80%、90%和100%的-20預(yù)冷酒精內(nèi)，每缸2min；5）空氣干燥。4、雜交：1）準(zhǔn)備探針；2）取一個(gè)較大的濕盒，交叉放置切片；3）滴10l探針在切片的組織上，加蓋玻片；4）蓋上濕盒蓋，37孵育12h16h。雜交后的水洗：5）鑷子小心去除蓋玻片；6）43預(yù)熱雜交后水洗溶液40ml水洗切片15min；7）2

7、×SSC(37)洗兩次，每次10min；8）切片放人染色缸的1×PBS內(nèi)待檢測(cè)，勿使切片干燥。檢測(cè)：9）從1×PBS中取出切片，除去過多的水分，避免標(biāo)本干燥。把切片放入濕盒內(nèi)，同時(shí)處理4張切片。10）每張切片使用30l60l羅丹明抗-地高辛抗體或FITC卵白素，室溫下孵育20min；11）去掉塑料蓋膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室溫下洗3次，每次2min。擴(kuò)增：12）從1×PBS中取出切片，斜置切片使液體排出；13）每張切片滴30l60l抗-卵白素抗體，加塑料蓋膜，室溫孵育20min；14）去掉塑料蓋膜，把切片放人含1

8、×PBS的染色缸。1×PBS室溫下洗3次，每次2min；15）從1×PBS中取出切片，斜置切片使液體排出；16）每張切片滴30l60l抗-卵白素抗體，加塑料蓋膜，室溫孵育20min；17）1×PBS室溫下洗3次，每次2min。5、細(xì)胞核染色：1）張切片加10l20l DAPI，覆蓋蓋玻片并在室溫下孵育25ml；2）盡可能快的在熒光顯微鏡下觀察或封閉盒內(nèi)保存在-20冰箱。切片在染色之后1h內(nèi)可以在顯微鏡下觀察。地高辛標(biāo)記寡核苷酸探針 1組織處理（1）冷凍切片：厚1020m，貼于事先經(jīng)清潔處理及涂有粘附劑的切片上。切片保存于-80，在應(yīng)用于雜交實(shí)驗(yàn)前，使迅速

9、回升到室溫，干燥，固定于3%多聚甲醛-PBS溶液中，pH7.4。PBS漂洗5min×3，孵育在2×SSc 10min。（2）石蠟包埋切片：浸入二甲苯10min移除石蠟，以100%乙醇10min ×2，空氣干燥10min，從高到低梯度乙醇（95%，80%，70%）1min/每個(gè)濃度。PBs 5min×3，孵育在2×SSc 10min。（3）離心細(xì)胞涂片：將細(xì)胞先以4%多聚甲醛固定，應(yīng)用離心沉淀法，將沉淀物涂于有粘附劑的載片上，應(yīng)用PBS（含5mmol/l MgCl2）5min×3漂洗。在0.1mol/L三乙醇胺含0.25%(V/V)乙酸

10、酐10min。在0.2mol/l Tris HCl 含（0.1mol/L甘氨酸）pH7.410min。孵育在2×SSc 10min。2探針準(zhǔn)備35pmol的寡核苷酸（oligo -）探針，3 終末標(biāo)記以地高辛-11dUTP。3預(yù)雜交和雜交加約300l預(yù)雜交液（配制法見附錄）在每張載片上，室溫孵育1h。如為鯡魚精子DNA，在應(yīng)用前須在沸水浴中加熱10min，而對(duì)酵母tRNA可不用加熱變性。（1）應(yīng)用預(yù)雜交液稀釋地高辛標(biāo)記的Oligo-探針，探針理想工作濃度根據(jù)于待測(cè)核苷酸含量和實(shí)踐的結(jié)果。如對(duì)于檢測(cè)大鼠垂體的前促黑激素（proopiomelanocortin,POMC）mRNA的Oli

11、go 探針，其理想工作濃度為342ng/ml(0.342ng/l)。（2）預(yù)雜交后以2×SSC漂洗，以吸水紙拭干切片周圍水份，加30l雜交液在切片上，加硅化蓋玻片，在37過夜。如探針大于36堿基則雜交溫度為42。次日室溫2×SSC液漂洗切片1h，1×SSC漂洗切片1h（室溫），0.5×SSc 37洗半小時(shí)，0.5×SSC室溫漂洗半小時(shí)。4地高辛顯示。地高辛標(biāo)記cRNA探針 1組織前處理在組織制片中以冷凍切片（厚1030m）最佳。切片貼在預(yù)先清潔，高溫處理并涂以粘附劑載玻片上，先在37預(yù)干燥4h，然后置于37烤箱中過夜。經(jīng)過上述處理的切片如在-2

12、0可保存23周，在-70可保存數(shù)月之久，有報(bào)告可保存數(shù)年之久的。但仍以新鮮制片為好。如為石蠟包埋切片，應(yīng)脫蠟經(jīng)梯度酒精入水。一般不提倡浸入二甲苯溶液。但在細(xì)胞內(nèi)mRNA含量高時(shí)應(yīng)用二甲苯脫蠟后仍能顯示。經(jīng)水洗后入37烤箱4h或過夜，然后進(jìn)行雜交前處理。在烘烤及低溫保存時(shí)，為防塵埃及空氣中RNA酶的污染，宜用錫箔紙（foilpaper）包被，內(nèi)加少許干燥劑（變色硅膠）。下列步驟所需玻璃器皿均需消毒，操作者需戴手套。（1）PBS洗2×3min。（2）選擇少數(shù)幾張切片作為“RNA酶對(duì)照片”。其它切片暫放于PBs 內(nèi)。RNA酶對(duì)照片處理方法：加RNA酶（100g/ml）在預(yù)熱37的溶液內(nèi)。放

13、在潮濕的盛有少許2×SSC塑料盒或蒸發(fā)皿內(nèi)。在每張切片上覆以過量的RNA酶溶液，在37孵育30min后用2×SSC沖洗，2×3min，然后與其它保存在PBS的切片一起進(jìn)行下列處理。（3）蛋白酶K消化：將組織切片放在0.1mol/l Tris/50mmo/L EDTA pH8.0，內(nèi)含蛋白酶K1g/ml，孵育1520min。消化時(shí)間應(yīng)根據(jù)組織的種類，厚度反復(fù)試驗(yàn)調(diào)整。時(shí)間過短探針不易進(jìn)入，過長(zhǎng)影響細(xì)胞或組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。（4）0.1mol/L甘氨酸/PBs 5min終止蛋白激酶K反應(yīng)。0.25%乙酸酐（0.1mol/l 三乙醇胺配制）10min。（5）在4%多聚甲醛/

14、PBS3min。（6）以PBs 漂洗2×3min。（7）浸入新鮮配制的0.25%乙酸酐（0.1mol/L三乙醇胺配制）10min，以封閉非特異性結(jié)合部位。（8）2×SSC漂洗15min。2雜交以含cRNA探針（0.5ng/ml）的雜交液，按每張切片102l的量覆蓋切片。地高辛配基標(biāo)記的cRNA核酸探針保存濃度為2.5ng/ml，用前稀釋備用。覆以硅化蓋玻片或塑料蠟?zāi)?，置于盛有少?×SSC溫盒內(nèi)在42，1618h或過夜。3顯示（1）用緩沖液1沖洗雜交后的載片2×3min。（2）在緩沖液1中10min，室溫以封閉非特異性結(jié)合部位。（3）拭干切片周圍的載片，

15、注意保持切片濕潤(rùn)。加數(shù)滴抗地高辛抗血清（工作濃度1：500，以緩沖液1稀釋），孵育2h，室溫。（4）緩沖液1漂洗3×3min。（5）浸入緩沖液210min室溫。（6）浸入底物中孵育1030min（或更長(zhǎng)時(shí)間，視需要而定），底物內(nèi)含顯色BCIP/NBT，室溫。最好用錫箔紙包裹反應(yīng)盒，使顯色在黑暗中進(jìn)行。定期取出切片在顯微鏡下檢測(cè)反應(yīng)強(qiáng)度。根據(jù)反應(yīng)強(qiáng)度決定延長(zhǎng)或終止反應(yīng)。反應(yīng)顏色為紫藍(lán)色。（7）將切片浸入緩沖液3以終止反應(yīng)。（8）復(fù)染，可用1%伊紅、1%蘇木精、1%亮綠或5%的焦寧（又稱派咯寧丫）（pyronin 丫）1030s。（9）流水洗510min，直至水無色為止。（10）在切片未

16、干前，以PBS/甘油封固切片，如要永久保存，可以用DPX在蓋片四周封固。為去除水份，在封固前可進(jìn)行梯度酒精脫水，透明，DPX封固，但每步時(shí)間僅需幾秒鐘，時(shí)間過長(zhǎng)易致褪色。原位雜交實(shí)驗(yàn)步驟 1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增1.1制備XL1-Blue感受態(tài)細(xì)菌1 取400uL XL1-Blue菌種加入到含200ml LB培養(yǎng)基的錐形瓶中，37 、100rpm培養(yǎng)4h，離心，倒置，以冰冷的0.1 molL CaCl_2重懸細(xì)菌，冰浴30 min，離心，棄上清，倒置，再加4ml(含15甘油)冰冷的CaCl2重懸細(xì)菌，分裝(200 tube)，-80 保存。2 轉(zhuǎn)化：在冰浴中將1管XL1-Blue感受態(tài)菌解凍，將濃度

17、為2ng1的質(zhì)粒DNA41加入到8O1感受態(tài)菌中。3 輕輕搖勻，冰浴30 min。442 熱激9O秒，然后迅速冰浴2 min。5 加入LB培養(yǎng)液(無氨芐青霉素)0.8ml，在37 ，100轉(zhuǎn)min水浴孵育60 min。6取200l菌液鋪于瓊脂板上(涂有X-Gal(20mgml)-IPTG(200mgml)的 LB-氨芐青霉素50 mgml,1lml培養(yǎng)基)，待菌液全部被吸收后，倒置平板于37 培養(yǎng)12-16h。1.2鑒定和挑選含重組質(zhì)粒的菌落1 用無菌牙簽挑取單菌落，接種到10 ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液的離心管中，于37 ，200轉(zhuǎn)分培養(yǎng)2h，取1 ml之一Eppendorf離心管，加50

18、l10mmolL EDTA(pH 8.0)。2 加入50l新配置的0.2molL NaOH、0.5SDS、20蔗糖溶液后，振蕩3O秒。3 在70 溫育5 min，然后冷卻到室溫。4 加1.514molL KCl和0.51含0.4溴酚蘭染液，振蕩3O秒后，冰浴5min。5 12000g，4 離以 3 min，以除去細(xì)菌碎片。6 制備1的瓊脂糖凝膠(含EB0.5gml)，取50l上清液加入到樣品孔中，其中一孔加入中等分子量DNA Marker。恒壓50V，進(jìn)行電泳。7 當(dāng)溴酚蘭遷移到凝膠全長(zhǎng)的23-34時(shí)，停止電泳，在紫外燈下檢查質(zhì)粒DNA分于量的大小是否與轉(zhuǎn)入質(zhì)粒相符。1.3質(zhì)粒的擴(kuò)增和純化1

19、用無菌牙簽分別挑取單個(gè)白色菌落移入含30ml LB-氨芐青霉素(50gml)培養(yǎng)液的聚丙烯管中，于37 ，200轉(zhuǎn)分培養(yǎng)3h。2 將菌液轉(zhuǎn)入含70 ml LB-氨芐青霉素培養(yǎng)液的250ml錐形瓶中，37 ，200轉(zhuǎn)分培養(yǎng)過夜(12-16h)，細(xì)菌渾濁。3. 菌液中加入氯霉素液(34mg溶于lml乙醇，100ml菌液加入0.5ml氯霉素溶液，終濃度為170 ml)。37 ，200轉(zhuǎn)分培養(yǎng)12-16h。4. 將培養(yǎng)的細(xì)菌倒入50ml的離心管中，6000rpm，4 離,th,15 min，沉淀細(xì)菌。5. 棄凈上清夜，用2ml預(yù)冷的溶液I，懸浮菌體沉淀，劇烈振蕩，于室溫靜置5 min 6. 加入新配制

20、的溶液II 4ml，快速用手晃動(dòng)10秒，顛倒數(shù)次后，于室溫靜置10 min。7. 加入預(yù)冷的溶液III 3ml，溫和振蕩l0秒，于冰上靜置10 min，出現(xiàn)白色絮狀沉淀。8 6000rpm，4 離心15 min，保留上清。9 將上清(若帶細(xì)菌殘片，則再次離心)移入另一50ml的離心管中，加入O.6倍體積的異丙醇混勻，于室溫靜置10 min。(或-20 4h，或4 過夜，可便核酸沉淀)10.12000 rpm，4 離心15 min，回收核酸。小心棄去上清，倒置離心管使殘兼上清液流盡。11于室溫用70的乙醇洗滌沉淀物和管壁，室溫12000 rpm離心，15 min，充分棄去乙醇，于室溫將離心管倒置

21、在紙巾上，使最后殘余的痕量乙醇揮發(fā)殆盡。12用500l TE(pH8.0)溶解核酸沉淀，轉(zhuǎn)移至1.5 ml Eppendorf管中。13加入用冰預(yù)冷的5molL的LiCl溶液600l，充分混勻。12000 rpm，4 離心15 min，以沉淀高分子量的RNA。14.將上清轉(zhuǎn)移到另一1.5 ml Eppendorf管中，加等量異丙醇，充分混勻，于室溫靜置10min。15.12000 rpm,4 離心15 min，回收核酸。小心棄去上清，倒置離心管使殘余上清液流盡。16于室溫用70的乙醇洗滌沉淀物和管壁，室溫12000 rpm離心，15 min，充分棄去乙醇，于室溫將離心管倒置在紙巾上，使最后殘余

22、的痕量乙醇揮發(fā)殆盡。17.400l含無DNA酶的RNA酶(20g/ml)的TE緩沖液(pH8.0)溶解沉淀，將溶液轉(zhuǎn)移到另1.5 ml Eppendorf管中，室溫放置1.5ml Eppendorf管中30min。18加入400l 13(vv)的PEG 8000-NaCl(1.6 molL)，混勻，4 12000rpm離心5 min以回收質(zhì)粒DNA，棄去上清。19加入400l TE緩沖液(pH 8.O)溶解沉淀，再分別用等體積的Tris飽和酚、酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)、和氯仿各抽提一次。20將水相(上清)移入另一1.5ml Eppendorf管中，加入O.1體積(約5013M的醋酸鈉

23、(pH 5.2)和2倍體積(大約1 ml)的無水乙醇，充分混勻后于4放置30 min。21于4 12000 rpm離心5 min回收沉淀的質(zhì)粒DNA。盡可能棄去上清，敞開管口，置工作臺(tái)上使殘留的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。22加入400 l處于4 的70乙醇，稍加振蕩，漂洗沉淀，4 12000 rpm離心2 min。23吸去上清，室溫敞開管口，直到乙醇完全揮發(fā)。24用100l TE緩沖液(pH 8.0)溶解沉淀。25取4l溶液1：100稀釋后，測(cè)定其OD260、OD280，以確定質(zhì)粒DNA的純度和濃度(OD260D280>1.8。OD260OD280對(duì)DNA而言其值大約為1.8，高于2.0則可能有

24、RNA污染，低于1.8則有蛋白質(zhì)污染。；DNA濃度=OD260 X 0.05 X稀釋倍數(shù)(gl)。26質(zhì)粒DNA溶液于-20 保存待用。二、cRNA探針的標(biāo)記1 將質(zhì)粒DNA，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶線性化，通過瓊脂糖凝膠電泳以確保完全線性化。2 線性化后的DNA按“質(zhì)粒的純化”步驟19-24進(jìn)行純化，作為cRNA探針標(biāo)記的模板，用相應(yīng)的RNA聚合酶合成地高辛標(biāo)記的反義和正義RNA探針。3 進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，步驟如下：4 在冰上將各試劑加入一1.5 ml無RNA酶的Eppendorf管中。DEPC處理的三蒸水8l質(zhì)粒DNA模板 0.05gl 1l10 x NTP地高辛標(biāo)記混合物 1 x 2l0.1 M

25、 DTT溶液 10 mM 2l5 x轉(zhuǎn)錄緩沖液 1 x 4lRNAse抑制劑 2Ul 1lRNA聚合酶 2U/l 2l反應(yīng)體系總體積 20l5 加入上述各試劑后，混勻，簡(jiǎn)短離心后在37 孵育2h。6 加入2l無RNA酶的DNA酶I(10U1)，37 孵育15 min降解模板DNA。7 加入0.2M EDTA(pH 8.0)溶液2l終止反應(yīng)。8 加入2.5l的4 M Licl和7.5l冷的無水乙醇，混勻，-20 放置2h。9 12000g下離以 15 min，棄上清，小心地用50 l冷的70乙醇洗滌沉淀。1O室溫下稍干燥，溶于1001 DEPC處理過的三蒸水中，混勻分裝，-20 下保持備用。三、

26、原位雜交3.1冰凍切片與雜交前預(yù)處理1 將子宮樣品從-80 取出，用OCT包埋，在-23 (切片機(jī)腔體溫度)平衡至少30 min。將包埋好的樣品固定在樣品頭上，切10m厚的連續(xù)組織切片，平鋪于涂有多聚賴氨酸(1mgm1)的玻片上(玻片預(yù)先經(jīng)180 干烤6小時(shí))，保存于-70 冰柜備用。2 冰凍切片經(jīng)室溫干燥10 min后，在4的多聚甲醛-PBS(pH 7.4)固定lOmin。3 活躍的DEPC-PBS(未高壓的0.1DEPC-1XPBS溶液)洗2次，每次5 min。4 在0.2M的鹽酸作用中作用10 min后，重復(fù)步驟4)。5 在切片上滴加蛋白酶K(0.1gm1)，37 孵育15 min，重復(fù)步驟4)。6 經(jīng)0.1M TEA(三乙醇胺)作用5min后，