生化實(shí)驗(yàn)基本操作

1、實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)一 生化實(shí)驗(yàn)基本操作生化實(shí)驗(yàn)基本操作 臨床生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室生物化學(xué)基本技術(shù)及應(yīng)用生物化學(xué)基本技術(shù)及應(yīng)用o 一、實(shí)驗(yàn)常識(shí)一、實(shí)驗(yàn)常識(shí)o （一）、實(shí)驗(yàn)室規(guī)則及安全及防護(hù)知識(shí)（一）、實(shí)驗(yàn)室規(guī)則及安全及防護(hù)知識(shí)o 1自覺地遵守課堂紀(jì)律，維護(hù)課堂秩序，保持室內(nèi)安靜。必須穿白大褂，不能穿背心、拖鞋進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室。o 2要認(rèn)真、嚴(yán)肅、積極、主動(dòng)地做實(shí)驗(yàn)，要聽從教師的指導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)過程中要認(rèn)真做好觀察、記錄。完成實(shí)驗(yàn)后經(jīng)教師檢查同意，方可離開。實(shí)驗(yàn)完成后要及時(shí)的按要求完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告。o 3注意保持實(shí)驗(yàn)室的整潔。實(shí)驗(yàn)完畢，須將藥品試劑排列整齊，儀器要放好，將實(shí)驗(yàn)臺(tái)面抹拭干凈。使用后的玻璃儀器要清洗干凈

2、放好。o 4要愛護(hù)實(shí)驗(yàn)儀器，節(jié)約使用各種試劑、物品。使用儀器時(shí)，應(yīng)小心仔細(xì)，防止損壞儀器。使用貴重精密儀器時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，發(fā)現(xiàn)故障立即報(bào)告教師，不要自己動(dòng)手檢修。儀器損壞時(shí)，應(yīng)如實(shí)向教師報(bào)告。o 5廢棄液體(強(qiáng)酸強(qiáng)堿溶液必須先用水稀釋)可倒入水槽內(nèi)，同時(shí)放水沖走。廢紙及其他固體廢物和帶有渣滓沉淀的廢液都應(yīng)倒入指定的垃圾筐內(nèi)，不得倒入水槽或到處亂扔。o 6對(duì)實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容和安排不合理的地方可提出改進(jìn)意見。對(duì)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的一切反?，F(xiàn)象應(yīng)進(jìn)行討論，并大膽提出自己的看法，做到生動(dòng)、活潑、主動(dòng)地學(xué)習(xí)。o 7使用電器設(shè)備(如恒溫水浴、離心機(jī)、電爐等)時(shí)，嚴(yán)防觸電；絕不可用濕手或在眼睛旁視時(shí)開關(guān)電閘和電器

3、開關(guān)。檢查電器設(shè)備是否漏電應(yīng)用試電筆或手背觸及儀器表面。凡是漏電的儀器一律不能使用。o 8可燃物，特別是易燃物(如乙醚、丙酮、乙醇、苯等)時(shí)，應(yīng)特別小心。不要大量放在桌上，更不應(yīng)放在近火焰處。低沸點(diǎn)的有機(jī)溶劑不準(zhǔn)在火焰上直接加熱，只能在水浴上利用回流冷凝管加熱或蒸餾。o 9使用濃酸、濃堿，必須極為小心地操作，防止濺失。用吸量管取這些試劑時(shí)，必須使用橡皮球，絕對(duì)不能用口吸。若不慎濺在實(shí)驗(yàn)臺(tái)或地面，必須及時(shí)用濕抹布擦洗干凈。如果觸及皮膚，應(yīng)立即治療。o 10如果不慎傾出了相當(dāng)量的易燃液體，則應(yīng)按下法處理：(1)立即關(guān)閉室內(nèi)所有的火源和電加熱器。(2)關(guān)門，開啟小窗及窗戶。(3)用毛巾或抹布擦拭灑出

4、的液體，并將液體擰到大的容器中，然后再倒入帶塞的玻璃瓶。o 11實(shí)驗(yàn)中一旦發(fā)生火災(zāi)切不可驚慌失措，應(yīng)保持鎮(zhèn)靜。首先立即切斷室內(nèi)一切火源和電源。然后根據(jù)具體情況積極正確地進(jìn)行搶救和滅火。 （二）、實(shí)驗(yàn)記錄及實(shí)驗(yàn)報(bào)告（二）、實(shí)驗(yàn)記錄及實(shí)驗(yàn)報(bào)告o 1實(shí)驗(yàn)記錄o 實(shí)驗(yàn)中觀察到的現(xiàn)象、結(jié)果和數(shù)據(jù)，應(yīng)及時(shí)地直接記在記錄本上。原始記錄必須準(zhǔn)確、簡(jiǎn)練、詳盡、清楚。記錄時(shí)，應(yīng)做到如實(shí)正確記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，不可夾雜主觀因素。在定量實(shí)驗(yàn)中觀測(cè)的數(shù)據(jù)，如稱量物的質(zhì)量、滴定管的讀數(shù)、光度計(jì)的讀數(shù)等，都應(yīng)設(shè)計(jì)表格準(zhǔn)確記下讀數(shù)，并根據(jù)儀器的精確度準(zhǔn)確記錄有效數(shù)字。o 實(shí)驗(yàn)中使用儀器的類型、編號(hào)及試劑的規(guī)格、化學(xué)式、分子量、準(zhǔn)確

5、的濃度等，也應(yīng)如實(shí)記錄，以便在總結(jié)實(shí)驗(yàn)時(shí)進(jìn)行核對(duì)和作為查找成敗原因的參考依據(jù)。o 如果發(fā)現(xiàn)記錄的結(jié)果有可疑、遺漏、丟失等，都必須重做實(shí)驗(yàn)。因?yàn)?，將不可靠的結(jié)果當(dāng)做正確的記錄，在實(shí)際工作中可能造成難以估計(jì)的損失。所以，在學(xué)習(xí)期間就應(yīng)一絲不茍，努力培養(yǎng)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)作風(fēng)。2實(shí)驗(yàn)報(bào)告o 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)及時(shí)整理和總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，寫出實(shí)驗(yàn)報(bào)告。下面列舉實(shí)驗(yàn)報(bào)告的書寫格式，僅供參考。o 實(shí)驗(yàn)報(bào)告書寫要求：實(shí)驗(yàn)名稱、實(shí)驗(yàn)日期、目的和要求、原理、實(shí)驗(yàn)測(cè)定的數(shù)據(jù)、圖紙及結(jié)果、結(jié)果分析和討論。o 原理：實(shí)驗(yàn)原理簡(jiǎn)要?dú)w納，一些可用化學(xué)反應(yīng)式表示。o 數(shù)據(jù)、圖紙及結(jié)果：將一定實(shí)驗(yàn)條件下獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、歸納、分

6、析和對(duì)比，并盡量總結(jié)成各種圖表，如原始數(shù)據(jù)及其處理的表格、標(biāo)準(zhǔn)曲線圖以及實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較圖表等。o 結(jié)果分析和討論：討論部分不是對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重述，而是關(guān)于實(shí)驗(yàn)方法(或操作技術(shù))和有關(guān)實(shí)驗(yàn)的一些問題，如對(duì)實(shí)驗(yàn)的正常結(jié)果和異?，F(xiàn)象以及思考題進(jìn)行探討；對(duì)于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的認(rèn)識(shí)、體會(huì)和建議；對(duì)實(shí)驗(yàn)課的改進(jìn)意見等。o 1新購置玻璃儀器的清洗 新購買的玻璃儀器表面常附著有游離的堿性物質(zhì)，可先用肥皂水(或去污粉)洗刷，再用自來水洗凈，然后浸泡在l2鹽酸溶液中過夜(不少于4h)，再用自來水沖洗，最后用蒸餾水沖洗23次，在烘箱內(nèi) 。o 2使用過的玻璃儀器的清洗o (1)一般玻璃儀器：如試管、燒杯、錐形瓶等

7、、，先用自來水沖洗至無污物，再選用大小合適的毛刷沾取去洗衣粉或肥皂水，將器皿內(nèi)外(特別是內(nèi)壁)細(xì)心刷洗，再用自來水沖洗干凈，洗至容器內(nèi)壁光潔不掛水珠為止，最后用蒸餾水沖洗23次，倒置在清潔處晾干，急用時(shí)可用干燥箱烤干。o (2)容量?jī)x器：如吸量管、滴定管、量瓶等，使用后應(yīng)立即浸泡于涼水中，勿使物質(zhì)干涸。工作完畢后用流水沖洗，以除去附著的試劑、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，晾干后浸泡在鉻酸洗液中46 h(或過夜)，再用自來水反復(fù)沖洗干凈，最后用蒸餾水沖洗23次，晾干備用。o (3)其他：盛裝具有傳染性樣品的容器，如病毒、傳染病患者的血清等沾污過的容器，應(yīng)先進(jìn)行高壓(或其他方法)消毒后再進(jìn)行清洗。盛過各種毒品，特

8、別是劇毒藥品和放射性同位素物質(zhì)的容器，必須經(jīng)過專門處理(略)，確知沒有殘余毒物存在方可進(jìn)行清洗。四、實(shí)驗(yàn)室基本操作和常識(shí)四、實(shí)驗(yàn)室基本操作和常識(shí)o （一）玻璃儀器的清洗o 玻璃儀器是生物化學(xué)中不可缺少的器具。實(shí)驗(yàn)中所使用的玻璃儀器清潔與否，直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，往往由于儀器的不清潔或被污染而造成較大的實(shí)驗(yàn)誤差，甚至?xí)霈F(xiàn)相反的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，玻璃儀器的洗滌清潔工作是非常重要的。（二）吸量管的使用o 吸量管（簡(jiǎn)稱吸管）是生化實(shí)驗(yàn)中最常用的儀器，可分為三類：奧氏吸管，移液管，刻度吸管。o 刻度吸管的使用：o （1）選擇：使用前先根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)奈抗?，刻度吸管的總量最好等于或稍大于最大取液量。臨用前

9、要看清容量和刻度。o （2）執(zhí)管：用右手拇指和中指（輔以無名指），拿住吸管的上部，用食指堵住管上口和控制液流，刻度數(shù)字要對(duì)向自己。切忌用大拇指堵住管口，控制流量。o （3）取液：另一左手捏壓吸耳球，將吸管插入所量取的試劑溶液中，用吸耳球下端出口對(duì)準(zhǔn)吸管的上口，將液體輕輕吸上至所需取量刻度上端稍高處，立即用右手食指堵住管口。o （4）調(diào)準(zhǔn)刻度：將吸管從溶液中取出，吸管輕輕刮于試劑瓶口，如液體粘性大，可用濾紙擦干管尖外壁，然后用食指控制流量，使液體緩慢下降至所需刻度（注意液體凹面與視線和刻度應(yīng)在同一平面，此時(shí)立即壓緊吸管上口，使液體不再流出）。o （5）放液：放松食指，讓液體自然流入試管內(nèi)，管尖不

10、要插入試管下部原有的溶液中，以免污染吸管和試劑，當(dāng)液體流出完后，讓吸管尖端?？咳萜鲀?nèi)壁3-5秒鐘?？潭任抗芪醋⒚鞔档牟荒艽党鰵堃骸 （6）洗滌：用過的吸管要另放好，不能跟干凈的吸管同放，混淆不清，待做完實(shí)驗(yàn)后要清洗。(三)溶液的混勻o 樣品與試劑的混勻是保證化學(xué)反應(yīng)充分進(jìn)行地一種有效措施。為使反應(yīng)體系內(nèi)各物質(zhì)迅速地相互接觸，必須借助于外加的機(jī)械作用?；靹驎r(shí)須防止容器內(nèi)液體濺出或被污染。嚴(yán)禁用手指直接堵塞試管口或錐形瓶口振搖?；靹虻氖址ㄓ幸韵聨追N，可隨使用的器皿和液體容量而選擇。o 1玻棒攪動(dòng)法 適用于燒杯內(nèi)容物的混勻，如固體試劑的溶解和混勻。o 2吸量管混勻法 用吸管將溶液反復(fù)吸放數(shù)次，使

11、溶液充分混勻。o 3倒轉(zhuǎn)混勻法 適用于有塞量筒和容量瓶、試管內(nèi)容物的混勻。一般試管內(nèi)容物的混勻可用聚乙烯等薄膜封口，再用手按住管口倒轉(zhuǎn)混勻。o 4指彈混勻法 左手持試管上端多用右手指輕輕彈動(dòng)試管下部，使管內(nèi)溶液作旋渦運(yùn)動(dòng)。o 5旋轉(zhuǎn)混勻法 用手持容器，使溶液作離心旋轉(zhuǎn)，適用于未盛滿液體的試管或小口器皿，如錐形瓶。旋轉(zhuǎn)試管時(shí)最好用手腕旋轉(zhuǎn)。o 6甩動(dòng)棍勻法 右手持試管上部輕輕甩動(dòng)振搖，即可混勻。o 7電磁攪拌混勻法 在電磁攪拌機(jī)上放置燒杯夢(mèng)在燒杯內(nèi)放入封閉于玻璃或塑料管中的小鐵棒，利用磁力使小鐵棒旋轉(zhuǎn)以達(dá)到混勻杯中液體的目的。適用于酸堿自動(dòng)滴定，pH梯度滴定等。o 8振蕩器混勻法 利用振蕩器使容

12、器中的內(nèi)容物振蕩，達(dá)到混勻的目的。二、基本技術(shù)及應(yīng)用二、基本技術(shù)及應(yīng)用o （一）分（一）分 光光 光光 度度 法法 技技 術(shù)術(shù)o 物質(zhì)對(duì)光線有選擇性的吸收作用。不同物質(zhì)由于其分子結(jié)構(gòu)不同，對(duì)不同波長光線的吸收能力也不同。因此，每種物質(zhì)都具有其特異吸收光譜。根據(jù)物質(zhì)的吸收光譜進(jìn)行定性或定量分析的方法稱為吸收光譜法，或分光光度法。該法所用的儀器稱為分光光度計(jì)或吸收光譜儀。 o 分光光度法具有操作簡(jiǎn)便，快速等特點(diǎn)，它是生物化學(xué)分析的重要手段之一，也是其他學(xué)科進(jìn)行分析研究的重要手段之一，對(duì)醫(yī)學(xué)生來說是一項(xiàng)重要的操作技術(shù)。o 原理原理 分光光度法作為定量分析的基本依據(jù)是Lambert-Beer定律，他們

13、根據(jù)一系列的實(shí)驗(yàn)證明：當(dāng)一束單色光通過溶液介質(zhì)時(shí)，部分光能被溶液吸收。吸收的比值（透射光/入射光）和入射光的強(qiáng)度無關(guān)，但與介質(zhì)的厚度及介質(zhì)的濃度成正比。A=KCL o 當(dāng)溶液厚度(L)不變時(shí)，對(duì)于不同濃度的同一物質(zhì)和同樣波長的單色光（即消光系數(shù)不變)，溶液的吸光度和溶液的濃度成正比： o A1/A2=C1/C2 C1=A1C2/A2 o 式中C2為標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，可根據(jù)測(cè)得的吸光度值，按公式（3）求得待測(cè)溶液的濃度(C1)。o 實(shí)際工作中為簡(jiǎn)便起見，常常事先測(cè)定一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)管，然后以吸光度對(duì)標(biāo)準(zhǔn)濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得待測(cè)物質(zhì)的吸光度后，可(從)標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出。 可見光分光光度計(jì)可見

14、光分光光度計(jì)o 722型分光光度計(jì)的使用：型分光光度計(jì)的使用：o 1接通電源預(yù)熱20分鐘(此時(shí)暗箱蓋應(yīng)打開)。o 2轉(zhuǎn)動(dòng)波長選擇扭，選用所需的波長。o 3固定靈敏度。(一般使用“靈敏度調(diào)節(jié)旋鈕”1檔，如調(diào)不到“T=100”再選用較高檔，中途不再變動(dòng))o 4調(diào)節(jié)“0”點(diǎn)。揭開比色杯暗箱蓋（光門自動(dòng)關(guān)閉），轉(zhuǎn)動(dòng)“0%T旋鈕”，使數(shù)字顯示為0.00處。o 5放置比色杯 將盛有溶液的比色杯放置于比色杯架中。o 6調(diào)節(jié)T=100。將比色杯放入比色杯架，使空白管對(duì)向光路，蓋好比色杯暗箱蓋，轉(zhuǎn)動(dòng)“100%T旋鈕”。調(diào)準(zhǔn)電表指針指向T=100處。o 7測(cè)定，讀數(shù)。拉動(dòng)比色杯座的拉桿，使測(cè)定杯進(jìn)入光路，迅速從電

15、表上讀出吸光度值，記錄。測(cè)定過程中隨時(shí)拉回拉桿到原位，是空白進(jìn)入光路，觀察指針是否在T=100處，如不在及時(shí)調(diào)節(jié)。 o 8關(guān)機(jī)。關(guān)上電源開關(guān)；取出比色杯，檢查比色杯架是否弄濕、弄臟，如比色杯架臟或濕，應(yīng)取出沖洗干凈，擦干后放回原處，然后將暗箱蓋好，清洗比色杯并涼干。注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)： o 1為了防止光電管疲勞，不測(cè)定時(shí)必須將比色槽暗箱蓋打開，使光路切斷，以延長電管使用壽命。o 2拿比色杯時(shí)，手指只能捏住毛玻璃面、不能碰比色杯的透光面，以免沾污。裝溶液時(shí)，液量為比色杯容積的3/4為宜。o 3比色杯外壁的液體用擦鏡紙或細(xì)而軟的吸水紙吸干，再放入比色槽。不能用吸水紙擦比色杯內(nèi)壁。o 4測(cè)定有色溶液

16、時(shí)，一定要用少量的原液（有色溶液）洗比色杯內(nèi)壁12次，以免改變有色溶液的濃度。另外，在測(cè)一系列溶液時(shí)，通常是按從稀到濃的順序測(cè)定，以減少測(cè)量誤差。o 5本型儀器A值在0.20.7之間誤差較小，準(zhǔn)確度較高。所以在測(cè)定時(shí)，可根據(jù)溶液的濃度選用不同厚度的比色杯）但同一實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用同規(guī)格比色杯，中途不能更換)，使溶液的吸光度控制在0.20.7之間 o 6用完比色杯應(yīng)立即用自來水沖洗，再用蒸餾水洗凈。不能用堿性溶液或氧化性很強(qiáng)的洗滌劑，以免損壞，也不能用毛刷洗，以免損傷透光面。 離離 心心 技技 術(shù)術(shù)o 基本原理基本原理o 離心技術(shù)是利用微粒繞軸旋轉(zhuǎn)時(shí)借慣性的離心運(yùn)動(dòng)，產(chǎn)生的強(qiáng)大離心力，將混合物中密度不同

17、的各組分分離的方法。 o 離心力場(chǎng)的大小常用重力來表示，稱為相對(duì)離心力（RCF）。一般情況下，在低速或高速離心時(shí)常用轉(zhuǎn)速n即每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)（rmin）來表示；超速離心時(shí)常用重力加速度g的倍數(shù)來表示。 o 離心機(jī)分類離心機(jī)分類o （1）按離心管在離心時(shí)所處的位置不同，可分為斜角式離心機(jī)和水平式離心機(jī)o （2）按最大轉(zhuǎn)速不同，可分為普通（低速）離心機(jī)、高速離心機(jī)和超速離心機(jī)。一般將轉(zhuǎn)速在4000r/ min以下的離心機(jī)歸于普通離心機(jī)，轉(zhuǎn)速在600025000r/min的離心機(jī)歸于高速速離心機(jī)；轉(zhuǎn)速在25000r / min以上的離心機(jī)歸于超速離心機(jī)。o （3）按用途不同，可分為制備用離心機(jī)、分析用離心機(jī)。o （4）按操作溫度不同，可分為無冷凍離心機(jī)和冷凍離心機(jī)，后者附帶有制冷設(shè)備，適于在較高溫度時(shí)易分解或酶解的生物大分子的分離。o 實(shí)驗(yàn)室中最常用的是普通離心機(jī) 普通離心機(jī)使用要點(diǎn)普通離心機(jī)使用要點(diǎn)o 1離心機(jī)為高速旋轉(zhuǎn)設(shè)備，放置必須絕對(duì)平穩(wěn)，否則會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈震動(dòng)甚至移