中藥復(fù)方藥效研究新思路

1、中藥復(fù)方藥效研究新思路中藥復(fù)方藥效研究新思路 從銀翹散展開來(lái)說(shuō)從銀翹散展開來(lái)說(shuō)銀翹散源于清代醫(yī)家吳鞠通所著5溫病條辨6卷 一, 是治療風(fēng)溫、溫?zé)嵋约澳承╇s病屬于邪在衛(wèi)分、 上焦, 治當(dāng)辛涼清解者的代表方劑?，F(xiàn)代用于治療 流行性感冒、急性扁桃體炎、咽峽皰疹、麻疹、流行性 腮腺炎等病毒感染性疾病, 為中醫(yī)臨床廣泛應(yīng)用、療效確切的中藥復(fù)方之一。 小組成員: 宋宇翔 靳貴林 席亞麗 牛亭惠 馬小兵 方劑方劑 【方名方名】 銀翹散銀翹散 【別名別名】銀翹解毒散銀翹解毒散 【出處出處】 溫病條辨溫病條辨卷一。卷一。 【分類分類】 解表劑解表劑- -辛涼解表辛涼解表 【組成組成】 連翹一兩（連翹一兩（303

2、0克）克） 銀花一兩（銀花一兩（3030克）克） 苦苦桔梗六錢（桔梗六錢（1818克）克） 薄荷六錢（薄荷六錢（1818克）克） 竹葉四錢（竹葉四錢（1212克）克） 生甘草五錢（生甘草五錢（1515克）克） 荊芥穗四錢（荊芥穗四錢（1212克）克） 淡豆豉五錢淡豆豉五錢（1515克）克） 牛蒡子六錢（牛蒡子六錢（1818克）克） 【用法用法】上杵為散，每服六錢（上杵為散，每服六錢（1818克），鮮葦根湯煎，克），鮮葦根湯煎，香氣大出，即取服，勿過(guò)煮。肺藥取輕清，過(guò)煮則味厚而香氣大出，即取服，勿過(guò)煮。肺藥取輕清，過(guò)煮則味厚而人中焦矣。病重者，約二時(shí)一服，日三服，夜一服；輕者人中焦矣。病重者，約

3、二時(shí)一服，日三服，夜一服；輕者三時(shí)一服，日二服，夜一服三時(shí)一服，日二服，夜一服- -病不解者，作再服。（現(xiàn)代病不解者，作再服。（現(xiàn)代用法：加入蘆根適量，水煎服，用量按原方比例酌情增用法：加入蘆根適量，水煎服，用量按原方比例酌情增減。）減。） 【方歌方歌】 銀翹散治上焦疴，竹葉荊蒡豉薄荷；甘桔銀翹散治上焦疴，竹葉荊蒡豉薄荷；甘桔蘆根涼解法，辛涼平劑用時(shí)多。蘆根涼解法，辛涼平劑用時(shí)多。 【功用功用】 辛涼透表，清熱解毒。辛涼透表，清熱解毒。 銀翹散的現(xiàn)代研究銀翹散的現(xiàn)代研究 材料與方法材料與方法 儀器：美國(guó)儀器：美國(guó)WatersWaters高效液相色譜儀高效液相色譜儀(515(515泵泵, , 2

4、4872487檢測(cè)器）檢測(cè)器）,Millennium32,Millennium32色譜工作站色譜工作站 ););美國(guó)美國(guó)PEPE液相色譜液相色譜/ /質(zhì)譜聯(lián)用儀質(zhì)譜聯(lián)用儀(PE Serials (PE Serials 200200型液相色譜儀型液相色譜儀,PE SciexAPI3000,PE SciexAPI3000型串連型串連三級(jí)四極桿質(zhì)譜儀三級(jí)四極桿質(zhì)譜儀 );TU-1800);TU-1800型紫外分光型紫外分光光度計(jì)光度計(jì)( (北京普析通用儀器有限責(zé)任公北京普析通用儀器有限責(zé)任公司司 ) ) 。 銀翹散抗流感病毒有效部位銀翹散抗流感病毒有效部位(EFY)(EFY)自制自制; ;乙乙腈為色

5、譜純腈為色譜純, ,水為重蒸水水為重蒸水, ,其他試劑均為分其他試劑均為分析純。內(nèi)標(biāo)物香草醛為分析純析純。內(nèi)標(biāo)物香草醛為分析純( (含量含量99.19% ); 99.19% ); 對(duì)照品綠原酸、甘草苷、甘草對(duì)照品綠原酸、甘草苷、甘草素素-4c-O-4c-O-芹糖芹糖(12)(12)葡糖苷、異甘草素葡糖苷、異甘草素-4-4-O-O-芹糖芹糖(12)(12)葡糖苷、異甘草素葡糖苷、異甘草素-2c-O-2c-O-芹芹糖糖(12)(12)葡糖苷、連翹酯苷、蘆丁、葡糖苷、連翹酯苷、蘆丁、4, 5-4, 5-二咖啡?；鼘幩?、二咖啡酰基奎寧酸、3 3、5-5-二咖啡?；鼘幎Х弱；鼘幩?、酸、3, 4-

6、3, 4-二咖啡?；鼘幩?、牛蒡子苷、二咖啡酰基奎寧酸、牛蒡子苷、醉魚草苷、染料木素及異甘草素由銀翹散醉魚草苷、染料木素及異甘草素由銀翹散抗流感病毒有效部位中分得?？沽鞲胁《居行Р课恢蟹值?。 色譜條件色譜條件 色譜柱色譜柱:YWG-C18(250mm-416 :YWG-C18(250mm-416 mmID,10mL);mmID,10mL);流動(dòng)相流動(dòng)相: :乙腈乙腈-3%-3%醋酸水溶液醋酸水溶液梯度梯度 洗脫洗脫(0-5min,(0-5min,乙腈比例乙腈比例:5%10%;5-:5%10%;5-25min,25min,乙腈比例乙腈比例:10%;25-55min,:10%;25-55min,乙

7、腈比乙腈比例例:10%30%;55-95min,:10%30%;55-95min,乙腈比例乙腈比例: : 30%80%;95-100min,30%80%;95-100min,乙腈比例乙腈比例:80% );:80% );流速流速:110mL/min;:110mL/min;柱溫柱溫:25e;:25e;檢測(cè)波檢測(cè)波長(zhǎng)長(zhǎng):280nm;:280nm;進(jìn)樣量進(jìn)樣量:10LL:10LL，理論塔板數(shù)以，理論塔板數(shù)以內(nèi)標(biāo)峰內(nèi)標(biāo)峰(S)(S)計(jì)算計(jì)算, ,不低于不低于50005000。 質(zhì)譜條件質(zhì)譜條件 離子源離子源: ESI;: ESI;所有實(shí)驗(yàn)均在負(fù)所有實(shí)驗(yàn)均在負(fù)離子掃描方式下進(jìn)行。在離子掃描方式下進(jìn)行。在L

8、C-MSLC-MS條件下條件下, ,第一級(jí)四極桿處于全掃描模式第一級(jí)四極桿處于全掃描模式, ,掃描范圍掃描范圍m/z10010-80010,m/z10010-80010,而第三級(jí)四極桿處于而第三級(jí)四極桿處于RF-ONLYRF-ONLY模式。在進(jìn)行模式。在進(jìn)行LC-MS/MSLC-MS/MS實(shí)驗(yàn)時(shí)實(shí)驗(yàn)時(shí), , 質(zhì)譜儀可在子離子掃描、多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜儀可在子離子掃描、多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)和母離子掃描方式下工作。供試品溶液和母離子掃描方式下工作。供試品溶液的制備精密稱取內(nèi)標(biāo)物的制備精密稱取內(nèi)標(biāo)物( (香草醛香草醛)1115mg, )1115mg, 以以50%50%乙腈水溶液溶解乙腈水溶液溶解, ,置于置于5

9、0mL50mL量瓶量瓶, ,再再以以50%50%乙腈水溶液稀釋至刻度乙腈水溶液稀釋至刻度, ,經(jīng)經(jīng)0.145Lm0.145Lm濾膜濾過(guò)濾膜濾過(guò), ,備用。備用。 精密稱取精密稱取EFY6416mgEFY6416mg并以適量并以適量50%50%乙腈水乙腈水溶液超聲使之溶解溶液超聲使之溶解, ,完全轉(zhuǎn)移至完全轉(zhuǎn)移至10mL10mL量瓶量瓶, , 以以50%50%乙腈水溶液稀釋至刻度乙腈水溶液稀釋至刻度, ,經(jīng)經(jīng)0.145mL0.145mL濾膜濾過(guò)濾膜濾過(guò), ,備用。精密吸取備用。精密吸取EFYEFY溶液溶液8mL, 8mL, 內(nèi)標(biāo)物溶液內(nèi)標(biāo)物溶液2mL,2mL,混合均勻混合均勻, ,即得供試品溶即

10、得供試品溶液。金銀花、連翹、牛蒡子、桔梗、薄液。金銀花、連翹、牛蒡子、桔梗、薄荷、淡竹葉、甘草、荊芥及淡豆豉均按荷、淡竹葉、甘草、荊芥及淡豆豉均按銀翹散有效部位制備工藝方法銀翹散有效部位制備工藝方法, , 制備相制備相應(yīng)的藥材供試溶液。陰性溶液的制備依應(yīng)的藥材供試溶液。陰性溶液的制備依據(jù)各單味藥在銀翹散組方中的配比據(jù)各單味藥在銀翹散組方中的配比, , 除除去某單味藥而制成相應(yīng)的陰性溶液。去某單味藥而制成相應(yīng)的陰性溶液。 特征指紋圖譜建立特征指紋圖譜建立 考察考察150minEFY150minEFY的色的色譜分離情況譜分離情況, ,記錄記錄100min100min色譜圖色譜圖, ,以色譜以色譜圖

11、中峰圖中峰S(S(香草醛香草醛) )為內(nèi)標(biāo)為內(nèi)標(biāo), ,令其保留時(shí)間令其保留時(shí)間為為1,1,以峰以峰19(19(牛蒡子苷牛蒡子苷) )為參照為參照, ,令其峰面令其峰面積為積為1,1,其他各峰的保留時(shí)間和峰面積分其他各峰的保留時(shí)間和峰面積分別與內(nèi)標(biāo)峰的保留時(shí)間和參照峰的峰面別與內(nèi)標(biāo)峰的保留時(shí)間和參照峰的峰面積相比較積相比較, ,作為各峰的相對(duì)保留時(shí)間和相作為各峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。組分歸屬分析及主要色譜峰對(duì)峰面積。組分歸屬分析及主要色譜峰的指認(rèn)依據(jù)各單味藥在特征指紋圖譜中的指認(rèn)依據(jù)各單味藥在特征指紋圖譜中色譜保留時(shí)間信息及其陰性樣品的考察色譜保留時(shí)間信息及其陰性樣品的考察, ,從而實(shí)現(xiàn)在

12、相同的實(shí)驗(yàn)條件下所得的色從而實(shí)現(xiàn)在相同的實(shí)驗(yàn)條件下所得的色譜指紋圖譜中單味藥與復(fù)方目標(biāo)物質(zhì)的譜指紋圖譜中單味藥與復(fù)方目標(biāo)物質(zhì)的相對(duì)歸屬分析。相對(duì)歸屬分析。 通過(guò)通過(guò)LC-MS/MSLC-MS/MS對(duì)主要色譜峰碎片離對(duì)主要色譜峰碎片離子的解析及添加對(duì)照品子的解析及添加對(duì)照品 綠原酸、甘綠原酸、甘草苷、甘草素草苷、甘草素-4c-O-4c-O-芹糖芹糖(12)(12)葡葡糖苷、異甘草素糖苷、異甘草素-4-O-4-O-芹糖芹糖(12)(12)葡葡糖苷、異甘草素糖苷、異甘草素-2c-O-2c-O-芹糖芹糖(12)(12)葡糖苷、連翹酯苷、蘆丁、葡糖苷、連翹酯苷、蘆丁、4,5-4,5-二二咖啡?；鼘幩?、

13、咖啡?；鼘幩帷?,5-3,5-二咖啡酰基二咖啡?；鼘幩帷⒖鼘幩?、3,4-3,4-二咖啡酰基奎寧酸、二咖啡?；鼘幩?、牛蒡子苷、醉魚草苷、染料木素、牛蒡子苷、醉魚草苷、染料木素、異甘草素的考察異甘草素的考察, , 實(shí)現(xiàn)對(duì)主要色譜實(shí)現(xiàn)對(duì)主要色譜峰的指認(rèn)峰的指認(rèn)。 討論討論 銀翹散抗流感病毒有效部位所含化學(xué)成分銀翹散抗流感病毒有效部位所含化學(xué)成分相當(dāng)復(fù)雜相當(dāng)復(fù)雜, , 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)黃酮、木脂素、有本實(shí)驗(yàn)根據(jù)黃酮、木脂素、有機(jī)酸三大類主要成分的性質(zhì)機(jī)酸三大類主要成分的性質(zhì), ,反復(fù)優(yōu)化選取反復(fù)優(yōu)化選取最佳色譜條件最佳色譜條件, , 結(jié)果表明結(jié)果表明, ,確定乙腈確定乙腈-3%-3%醋醋酸水溶液作為流

14、動(dòng)相。由于酸水溶液作為流動(dòng)相。由于EFYEFY中化學(xué)成分中化學(xué)成分極為復(fù)雜極為復(fù)雜, ,等度洗脫難以實(shí)現(xiàn)主要成分的分等度洗脫難以實(shí)現(xiàn)主要成分的分離離, ,采用梯度洗脫可以兼顧強(qiáng)極性和弱極性采用梯度洗脫可以兼顧強(qiáng)極性和弱極性成分的分析成分的分析, ,得到的信息量較為豐富得到的信息量較為豐富, ,成分成分峰形尖銳且分離度較好。峰形尖銳且分離度較好。 供試品溶液于供試品溶液于200-400nm200-400nm掃描掃描, ,發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)EFYEFY在在230,280230,280和和320nm320nm處均有較強(qiáng)吸收處均有較強(qiáng)吸收, ,比較比較EFYEFY在上述在上述3 3個(gè)波長(zhǎng)下的個(gè)波長(zhǎng)下的HPLCH

15、PLC圖譜圖譜, , 確定確定280nm280nm為測(cè)定檢測(cè)波長(zhǎng)。本文的色譜方法可在為測(cè)定檢測(cè)波長(zhǎng)。本文的色譜方法可在100min100min內(nèi)展開上述成分內(nèi)展開上述成分, ,并使大部分色譜峰并使大部分色譜峰達(dá)到基線分離達(dá)到基線分離, ,由于流動(dòng)相梯度變化較大由于流動(dòng)相梯度變化較大, , 使得基線有些漂移。在此色譜條件下使得基線有些漂移。在此色譜條件下, ,測(cè)定測(cè)定銀翹散抗流感病毒有效部位的銀翹散抗流感病毒有效部位的HPLCHPLC圖譜圖譜, ,并并與各單味藥樣品色譜圖比較與各單味藥樣品色譜圖比較, ,發(fā)現(xiàn)它們有很發(fā)現(xiàn)它們有很強(qiáng)的相關(guān)性。強(qiáng)的相關(guān)性。LC-MS/MSLC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)的引

16、入聯(lián)用技術(shù)的引入, ,為為中藥復(fù)方復(fù)雜體系的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了中藥復(fù)方復(fù)雜體系的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了有效的手段。有效的手段。 實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn), ,在所建立的特征在所建立的特征HPLCHPLC圖譜中圖譜中4 4號(hào)峰號(hào)峰未得到歸屬未得到歸屬, ,推測(cè)可能為煎煮條件下新產(chǎn)生的化合推測(cè)可能為煎煮條件下新產(chǎn)生的化合物物, ,由于其在負(fù)離子掃描條件下由于其在負(fù)離子掃描條件下, ,色譜峰離子豐度色譜峰離子豐度太小太小, ,未給出分子離子峰及碎片未給出分子離子峰及碎片m/zm/z值值, ,目前尚難以目前尚難以確定來(lái)源確定來(lái)源, , 有待進(jìn)一步研究。在豐度較大的色譜有待進(jìn)一步研究。在豐度較大的色譜峰離子中發(fā)現(xiàn)峰離子中發(fā)現(xiàn)4 4個(gè)來(lái)源于甘草的分子離子峰及碎片個(gè)來(lái)源于甘草的分子離子峰及碎片峰完全一致的成分峰完全一致的成分, ,應(yīng)為異構(gòu)體應(yīng)為異構(gòu)體, ,對(duì)于未確認(rèn)的對(duì)于未確認(rèn)的1111號(hào)峰號(hào)峰,m/z549,m/z549為基峰為基峰,m/z255,m/z255為次強(qiáng)峰為次強(qiáng)峰,m/z