DC和CIK細(xì)胞與腫瘤免疫治療

1、DC和CIK細(xì)胞在腫瘤免疫治療上應(yīng)用易平勇湖南省腫瘤醫(yī)院 內(nèi)五科一、腫瘤免疫治療的必要性腫瘤治療面臨復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的重大難題，免疫治療與化療、手術(shù)、放療有機(jī)結(jié)合，通過調(diào)動(dòng)機(jī)體自身的抗腫瘤免疫能力，達(dá)到清除體內(nèi)不同部位的微小殘留病灶、防治腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的作用。1腫瘤免疫編輯·2002年Schreiber和Dunn等首次提出該學(xué)說。免疫系統(tǒng)和腫瘤相互作用中，免疫系統(tǒng)發(fā)揮了免疫監(jiān)視和免疫逃逸的雙重作用，腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷清除、平衡和逃逸三個(gè)過程。·免疫逃逸：部分腫瘤在發(fā)展過程中經(jīng)歷了免疫系統(tǒng)的重塑，其免疫表型發(fā)生改變，使弱免疫原性腫瘤細(xì)胞得以逃逸免疫系統(tǒng)知?jiǎng)e和攻擊。腫瘤發(fā)生過程中的免疫編輯

2、過程2. 腫瘤細(xì)胞逃逸免疫攻擊的機(jī)制·低表達(dá)MHC·腫瘤抗原改變，低或弱的免疫原性，·腫瘤細(xì)胞分泌抑制因子誘發(fā)宿主免疫抑制·阻止免疫效應(yīng)細(xì)胞接觸腫瘤細(xì)胞的生理屏障·專職APC功能缺陷，與抗原提呈相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，缺乏共刺激因子或黏附分子·T細(xì)胞對腫瘤特異抗原耐受3. 免疫治療的策略1調(diào)動(dòng)和增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫活性2增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞免疫原性3打破免疫系統(tǒng)對腫瘤的免疫耐受狀態(tài)4. 免疫治療的類型主動(dòng)免疫治療·概念：利用抗原性疫苗對要機(jī)體進(jìn)行免疫接種，誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答或免疫耐受，達(dá)到治療目的。·特點(diǎn)：見效慢，維持時(shí)間長如

3、腫瘤疫苗等。被動(dòng)免疫治療·概念：人為提供現(xiàn)成免疫效應(yīng)物質(zhì)（抗毒素、丙種球蛋白）或免疫效應(yīng)細(xì)胞，直接發(fā)揮免疫效應(yīng)。·這種免疫力是通過被動(dòng)輸入方式獲得。·被動(dòng)免疫后效應(yīng)分子雖可立即發(fā)揮免疫效應(yīng)，但不能產(chǎn)生記憶反應(yīng)，其保護(hù)作用是短暫的。治療性疫苗是近年建立和發(fā)展起來的免疫治療新概念·治療對象難治性的疾?。喝纾耗[瘤、自身免疫病、慢性感染、移植排斥、超敏反應(yīng)等。·作為一種特殊的治療藥物，相對預(yù)防性疫苗，利潤率要高得多，而市場競爭也相對較少。兩者概念和機(jī)理·預(yù)防性疫苗治療性疫苗·可在健康人體中激活特異性免疫應(yīng)答， 產(chǎn)生特異性抗體和細(xì)胞毒

4、T淋巴細(xì)胞（CTL）·獲得對該病原體的免疫預(yù)防能力·但對已發(fā)病的個(gè)體卻不能誘生有效的免疫應(yīng)答作用：打破機(jī)體的免疫耐受，提高機(jī)體的免疫應(yīng)答機(jī)理：可能是通過改善和增強(qiáng)對疫苗靶抗原的攝入、表達(dá)、處理、呈遞和激活免疫應(yīng)答，從根本上重新喚起機(jī)體對靶抗原的免疫應(yīng)答能力。療效：在已患病個(gè)體誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答，消除病原體或異常細(xì)胞，使疾病得以治愈。主要類型治療性疫苗作為一種新興的以治療為目的的疫苗，在設(shè)計(jì)思路、制備手段和應(yīng)用技術(shù)方面均體現(xiàn)多元化、多層面和與現(xiàn)代分子生物學(xué)及細(xì)胞學(xué)技術(shù)密切結(jié)合的特點(diǎn)，其復(fù)雜程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出傳統(tǒng)的預(yù)防性疫苗。·細(xì)胞疫苗：主要有腫瘤細(xì)胞和DC細(xì)胞疫苗。

5、83;蛋白質(zhì)疫苗：抗原蛋白，融合蛋白，合成肽。·載體疫苗：病毒載體，細(xì)菌載體·基因疫苗：DNA疫苗，RNA疫苗，可復(fù)制型DNA疫苗二、DC疫苗·樹突狀細(xì)胞，Dendritic Cells（DC），是目前發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞，在抗腫瘤免疫反應(yīng)中，能將腫瘤抗原遞呈給T細(xì)胞，引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤的免疫應(yīng)答反應(yīng)。·利用DC疫苗，啟動(dòng)機(jī)體的主動(dòng)免疫機(jī)制，激活免疫殺傷細(xì)胞，直接清除體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞，產(chǎn)生長期特異性抗腫瘤免疫記憶細(xì)胞，監(jiān)控和清除新生腫瘤細(xì)胞，預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)。DC特點(diǎn)是抗原提呈能力最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞高水平表達(dá)MHC-I I類分子；表達(dá)參與抗原攝取和

6、轉(zhuǎn)運(yùn)特殊膜受體；有效攝取和處理抗原，遷移至T細(xì)胞區(qū)；活化未致敏T細(xì)胞；抗原提呈效率高。DC來源1、髓源性DC：是指由骨髓和臍血中CD34+造血祖細(xì)胞生成的DC。2、血源性DC：從外周血單個(gè)核細(xì)胞來源，在GM-CSF和I L-4作用下可轉(zhuǎn)變?yōu)镈C。DC的分化1、細(xì)胞因子是調(diào)節(jié)DC成熟過程的重要因素：GM-CSF、TNF-促進(jìn)DC分化；IL-1、IL-6和IL-12輔助DC成熟；DC的成熟也受其自身表達(dá)的黏附分子的影響。2、DC表面標(biāo)志：CD11c+DC屬于血液成熟的DC，CD11cDC為低水平表達(dá)黏附分子的非成熟DC。DC的遷移與成熟DC的成熟過程中，其捕獲和處理抗原的能力逐漸降低，但提呈的能力

7、則明顯增強(qiáng)。成熟后從非淋巴組織遷移到次級淋巴器官，從而激發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答。骨髓DC前體非淋巴組織非成熟DC上皮組織、胃腸道、生殖道和泌尿管道、氣道以及實(shí)質(zhì)臟器的間質(zhì)具有很強(qiáng)的攝取、處理和加工抗原的能力，但提呈抗原能力弱細(xì)胞因子和抗原刺激下DC細(xì)胞成熟并遷移進(jìn)入局部淋巴結(jié)攝取、處理和加工抗原的能力變?nèi)?，但提呈抗原能力逐漸增強(qiáng) 血流 分化 定居DC的分布與分類1、淋巴樣組織中的DC：濾泡DC、并指狀DC和胸腺DC2、非淋巴樣組織DC：郎格漢斯細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞3、循環(huán)的DC濾泡DC ： 淋巴結(jié)淺皮質(zhì)區(qū)淋巴濾泡內(nèi)的重要APC，是參與再次免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞，通過其表面的FcR和C3bR結(jié)合免疫復(fù)合物，使免疫細(xì)

8、胞識別以免疫復(fù)合物形式存在的抗原。并指狀DC ： 分布于淋巴組織胸腺依賴區(qū)和次級淋巴組織中的重要APC。為郎格漢斯細(xì)胞衍生而來。胸腺DC： 位于胸腺皮質(zhì)/髓質(zhì)交界處和髓質(zhì)部分，生命周期很短，僅23周。郎格漢斯細(xì)胞 ： 位于表皮和胃腸上皮細(xì)胞。間質(zhì)性DC： 主要分布在心臟、肝臟、腎臟、肺臟等實(shí)質(zhì)器官間質(zhì)的毛細(xì)血管附近。循環(huán)DC ：主要包括血液DC和淋巴DC。具有較強(qiáng)的攝取抗原能力，能在體外自發(fā)地與T細(xì)胞形成DC-T細(xì)胞蔟，激活未致敏T細(xì)胞，啟動(dòng)初次免疫應(yīng)答。DC生物學(xué)特殊性形態(tài)上呈樹突樣；表達(dá)CDla、高水平MHC-I I類抗原和多種輔助分子，但缺乏CD14和非常特異性酯酶的表達(dá)；胞漿內(nèi)存在特異

9、性Birbeck顆粒狀結(jié)構(gòu)；吞噬功能較低；可有效誘導(dǎo)巢居的靜息已性幼稚T細(xì)胞發(fā)生增生。DC的表面標(biāo)志DC表面表達(dá)某些可特異性結(jié)合病原微生物的受體，以及FcR和IgE分子等。DC生物學(xué)功能1、抗原提呈 利用受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用攝取可溶性抗原；具有強(qiáng)大的液相吞飲功能；通過吞噬作用攝取大顆粒或微生物。2、參與T細(xì)胞發(fā)育、分化和激活、DC作為重要的胸腺間質(zhì)細(xì)胞，對T細(xì)胞在胸腺中的選擇過程起重要作用。DC對外周T細(xì)胞的分化出發(fā)揮重要作用。提供T細(xì)胞激活的協(xié)同刺激信號。3、參與B細(xì)胞發(fā)育、分化及激活促進(jìn)生發(fā)中心對抗原發(fā)生特異性反應(yīng)；與B細(xì)胞膜表面高親和力Ig的表達(dá)和V基因的重排有關(guān)；DC高表達(dá)FcR、CR，

10、使其膜表面可長時(shí)間附著一定量的抗原，通過長時(shí)間刺激記憶B細(xì)胞，使其保持免疫記憶；促進(jìn)靜止的B細(xì)胞表達(dá)B7分子，使其具有抗原提呈功能；通過釋放可溶性因子直接調(diào)節(jié)B細(xì)胞的生長與分化；可增強(qiáng)細(xì)胞因子直接調(diào)節(jié)B細(xì)胞的生長與分化；人外周血DC表達(dá)類似CD40L的分子，參與B細(xì)胞的激活。4、免疫調(diào)節(jié)作用 DC可分泌多種細(xì)胞因子參與免疫功能的調(diào)節(jié)；分泌多種趨化因子，介導(dǎo)其他免疫細(xì)胞的趨化作用。5、免疫監(jiān)視功能 某些前體DC對局部各種化學(xué)信號十分敏感，在體內(nèi)發(fā)揮免疫監(jiān)視作用。DC參與抗腫瘤的分子機(jī)制1、DC高表達(dá)MHC、I、I I類分子，提呈大量腫瘤抗原肽，使相應(yīng)T細(xì)胞的TCR被充分占據(jù)，同時(shí)DC提供高水平的

11、B7-1、B7-2、CD40共刺激因子，使T細(xì)胞充分激活。2、DC與T細(xì)胞結(jié)合后，分泌大量IL-12，主導(dǎo)了TH1應(yīng)答，利于腫瘤的清除。3、DC還可分泌趨化因子，專一性趨化初始型T細(xì)胞，促進(jìn)T細(xì)胞富集，增強(qiáng)對T細(xì)胞激活。DC疫苗的種類治療程序申請?zhí)钪橥鈺中g(shù)留取標(biāo)本免疫動(dòng)員分血制備DC回輸體內(nèi)DC表型檢測（一）、DC工藝流程-31天 胃癌患者rhIL-2，20萬U肌注，1次/日0天 PBMC采集與分離 2×106/ml，無血清培基，2h，375%CO2保留貼壁細(xì)胞，添加rhIL-4及GM-CSF，各1000U/ml3天 半量換液6天 換液+TNF，10ng/ml8天 +自體腫瘤抗

12、原25ug/ml，4h后收獲DC（二）DC終產(chǎn)品的質(zhì)量控制1 細(xì)胞治療用量，5×106/次。2 顯微鏡下觀察DC形態(tài)正常。3 活細(xì)胞大于95%方可回輸。4 純度鑒定：HLA-DR90%。5 生物學(xué)活性鑒定：CD8680%。6 細(xì)菌、真菌及支原體培養(yǎng)陰性。7 熱源檢測陰性。DC的臨床療效CT顯示：一個(gè)轉(zhuǎn)移性髓性甲狀腺癌DC疫苗前（左）和DC疫苗治療后13個(gè)月（右）。顯示肝轉(zhuǎn)移完全消退。（上）肺損害明顯減少（下），箭頭所示疫苗之前的損傷部位。·延長生存期：例如轉(zhuǎn)移性前列腺患者中，接受DC疫苗治療組三年存活病人數(shù)量比未接受組高出22%，（J.clinicaloncology. 2

13、005: 23. 4500）·用DC聯(lián)合化療的急性白血病人五年生存期組為73.4%，單純化療組為40.3%，（中華內(nèi)科雜志，2005：，44（3）；198）。·轉(zhuǎn)移性腎癌：197人（14個(gè)臨床試驗(yàn)總結(jié)），37%臨床反應(yīng)，4-CR，8-PR，61-DS，（EurUrol.2006.jul:50(1):11-3。三、細(xì)胞過繼免疫治療·為了克服患者體內(nèi)各種免疫耐受因素，取病人少量單個(gè)核細(xì)胞，在體外待定條件下制備出大量具有殺傷腫瘤作用的免疫活性細(xì)胞，回輸體內(nèi)后直接發(fā)揮有效清除腫瘤的作用。適用于各種腫瘤患者。·人體內(nèi)T淋巴細(xì)胞包括許多針對不同抗原的特異性細(xì)胞，經(jīng)過

14、體外擴(kuò)增培養(yǎng)，能產(chǎn)生對不同的腫瘤抗原具有廣泛識別和殺傷效果的細(xì)胞。LAK細(xì)胞：1985年Rosenberge首次報(bào)道LAK（lymphokine activated killer）和IL-2聯(lián)合靜注治療25例常規(guī)療法治療無效的晚期腫瘤病人，11例治療有效腫瘤明顯縮小，其中一例黑色素瘤完全緩解。腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞（T I L）：其殺傷效率高于LAK，臨床取得同樣療效，代價(jià)昂貴。這表明免疫療法在腫瘤的治療中可以獲得療效是不容否認(rèn)的，并且與常規(guī)療法有互補(bǔ)性。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine inducied killer,CIK）：1991年美國Stanford大學(xué)醫(yī)學(xué)院骨髓移植研究中，Sc

15、hmidt Wolf等報(bào)道了具有高增殖能力和高細(xì)胞毒性的細(xì)胞因子激活的殺傷(CIK)細(xì)胞，經(jīng)不斷完善，目前在腫瘤患者骨髓凈化、自血病的治療中肯定療效，·對部分實(shí)體瘤患者的臨床試驗(yàn)也得到今人鼓舞的效果。CIK·外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外經(jīng)IFN-、IL-la、IL-2和抗CD3單抗等刺激、擴(kuò)增培養(yǎng)產(chǎn)生的殺傷細(xì)胞。·是一類非主要組織相容性復(fù)合物（MHC）和非T細(xì)胞受體（TCR）限制性的免疫活性細(xì)胞，其主要效應(yīng)細(xì)胞的表面標(biāo)志CD3+CD8+和CD3+CD56+，主要功能成分，NKT細(xì)、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞。體外增殖能力和體內(nèi)清除腫瘤的作用比LAK強(qiáng)。CIK制備一、

16、儀器及材料：Cobe Spectra Apheresis System采用機(jī)（Cobe BCT）及一次性血液分離裝置用管道，一次性靜脈穿刺針，滅菌生理鹽水，淋巴細(xì)胞分離液，IL-2、IL-la、anti-CD3McAb,ALM-V無血清培基，Baxter培養(yǎng)袋，慶大霉素，細(xì)菌、真菌培養(yǎng)瓶等。CIK制備采集周圍血50ml或血液分離機(jī)分離5×1081×109PBMG0DFicoll分離，回收PBMC細(xì)胞接種數(shù)2×106ml，IFN-r1000u/ml1DIL-2，IL-1a、anti-CD3McAb各1000U/ml擴(kuò)增培養(yǎng)，IL-2濃度1000U/ml2D流氏細(xì)胞儀

17、鑒定細(xì)胞表型CD-3-8，測定56，微生物檢測質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)1 細(xì)胞總數(shù)：回輸細(xì)胞8×109。2 細(xì)胞形態(tài)分類：回輸細(xì)胞良好，淋巴細(xì)胞90%。3 活細(xì)胞比例：應(yīng)95%。4 免疫熒光染色：CD3 +85%，CD8+60%，顯示活化良好。5 回輸前細(xì)菌、真菌、支原體培養(yǎng)應(yīng)陰性。CIK細(xì)胞治療作用1、直接殺傷，CIK細(xì)胞通過粘附因子LAF/ICAM-1途徑與腫瘤細(xì)胞相互結(jié)合后，大量釋放具有細(xì)胞毒性的胞漿顆粒到胞外，這些顆粒直接破壞瘤細(xì)胞。2、分泌多種細(xì)胞因子IFNr、TNFa、IL2和 IL-6，直接抑制腫瘤細(xì)胞生長，并通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞對CIK的敏感性和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)間接殺傷瘤細(xì)胞。3、CIK細(xì)胞

18、表達(dá)Fasl，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，同時(shí)CIK細(xì)胞有抗凋亡基因表達(dá)，因此在體內(nèi)能抵抗Fasl，陽性腫瘤細(xì)胞對CIK的反作用，故CIK能對腫瘤細(xì)胞持久的發(fā)揮溶瘤作用。CIK細(xì)胞在體內(nèi)的有效期·大多數(shù)執(zhí)行殺傷功能的細(xì)胞在回輸后立即執(zhí)行其功能，半衰期約2周至一個(gè)月。回輸?shù)募?xì)胞中包括一部分記憶細(xì)胞，可存活幾年至幾十年，當(dāng)遇到相應(yīng)刺激后，迅速在體內(nèi)活化，殺傷靶細(xì)胞。CIK細(xì)胞的臨床應(yīng)用1 清除殘存腫瘤細(xì)胞，預(yù)防腫瘤復(fù)了轉(zhuǎn)移手術(shù)后無腫瘤負(fù)荷的病人。2 控制腫瘤生長，改善生活質(zhì)量體內(nèi)有無法進(jìn)行手術(shù)治療的腫瘤放化療間期配合放化療進(jìn)行內(nèi)科病人，不能進(jìn)行其它治療，腫瘤負(fù)荷較大惡性胸腹水中直接注射。配合放化

19、療治療方案·每次化療藥物使用結(jié)束后7-10天回輸（淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)最低時(shí)）·回輸后2周才能進(jìn)行下一次化療·全部化療療程結(jié)束后7天起，每周一次回輸，至少6次適應(yīng)癥·白血病、肝癌、腦腫瘤、肺癌、結(jié)直腸癌、淋巴瘤等多種腫瘤。·理論上講，由于抗腫瘤免疫可識別各種類型腫瘤的抗原，幾乎所有惡性腫瘤均可成為CIK細(xì)胞治療的對象。禁忌癥T細(xì)胞淋巴瘤骨髓瘤器官移植后，長期使用免疫抑制藥物的病人正在使用免疫抑制藥物的自身免疫病病人回輸前病人的狀態(tài)·心肺肝腎功能正常·血象基本正常，無感染（或感染已被控制）·病人回輸后兩周內(nèi)不進(jìn)行化療或全身性

20、放療·病人沒有進(jìn)行免疫抑制藥物治療回輸日期的確定·采用至回輸，一般需要14天的細(xì)胞激活、培養(yǎng)、擴(kuò)增時(shí)間。但由于個(gè)體差異，不同病人淋巴細(xì)胞對培養(yǎng)體系的反應(yīng)程度不同，有時(shí)可能會(huì)延長培養(yǎng)時(shí)間至20天?？赡軙?huì)出現(xiàn)的副作用·回輸?shù)腃IK是患者自身的淋巴細(xì)胞，因此沒有免疫排斥反應(yīng)。·淋巴細(xì)胞的一般在體內(nèi)處于不活化的休眠狀態(tài)。本療法將淋巴細(xì)胞在體外刺激活化后回輸。病人有時(shí)發(fā)熱37-38度。這是短時(shí)間自限性癥狀?？刹惶幚砘蚴褂媒鉄釀ΠY處理。·有病人會(huì)發(fā)生輸液反應(yīng)。療效觀察1、清除殘余腫瘤細(xì)胞，無病生存期延長2、腫瘤病灶縮小、腫大淋巴結(jié)恢復(fù)正常3、瘤標(biāo)志物下降

21、、胸腹水減少或消失4、病情穩(wěn)定，病人生命延長 5、臨床獲益，病人生活質(zhì)量改善原發(fā)性肝癌臨床治療試驗(yàn)復(fù)發(fā)類型免疫治療組（n=76）對照組(n=74)相關(guān)危險(xiǎn)性(95%Cl)P*全面復(fù)發(fā)45（59%）57（77%）0.59(0.40-0.38)0.01平期復(fù)發(fā)25（33%）40（54%）0.49(0.30-0.80)0.005局部復(fù)發(fā)2（3%）5（7%）0.31(0.06-1.62)0.17大量復(fù)發(fā)11（14%）19%（26%）0.44(0.21-0.93)0.03遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移4（5%）6（8%）0.49(0.14-1.75)0.27多中心腫瘤3（4%）7（9%）0.37(0.09-1.45)0.15

22、免疫治療可提高患者無復(fù)發(fā)存活率CIK細(xì)胞對多種中晚期惡性腫瘤臨床療效·256患者，-期患者占17.6%，-期患者占82.4%，·男119，女137，年齡1983，4060 64.45%。病程最短7天，最長3年。·乳腺癌67例，肺癌56，腸癌37，胃癌28，淋巴瘤20腎癌、惡性黑色素瘤、食官癌、肝癌、腦瘤、卵巢癌等48例。·接受4療程1例，3，17例，2，30例，余者1個(gè)療程。治療后生存期情況時(shí)間（年）隨訪例數(shù)存活例數(shù)生存率（%）109256246962962562389232825622688遼寧醫(yī)學(xué)雜志2003年第17卷第4期治療后腫瘤變化情況總例數(shù)CR PR MR SD PD總緩解率（%）·256 0 10 197 46 3 80.86·臨床癥狀治療前、后有明顯改善，p0.001，·生存質(zhì)量卡氏評分提高率為88.28%；體重多數(shù)有增加。·治療前后T淋巴細(xì)胞rDNA轉(zhuǎn)