丹參營養(yǎng)器官中脂溶性成分的動態(tài)變化規(guī)律

1、丹參營養(yǎng)器官中脂溶性成分的動態(tài)變化規(guī)律                         作者：秦海燕，索志榮，劉文哲 【摘要】   目的測定丹參營養(yǎng)器官中丹參酮I和丹參酮A的含量，并揭示丹參生長過程中，丹參酮I和丹參酮A的動態(tài)變化 規(guī)律 。方法采用反相高效液相色譜法，以Zorbax SB - C18（150 mm × 4.6 mm, 5.

2、0 m）為色譜柱；甲醇-0.4%磷酸為流動相，梯度洗脫，流速為1.0 ml/min；二極管陣列檢測器：檢測波長分別為246, 270 nm；柱溫為30。結(jié)果丹參葉和莖中均未檢出丹參酮I和丹參酮A，根中丹參酮A和丹參酮I的含量變化呈“單峰”曲線，丹參酮A的含量在7月份最高，為2.94%，丹參酮I含量在5月份最高，為0.78%。結(jié)論4月至7月是丹參根中丹參酮積累的關(guān)鍵時期。 【關(guān)鍵詞】   丹參； 營養(yǎng)器官； 丹參酮； 高效液相色譜Abstract：ObjectiveTo determine the content of TanshinoneA and tanshinone in dif

3、ferent vegetative organs of Salvia miltiorrhiza Bge and discover the accumulation of TanshinoneA and tanshinone within a whole growth period. MethodsHigh performance liquid chromatography was used. The separation was performed on Zorbax SB - C18（150 mm × 4.6 mm, 5.0 m）column by gradient elution

4、 . The mobile phase consisted of CH3OH - 4% aqueous phosphoric acid. The flow rate was 1.0 ml/min. The detection was done at 246, 270 nm and column temperature was 30 .ResultsThere were no tanshinone in the stem and the leaf. TanshinoneA and tanshinoneroughly assumed "the single peak" in t

5、he root within a growth period.The highest content of tanshinoneA was in July, up to 2.94% and tanshinonewas in May, up to 0.78%.ConclusionApril to July is the critical period of tanshinone accumulation in Danshen root.Key words：Salvia miltiorrhiza Bge;   Vegetative organs;   Tan

6、shinone;   High performance liquid chromatography    丹參（Salvia Miltiorrhiza Bunge）為唇形科（Labiatae）鼠尾草屬多年生草本植物，傳統(tǒng)以根入藥。其活性成分可分為脂溶性的二萜醌類和水溶性的酚酸類成分，鄰醌型的丹參酮、丹參酮A在丹參中的量較高,有較強(qiáng)的生理活性,是丹參主要有效成分之一1，具有擴(kuò)張血管,降低血液黏度,抗血小板聚集,改善微循環(huán),保護(hù)心肌細(xì)胞以及抗菌消炎、抗癌等作用2。目前，關(guān)于丹參藥用成分的藥理、提取工藝、檢測方法的研究較多，但有關(guān)丹參藥用成分在整個營

7、養(yǎng)器官動態(tài)變化的研究很少。本文采用高效液相色譜二極管陣列檢測器（HPLCDAD），研究了丹參脂溶性成分丹參酮I和丹參酮A在根中的積累規(guī)律，旨在為丹參的種植、管理、采收、品質(zhì)鑒定及控制丹參藥材質(zhì)量提供理論依據(jù)。 1 儀器與試藥     HP1100高效液相色譜儀（美國Aglient公司），包括四元梯度泵（G1311A）， 二極管陣列檢測器(G1315A)；DL-180型超聲清洗器(浙江省象山縣石浦天 電子 儀器廠)；FZ102微型植物試樣粉碎機(jī)（河北省黃驊市齊家務(wù)振興電器廠）；Milli - QG超純水制備儀（美國Millipore公司）。  &

8、#160; 甲醇為色譜純，水為超純水，磷酸為分析純。丹參酮I和丹參酮A對照品純度均大于99.5%，購自 中國 藥品生物制品檢定所。    丹參（Salvia Miltiorrhiza Bunge）實(shí)驗(yàn)材料采于西北大學(xué)苗圃內(nèi)的栽培植株（2006年3月自商洛天士力丹參藥材基地移栽）。于2007-04 12期間每月20日以隨機(jī)抽樣的方式選擇丹參植株6株，摘取各樣品株的根、葉片和莖，分別整理，60的恒溫箱內(nèi)烘干至恒重，研細(xì)，過6號篩后備用。 2 方法 2.1 對照品溶液的配制分別精密稱取對照品丹參酮I 1.1 mg和丹參酮A2.2 mg，分別置10 ml量瓶中，用二氯甲烷

9、甲醇（V/V = 1/9）混合溶劑溶解并定容，搖勻，得丹參酮I 濃度為0.11 mg?ml-1和丹參酮A濃度為0.22 mg?ml-1的單一成分對照品溶液，作為儲備液，其它不同濃度的對照品溶液由儲備液稀釋得到。2.2 供試品溶液的制備精密稱量丹參根、莖、葉粉末約120 mg，置25 ml燒瓶中，準(zhǔn)確加入二氯甲烷甲醇（V/V = 1/9）混合溶劑10 ml，稱重，超聲提取30 min，冷卻至室溫，再稱重，用提取液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，取適量用0.45 m微孔濾膜濾過，即得丹參脂溶性成分供試品溶液。2.3 色譜條件美國Zorbax SB - C18（150 mm × 4.6 mm, 5.

10、0 m）色譜柱；流動相為甲醇 0.4%磷酸，梯度洗脫，其時間程序?yàn)?1013 min，甲醇體積分?jǐn)?shù)相應(yīng)為72%87%72%，流速1.0 ml?min-1；二極管陣列檢測器：檢測波長分別為246, 270 nm；柱溫30 。丹參酮I和丹參酮A的保留時間分別為8.1，10.8 min。對照品和丹參樣品色譜圖見圖1。2.4 線性關(guān)系考察精密移取“2.1”項(xiàng)所配的丹參酮I和丹參酮A儲備液一定體積于10 ml量瓶中，稀釋，配成丹參酮I濃度分別為0.44，0.88，1.76，3.52，7.04，14.08 g?ml-1及丹參酮A濃度分別為4.4，8.8，17.6，26.4，35.2，70.4 g?ml-1

11、的混合對照品溶液，將上述混合對照品溶液分別平行測定3次（均進(jìn)樣10.0 l），以平均峰面積Y對濃度C(g?ml-1)進(jìn)行線性回歸，丹參酮I和丹參酮A回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為：Y = 74.61C - 118.86，r= 0.999 4；Y = 55.58C - 94.75，r = 0.999 6。線性范圍分別為0.44 14.08，4.4 70.4 g?ml-1。2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取丹參（6月根）脂溶性成分供試品溶液10.0 l，重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)行測定，丹參酮I和丹參酮A峰面積積分值的RSD分別為1.7%，1.9%。2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 對丹參（6月根）脂溶性成分供試品溶液在8 h之內(nèi)每

12、隔1 h進(jìn)行考察，結(jié)果丹參酮I和丹參酮A峰面積積分值的RSD分別為2.1%，2.1%（n = 9）。2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱量丹參（6月根）粉末約200 mg共6份，按“2.2”項(xiàng)操作制備脂溶性成分供試品溶液，進(jìn)行測定，丹參酮I和丹參酮A含量的RSD分別為2.3%，2.5%。2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱量丹參（6月根）粉末約60 mg，共6份，每份分別準(zhǔn)確加入丹參酮I對照品儲備液0.3 ml和丹參酮A對照品儲備液1.0 ml，按“2.2”項(xiàng)操作制備脂溶性成分供試品溶液后，進(jìn)行測定。丹參酮I和丹參酮A的平均加樣回收率（n = 6）分別為99.4%，100.1%；RSD分別為2.3%，2.5%

13、。 3 結(jié)果     按優(yōu)化的高效液相色譜法對丹參的葉、莖、根中丹參酮I和丹參酮A的含量進(jìn)行測定，每個樣品重復(fù)測定3次，結(jié)果以平均含量計(jì)，本實(shí)驗(yàn)總脂溶性成分含量為丹參酮I和丹參酮A含量之和。3. 1  脂溶性成分提取條件的選擇 分別考察了回流提取法和超聲提取法，結(jié)果顯示：回流提取法和超聲提取法均可達(dá)到同樣的提取效率，但超聲提取法提取時間明顯縮短，提取操作簡單方便，故本實(shí)驗(yàn)采用超聲提取法。然后，分別考察了不同比例的二氯甲烷 - 甲醇溶劑及不同提取時間兩種成分的提取率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采用二氯甲烷 - 甲醇(19) 作提取溶劑效果最好，超聲提取0.5 h，丹參

14、酮I和丹參酮A的提取率均達(dá)到最大，故本實(shí)驗(yàn)選擇用二氯甲烷甲醇（V/V= 1/9）混合溶劑超聲提取0.5 h。3.2  色譜條件的優(yōu)化先后嘗試了不同比例的甲醇-水-磷酸作為流動相的等度洗脫以及各種梯度洗脫，對色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：隨著流動相中甲醇比例的增加，洗脫能力增強(qiáng)，當(dāng)采用等度洗脫時，在短時間內(nèi)丹參酮I和丹參酮A分離效果不理想，因此采用梯度洗脫方式，經(jīng)試驗(yàn)，本節(jié)優(yōu)化的色譜條件分離效果相對最好。3.3  檢測條件的選擇用DAD對丹參酮I和丹參酮A進(jìn)行190 400 nm全波長掃描，結(jié)果丹參酮I和丹參酮A的最大吸收波長分別為246和270 nm，故本實(shí)驗(yàn)采用雙波長檢測

15、，在246 nm檢測丹參酮I，在270 nm檢測丹參酮A。3.4   丹參葉和莖中脂溶性成分含量經(jīng)檢測，丹參葉和莖中均未檢出丹參酮I和丹參酮A。3.5   丹參根中脂溶性成分含量的季節(jié)變化在一個生長季節(jié)，丹參酮A和丹參酮I的含量變化 規(guī)律 大體呈“單峰”曲線（圖2），丹參酮A的含量始終高于丹參酮I，丹參酮A從4月到7月份含量遞增，7月份增至最高，為2.94%，以后含量遞減，10月份后含量穩(wěn)定在一個稍低的水平。丹參酮在45月份含量增加，5月份增至最高，為0.78%，以后含量逐漸降低。總丹參酮含量在7月份最高，約為10月份后穩(wěn)定期含量的2.47倍。 4

16、60; 討論     孫群等3認(rèn)為4 6月份是丹參第一個營養(yǎng)生長期，根系長度、數(shù)量以及生長量均進(jìn)入快速生長期，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷，丹參在第1個營養(yǎng)生長期除了生物量增加，根中丹參酮含量也迅速增加，并且這是丹參酮含量增加的重要階段。6月份后丹參進(jìn)入生殖生長階段，地上部分光合產(chǎn)物主要向以果實(shí)為中心的生殖器官運(yùn)輸分配,從而抑制了營養(yǎng)器官的生長3。67月份后丹參酮含量逐漸降低可能與代謝產(chǎn)物向生殖器官運(yùn)輸分配有關(guān)。9月上旬種子成熟以后，丹參由生殖生長轉(zhuǎn)入第2個以根系生長為中心的營養(yǎng)生長階段，丹參根系重量增加較快，直徑迅速增粗。李磊等4，5發(fā)現(xiàn)丹參酮類化合物主要集中分布在根莖部的表皮，根直徑大小與丹參酮A含量成負(fù)相關(guān)。 因此，9月份后，隨著根重量、直徑的增加，丹參酮A的含量卻逐漸下降。10 11月份根系生長緩慢，丹參酮A的含量趨于穩(wěn)定。    可見，47月是丹參根中丹參酮積累的關(guān)鍵時期，7月份后是根生物量增加的重要階段，根據(jù)這一特點(diǎn)，應(yīng)合理施肥、管理，以獲得產(chǎn)量高、有效成分含量高的丹參藥材。 【 參考 文獻(xiàn) 】   1趙娜，郭治昕，趙雪，等.丹參的化學(xué)成分與藥理作用J.國外醫(yī)