基因敲除小鼠技術(shù)

1、轉(zhuǎn)基因、基因敲入/敲除動(dòng)物技術(shù)已經(jīng)成為現(xiàn)代生命科學(xué)基礎(chǔ)研究和藥物研發(fā)領(lǐng)域不可或缺的重要技術(shù)，該技術(shù)從上世紀(jì)七八十年代誕生以來，已有近四十年的歷 史，經(jīng)典技術(shù)如DNA原核顯微注射、胚胎干細(xì)胞顯微注射技術(shù)一直以來經(jīng)久不衰，并逐漸從基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)向商業(yè)模式，成為一項(xiàng)高度標(biāo)準(zhǔn)化的新興產(chǎn)業(yè) 一、技術(shù)介紹與研究進(jìn)展轉(zhuǎn) 基因、基因敲入/敲除動(dòng)物技術(shù)已經(jīng)成為現(xiàn)代生命科學(xué)基礎(chǔ)研究和藥物研發(fā)領(lǐng)域不可或缺的重要技術(shù)，該技術(shù)從上世紀(jì)七八十年代誕生以來，至今已有近四十年的歷 史，經(jīng)典技術(shù)如DNA原核顯微注射、胚胎干細(xì)胞顯微注射技術(shù)一直以來經(jīng)久不衰，在小鼠模型構(gòu)建方面日趨完善，并且如同剪切酶和抗體等常規(guī)分子生

2、物學(xué)試劑的 制備技術(shù)一樣，逐漸從基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)向商業(yè)模式，成為一項(xiàng)高度標(biāo)準(zhǔn)化的新興產(chǎn)業(yè)，催生了數(shù)以百計(jì)的創(chuàng)新藥物和數(shù)以千計(jì)的優(yōu)秀文章。盡管如此，傳統(tǒng)技術(shù)仍 然存在一些難以克服的缺陷，如步驟繁瑣、周期漫長(zhǎng)、成功率低、費(fèi)用高昂等，而ZFN和TALEN等新技術(shù)的出現(xiàn)，或有可能將這一局面徹底改變。二、同源重組技術(shù)原理基因敲除鼠技術(shù)是上世紀(jì)80年代中后期基于DNA同源重組的原理發(fā)展起來的，Capecchi和Smithies在1987年根據(jù)同源重組（homologous recombination）的原理，首次實(shí)現(xiàn)了ES的外源基因的定點(diǎn)整合（targeted integration），這一技術(shù)稱為&qu

3、ot;基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用這種ES的顯微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于這一工作，Capecchi和Smithies于2007年與Evans分享了諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。同源重組（homologous recombination）定義：是指發(fā)生在姐妹染色單體（sister chromatin) 之間或同一染色體上含有同源序列的DNA分子之間或分子之內(nèi)的重新組合。在基因敲除小鼠制作過程中，需要針對(duì)目的基因兩端特異性片段設(shè)計(jì)帶有相同片段的重 組載體，將重組載

4、體導(dǎo)入到胚胎干細(xì)胞后外源的重組載體與胚胎干細(xì)胞中相同的片段會(huì)發(fā)生同源重組，如圖1所示：圖1.基因敲除鼠制作同源重組原理示意圖三、 制作流程圖2.基因敲除鼠制作過程示意圖1. Knockout載體設(shè)計(jì)與構(gòu)建根據(jù)研究項(xiàng)目具體情況和要求把目的基因和與細(xì)胞內(nèi)靶基因特異片段同源的DNA 片段都重組到帶有標(biāo)記基因(如neo 基因，TK 基因等)的載體上，成為重組的Knockout載體。2. Knockout ES細(xì)胞篩選Knockout載體測(cè)序驗(yàn)證正確后，將載體線性化，然后電轉(zhuǎn)入ES細(xì)胞，通過載體上的正負(fù)篩選基因獲得陽(yáng)性的Knockout ES克隆。選取PCR鑒定打靶載體正確插入的ES基因組DNA用于So

5、uthern Blot鑒定，將Southern Blot鑒定的Knockout ES擴(kuò)大培養(yǎng)并液氮保存。3. Knockout ES細(xì)胞囊胚注射得到嵌合體小鼠擴(kuò)增經(jīng)鑒定插入或置換片段位置正確的Knockout ES細(xì)胞，以囊胚顯微注射的方式將一定數(shù)量的Knockout ES細(xì)胞注入特定品系小鼠囊胚中，然后將囊胚移植到假孕的小鼠子宮中。待后代小鼠出生后，通過小鼠的毛色中來源于ES細(xì)胞毛色的比例判斷嵌合程度的高低，以及該小鼠的后代中可能獲得生殖系傳遞能力。4. 由嵌合體小鼠繁殖出生殖遺傳系Knockout 小鼠將嵌合體小鼠與適當(dāng)品系的小鼠交配，后代小鼠出生后，通過PCR方式檢測(cè)小鼠是否含有打靶序列

6、。如有，則該小鼠為具備生殖遺傳能力的Knockout小鼠(F1代鼠)。5. Knockout小鼠生殖系傳遞鑒定將嵌合體小鼠和適當(dāng)品系野生型小鼠交配，通過后代小鼠毛色或PCR基因型鑒定的方法驗(yàn)證嵌合體小鼠生殖系傳遞能力。四、 基因敲除常見方法一、常規(guī)基因敲除鼠（Conventional Knockout）常規(guī)基因敲除是通過基因打靶，把需要敲除的基因的幾個(gè)重要的外顯子或者功能區(qū)域用Neo Cassette 替換掉。這樣的小鼠其全身所有的組織和細(xì)胞中都不表達(dá)該基因產(chǎn)物。此類基因敲除鼠一般用于研究某個(gè)基因在對(duì)小鼠全身生理病理的影響，而且這個(gè)基因沒有胚胎致死性。二、條件性基因敲除小鼠（Condition

7、al Knockout）條件性基因敲除小鼠是通過基因打靶，把兩個(gè)loxP位點(diǎn)放到目的基因一個(gè)或幾個(gè)重要的外顯子的兩邊。該小鼠和表達(dá)Cre酶小鼠雜交之前，其目的基因表達(dá)完 全正常。當(dāng)和組織特異性表達(dá)Cre酶的小鼠進(jìn)行雜交后，可以在特定的組織或細(xì)胞中敲除該基因，而該基因在其他組織或細(xì)胞表達(dá)正常。條件性基因敲除鼠適用范圍為：（1）該基因有胚胎致死性；（2）用于研究該基因在特定的組織或細(xì)胞中的生理病理功能。三、基因敲入小鼠（Knockin）基因敲入小鼠是通過基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠的相應(yīng)基因位點(diǎn)，使用小鼠的表達(dá)調(diào)控元件指導(dǎo)目的基因表達(dá)。此類基因敲入鼠一般用于藥物的篩選，信號(hào)通路的研究等。獲得

8、嵌合體及之后品系純化詳細(xì)流程：五、 基因敲除其他方法一、ZFN技術(shù)制作基因敲除鼠ZFN能夠識(shí)別并結(jié)合指定的基因序列位點(diǎn)，并高效精確地切斷。隨后細(xì)胞利用天然的DNA修復(fù)過程來實(shí)現(xiàn)DNA的插入、刪除和修改，這樣研究人員就能夠隨心 所欲地進(jìn)行基因組編輯。這在過去是無法想象的，傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)依賴細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生的同源重組，其效率只有百萬(wàn)分之一，而ZFN的基因敲除效率能達(dá)到 10%。利用這些技術(shù)進(jìn)行小鼠基因的定點(diǎn)敲除和敲入，可以把時(shí)間從一年縮短到幾個(gè)月。這項(xiàng)技術(shù)中設(shè)計(jì)特異性的ZFN是最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，目前研究者采用計(jì)算生物學(xué)方法設(shè)計(jì)高特異性的ZFN，但ZFN的脫靶（off target），也就是把不該切的

9、地方切了的問題仍是一個(gè)挑戰(zhàn)。也正因?yàn)檫@個(gè)原因，利用ZFN技術(shù)進(jìn)行小鼠的基因修飾還無法完全取代傳統(tǒng)技術(shù)。二、TALEN技術(shù)制作基因敲除鼠TALEN 技術(shù)是一種嶄新的分子生物學(xué)工具。科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，來自一種植物細(xì)菌的TAL蛋白的核酸結(jié)合域的氨基酸序列與其靶位點(diǎn)的核酸序列有恒定的對(duì)應(yīng)關(guān)系。利用TAL 的序列模塊，可組裝成特異結(jié)合任意DNA序列的模塊化蛋白，從而達(dá)到靶向操作內(nèi)源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能識(shí)別任意目標(biāo)基因序列，以及識(shí)別序 列經(jīng)常受上下游序列影響等問題，而具有ZFN相等或更好的靈活性，使基因操作變得更加簡(jiǎn)單方便。然而同樣因?yàn)槊摪械膯栴}，利用TALEN技術(shù)進(jìn)行小鼠的基 因修飾仍然無法取

10、代傳統(tǒng)技術(shù)。 六、 常見問題與解答1. 什么是ES細(xì)胞顯微注射？答：胚胎干細(xì)胞顯微注射是制作基因敲除小鼠的一個(gè)最常用的方法。主要過程是將攜帶目的基因的胚胎干細(xì)胞注射到小鼠的囊胚腔中獲得嵌合體小鼠。所得嵌合體小 鼠的組織，將同時(shí)含有來源于囊胚的細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞。嵌合體小鼠必須和野生型小鼠配種以決定遺傳改變的生殖系能否傳遞，這樣可能獲得轉(zhuǎn)基因或打靶基因（來 源于胚胎干細(xì)胞）穩(wěn)定的生殖系傳遞的小鼠。一般情況下，大約能獲得50%繼承了目的基因的后代。2. 嵌合體遺傳學(xué)上用以指不同遺傳性狀嵌合或混雜表現(xiàn)的個(gè)體。免疫學(xué)上的涵義則指一個(gè)機(jī)體身上有兩種或兩種以上染色體組成不同的細(xì)胞系同時(shí)存在,彼此能

11、夠耐受,不產(chǎn) 生排斥反應(yīng),相互間處在嵌合狀態(tài)。在基因敲除鼠中指通過向囊胚注射被外源基因轉(zhuǎn)化了的胚胎干細(xì)胞，使得發(fā)育成為的個(gè)體中含有不同基因型的細(xì)胞，產(chǎn)生的個(gè)體 也叫嵌合體，即該生物體中嵌合了兩種不同遺傳結(jié)構(gòu)的細(xì)胞（一種是基因型被改變了的細(xì)胞，另一種是原來的基因型的細(xì)胞）。3. 條件性敲除的原理？答：Cre-LoxP系統(tǒng)是源于P1噬菌體的一個(gè)DNA重組體系,由Cre酶和相應(yīng)的LoxP位點(diǎn)組成,它能導(dǎo)致重組發(fā)生在特定的DNA序列處 (LoxP位點(diǎn)),該系統(tǒng)可以將外源基因定點(diǎn)整合到染色體上或?qū)⑻囟―NA片段刪除?；贑re-LoxP的基因打靶要分兩步來進(jìn)行。首先要在胚胎干細(xì)胞 的基因組中引入LoxP

12、序列，這一步可以通過打靶載體的設(shè)計(jì)和對(duì)同源重組子的篩選來實(shí)現(xiàn)。下一步通過Cre介導(dǎo)的重組來實(shí)現(xiàn)靶基因的遺傳修飾或改變。 Cre-LoxP系統(tǒng)既可以在細(xì)胞水平上用Cre重組酶表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中靶細(xì)胞，通過識(shí)別LoxP位點(diǎn)將抗性標(biāo)記基因切除，又可以在個(gè)體水平上將重組雜合子 小鼠與Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，篩選子代小鼠就可得到刪除外源標(biāo)記基因的條件性敲除小鼠。4. 如何鑒定和挑選嵌合體？答：動(dòng)物只有部分組織細(xì)胞整合有外源基因，則稱為嵌合體動(dòng)物。它的鑒定主要根據(jù)毛色去鑒定。注射的ES和囊胚來源不同的小鼠品系。它們的毛色不同。因此可以根據(jù)毛色的嵌合率來鑒定和挑選嵌合體。5. ROSA26與定點(diǎn)插入？答：利用同源重組技術(shù)，把外面的cDNA片段或者其他DNA片段，定點(diǎn)插入到ROSA26位置。ROSA26是一個(gè)安全區(qū)域，外源性的基因定點(diǎn)插入這個(gè)位點(diǎn)不會(huì)影響其他基因的表達(dá)。七、 行業(yè)領(lǐng)先企業(yè)Taconic Farms,Inc.成立于1952年，是位于紐約哈得孫河谷地區(qū)的一家家族企業(yè)。自成立以來，公司一直是世界上最大的實(shí)驗(yàn)室嚙齒動(dòng)物供應(yīng)商之一，在持續(xù) 生產(chǎn)高品質(zhì)、定義明確的大鼠和小鼠方面擁有良好的口碑。Taconic在轉(zhuǎn)基因小鼠的定制設(shè)計(jì)和生產(chǎn)、小鼠和大鼠育種、屏障系統(tǒng)、基因和動(dòng)物健康方面的專 業(yè)經(jīng)驗(yàn)為利用活體模型開展藥物開發(fā)的研究人員提供支持。Taconic在美國(guó)和歐洲設(shè)有六個(gè)育種工廠和三個(gè)服務(wù)實(shí)