基因重組鼠傷寒沙門氏菌防齲疫苗的研究Ⅰ.變形鏈球菌pac基因上游區(qū)序列測(cè)定和分析 -口

1、基因重組鼠傷寒沙門氏菌防齲疫苗的研究.變形鏈球菌pac基因上游區(qū)序列測(cè)定和分析 -口凌均陳罕 摘要目的:對(duì)變形鏈球菌表面蛋白pac基因上游區(qū)進(jìn)行序列測(cè)定和分析。方法:通過應(yīng)用PCR測(cè)序試劑盒和DNA自動(dòng)測(cè)序儀ABI310對(duì)變形鏈球菌表面蛋白pac基因上游區(qū)進(jìn)行序列測(cè)定。結(jié)果:測(cè)定了pac基因上游區(qū)內(nèi)的517個(gè)堿基序列。結(jié)論:變形鏈球菌表面蛋白pac基因上游區(qū)序列測(cè)定為基因重組鼠傷寒沙門氏菌防齲疫苗的研究提供了基礎(chǔ)資料。 關(guān)鍵詞變形鏈球菌DNA序列測(cè)定pac基因 Recombinant Salmonella typhimurium Anticaries Vaccine .Sequence of

2、Streptococcus mutans Surface Protein pac Genes Upstream Ling Junqi, Chen Han College of Stomatology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences AbstractObjective:To sequence the Streptococcus mutans surface protein pac genes upstream. Methods: The PCR autosequence kit and autosequence instrument ABI

3、310 were used for sequence. Results: The 517 base pairs sequence of the pac genes upstream is sequenced. Conclusion: The sequence of pac genes upstream will provide useful information to construct the recombinant Salmonella typhimurium anticaries vaccine. Key words:Streptococcus mutansDNA sequencepa

4、c gene 齲病是一種細(xì)菌感染性疾病,變形鏈球菌與人類齲病密切相關(guān)。目前認(rèn)為免疫學(xué)預(yù)防措施是控制齲病的手段之一1,并已研究了一系列防齲疫苗,如滅活死疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗、基因工程重組疫苗等。目前存在的問題是,大多數(shù)疫苗由非腸道途徑應(yīng)用并引起血清IgG反應(yīng),而大多數(shù)病源微生物都是通過粘膜屏障而致病。因此,研究替代性接種途徑以誘導(dǎo)保護(hù)性粘膜免疫應(yīng)答是非常必要的2。本研究旨在運(yùn)用分子生物學(xué)和遺傳工程技術(shù),制備帶有變形鏈球菌表面蛋白的抗原結(jié)構(gòu)基因的重組鼠傷寒沙門氏菌防齲疫苗,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物口腔人工自動(dòng)免疫。本文將報(bào)告變形鏈球菌MT8148表面蛋白pac基因的上游區(qū)序列測(cè)定和分析,以進(jìn)一步獲得變

5、形鏈球菌表面蛋白的結(jié)構(gòu)基因資料。 1材料和方法 1.1菌種與培養(yǎng) E.coli MC1061(含質(zhì)粒pPC41,日本福岡大學(xué)Koga教授贈(zèng)送)。取-70保存的菌種劃線于LB-Amp平皿上,37培養(yǎng)過夜。挑取單菌落于5 ml LB-Amp液體培養(yǎng)管中,37搖床培養(yǎng)8 h。取0.5 ml培養(yǎng)物接種于LB-Amp液體培養(yǎng)基中,37搖床培養(yǎng)1216 h(OD660=1.01.5)。4下,3000 r/min離心收集菌體。 1.2Qiagen plasmid kit提取和純化質(zhì)粒pPC41 采用Qiagen plasmid kit(Qiagen公司)試劑盒提取和純化質(zhì)粒。將已收集的菌體重懸于緩沖液 P1

6、(含10 mg/ml Rnase A)。加入緩沖液 P2,輕柔混勻,室溫放置5 min,加入緩沖液 P3,輕柔充分混勻,冰浴20 min,4下,20000 r/min離心15 min,將上清移入一滅菌試管中。將Qiagen Tip 100柱用緩沖液 QBT 4 ml平衡,并依靠重力將緩沖液 QBT排盡。將離心獲得的上清加樣于柱中,依靠重力將上清過柱。加入緩沖液 QC 10 ml洗柱兩次。加入5 ml 緩沖液 QF溶解洗脫柱中吸附的質(zhì)粒DNA。將洗脫液加3.5 ml異丙醇充分混勻,4,15000 r/min離心30 min,去除上清,2 ml 70%乙醇洗滌沉淀,室溫放置至乙醇完全揮發(fā)后,用0.

7、5 ml雙蒸餾水溶解沉淀,-20保存。 1.3核苷酸序列測(cè)定 以M13/pUC測(cè)序通用引物5GTAAAACGACGGCC AGT3(上海生工公司合成),結(jié)合純化質(zhì)粒pPC41為模板,用ABI公司熒光標(biāo)記末端終止物循環(huán)測(cè)序試劑盒,在PE公司6400型PCR儀上進(jìn)行測(cè)序反應(yīng),模板用量約1 mg,引用物6 pmol。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)純化后用ABI公司310 DNA序列分析儀進(jìn)行序列測(cè)定。 2結(jié)果 應(yīng)用Qiagen plasmid kit獲得了適用于測(cè)序的高純度pPC41質(zhì)粒DNA。 應(yīng)用通用引物對(duì)pPC41質(zhì)粒中的插入片段進(jìn)行了測(cè)序,共測(cè)517個(gè)堿基對(duì)(圖1)。 3討論 齲病是一種細(xì)菌感染性疾病。預(yù)防微生

8、物引起的傳染病的一個(gè)重要生理基礎(chǔ)是粘膜免疫系統(tǒng)。分泌型IgA(SIgA)是粘膜免疫應(yīng)答中最重要的因素。SIgA能有效地防止微生物在粘膜表面定居和對(duì)宿主細(xì)胞的侵襲。在腸道,微生物首先與腸道相關(guān)的淋巴組織(GALT)作用,刺激產(chǎn)生IgA的前體B細(xì)胞,這些前體細(xì)胞轉(zhuǎn)移至腸系淋巴結(jié)、胸導(dǎo)管,然后通過體液循環(huán)分布到體內(nèi)各個(gè)分泌組織,包括腸道和呼吸道的固有層,分化為成熟的漿細(xì)胞,分泌抗原特異性SIgA。非腸道途徑使用疫苗不能有效地激發(fā)粘膜SIgA應(yīng)答,所以對(duì)只定居在粘膜表面而不侵襲到深層組織的微生物免疫效果不佳?？诜呙?尤其是減毒的口服活疫苗,因?yàn)槟軘y帶抗原至GALT,已證實(shí)能有效地激發(fā)特異性的SIgA

9、應(yīng)答。 CNA NGC TTG CAT GCN TGC AGT AAC TGC NAC TNG ATA CTA AAA ATT CAA ATC CAC AAG TCA ATG TTG AAA CTN GAC TCA AGT GAA AAA GAC GAA AAT AAA ATG GTC ACC TCG GCT CCA GCT AAG GAG ACT GAG GCA GAA CAA AAT GAG AAA GCG GTA GCA GAA AAT CTT ATG CAA AGA CAA GCT AAG GCT GTC TCA ATT CCA TCG CAA GGC AAT TAT GTT TTC

10、CAA GAA ACA ACT CCT GTA AAA AAT GCA GCC AGT ATG TCC AGC CCA ACC CAA TTT AAC TTT GAT AAA GGA GAT AAG GTT TTT TAT GAT AAG GTT TTA GAA GCG GAT GGG CAT CAA TGG ATT AGC TAT GTG TCT TAC AGT GGT ATT CGT CGC TAT GAT CCT ATT GCT GTG ACA ATT GAA GAA TTG AAG CAA AAA GAA ATT GTT CAG CAA AAT TTA CCG GCA CAA GGA

11、ACC TAT CAC TTT ACT AAA CAA GCA AAC NTT AAA ATG ANC TAA CTG TCT ATT CCA CCA ATC TCG TTT ACA ACG GAA TCC GTT TTT ATA TAG GTT AAA ACC GAT GGC TCA TGA TAC TTT TTC TCC GTG TAC GTC TAN TTT ATG AAC TAC ACC ACC CTC ATN ACA NTT CGT CAT TCT CAA TAA GTC CAT CAT TTC TCA TCC CCN CGG TAA AGT TAT CTT GCA CAN NGN

12、ATT GTC CCA CGA GTA GGC NGT NAA AGT TTC TTT GTN AAA GNA GCC AAT TCA GTT CCA NTG GGC GGG GTT TNA CGG GNN AAN NNT T 圖1pPC41質(zhì)粒中插入片段的堿基對(duì)序列 減毒鼠傷寒沙門氏菌可以作為抗原載體,攜帶異源性抗原決定簇的質(zhì)粒制成疫苗進(jìn)行口服免疫?，F(xiàn)代DNA重組技術(shù)已可能構(gòu)建具有定向缺失特征的菌株,可采用缺失一個(gè)基因或基因群使細(xì)胞喪失它的部分或全部毒性,這種缺失在遺傳學(xué)上一般是穩(wěn)定的。Curtiss等構(gòu)建鼠傷寒沙門氏菌cya、crp缺失突變株,證實(shí)這種突變株通過口服途徑能引起高水平的保護(hù)性

13、免疫反應(yīng)并顯示高度減毒。鼠傷寒沙門氏菌能侵襲與腸道相關(guān)的淋巴組織,并在其中繁殖,從而有效地激發(fā)抗體和全身特異性的SIgA應(yīng)答。利用遺傳工程的技術(shù)可以將親緣較遠(yuǎn)的原核生物或寄生蟲等更高級(jí)生物的抗原基因引入沙門氏菌。Poirier等3將攜帶化膿性鏈球菌M5蛋白基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化鼠傷寒沙門氏菌aroA突變型菌株獲得成功。這種菌株免疫小鼠能引起對(duì)M5蛋白的血清和粘膜抗體反應(yīng)。Sadoff等4將原蟲的小孢子CS蛋白基因引入無毒的沙門氏菌,免疫小鼠5周后,小鼠體內(nèi)產(chǎn)生特異性抗瘧原蟲的細(xì)胞應(yīng)答。Doggett5克隆了遠(yuǎn)緣鏈球菌(S.sobrinus)SpaA抗原0.48 kb的基因片段至鼠傷寒沙門氏菌,免疫BA

14、LB/c鼠后,在小鼠唾液中測(cè)出抗SpaA IgA的效價(jià)。目前的研究提示,沙門氏菌作為疫苗載體的應(yīng)用可能對(duì)細(xì)菌等病源體產(chǎn)生較廣泛的保護(hù)性免疫。本研究將應(yīng)用基因工程技術(shù)獲得變形鏈球菌表面蛋白的結(jié)構(gòu)基因,克隆至減毒鼠傷寒沙門氏菌,構(gòu)建基因重組防齲疫苗。主要致齲細(xì)菌-變形鏈球菌的細(xì)胞表面蛋白具有高度的免疫原性,蛋白抗原PAc的結(jié)構(gòu)基因pac克隆至埃希氏大腸桿菌MC1601(含pPC41),表面質(zhì)粒pPC41由變形鏈球菌MT8148染色體PstI酶切片段通過T4DNA連接酶與經(jīng)PstI、小牛腸堿性磷酸處理的pUC118連接構(gòu)成6。獲得目的基因是進(jìn)行基因克隆,制備基因重組防齲疫苗的第一步。為了解所獲得的p

15、PC41中pac基因的構(gòu)成情況,本研究應(yīng)用M13/pUC測(cè)序通用引物5GTAAAACGACGGCCAGT3,結(jié)合純化后的質(zhì)粒pPC41為模板,采用四標(biāo)記單泳道法,通過DNA自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)pac基因上游區(qū)進(jìn)行序列測(cè)定。DNA序列分析技術(shù)是一個(gè)包括DNA樣品制備及堿基分析、信息處理的多階段過程。本研究所用自動(dòng)測(cè)序儀將凝膠電泳、初始信息收集、堿基閱讀等步驟自動(dòng)化,保證了測(cè)序反應(yīng)可連續(xù)、高速地進(jìn)行。用標(biāo)記單泳道法將4種不同熒光標(biāo)記物分別標(biāo)記4個(gè)反應(yīng)的引物,4個(gè)反應(yīng)分開進(jìn)行,產(chǎn)物合并在一個(gè)泳道中電泳分離。每個(gè)反應(yīng)的產(chǎn)物可由特定的熒光標(biāo)記加以區(qū)分,使DNA的順序由通過檢測(cè)閱熒光條帶的順序確定。Okahash

16、i等6,7分別完成了變形鏈球菌表面蛋白pac基因的克隆和測(cè)序工作。通過pac基因的序列分析,可以促進(jìn)對(duì)表面蛋白的生物學(xué)特征及在齲病病因?qū)W中作用的了解。pPC41包括pac基因及其上游區(qū),對(duì)pac基因上游區(qū)進(jìn)行測(cè)序,有助于全面掌握pac基因的結(jié)構(gòu)。本研究完成了pac基因上游區(qū)全部核苷酸順序測(cè)定,為今后進(jìn)一步進(jìn)行基因重組、pac基因亞克隆提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本課題由廣東省自然科學(xué)基金資助(編號(hào) 970105) 作者單位:510060中山醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 參考文獻(xiàn) 1 Lehner T. Immunology of dental caries. In: Immunology of Oral Dise

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