季節(jié)性聯(lián)合呼吸道過敏患者血清特異性IgE和粘附分子分析

1、季節(jié)性聯(lián)合呼吸道過敏患者血清特異性IgE和粘附分子分析    作者：張利萍， 王蓮蕓，王懷云 【摘要】 目的 探討季節(jié)性聯(lián)合呼吸道過敏性患者的發(fā)病原因。方法 對52例既患過敏性鼻炎，又患支氣管哮喘患者采用熒光酶聯(lián)免疫法(FEIA)定量檢測血清總IgE和特異性IgE；用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）定量分析血清可溶性細胞間粘附分子-1（sICAM-1）和E-選擇素（sE-Selectin）。結(jié)果 患者組的血清總IgE顯著高于正常對照組；在52例季節(jié)性聯(lián)合呼吸道過敏患者中可檢測到過敏原的特異性IgE的為蒿花粉43例（82.7%）、屋塵螨26例（50%）、屋塵

2、15例（28.8%）、草花粉12例（23%）、粉塵螨3例（5.8%）；試驗組的sICAM-1算術(shù)均數(shù)（378.61 ng/ml）較對照組（213.42 ng/ml）明顯增高（P<0.0001）；試驗組的sE-Selectin（62.61 ng/ml）高于對照組（35.72 ng/ml），P<0.0001。結(jié)論 引起這52例季節(jié)性呼吸道過敏性炎癥的主要因素為蒿花粉，其次是屋塵螨，季節(jié)性聯(lián)合呼吸道過敏性患者高表達的細胞間粘附分子-1和E-選擇素。    【關(guān)鍵詞】 聯(lián)合呼吸道過敏； 過敏性鼻炎； 支氣管哮喘； 血清特異性IgE； 粘附分子

3、0;    【Abstract】 Objective To study pathogenesis of united seasonal airways hyperreactivity.Methods We investigated the relationship between specific IgE and soluble cellular adhesion molecular in 52 patients and 20 health persons. The sera total IgE(tIgE) and specific IgE (sIgE) were

4、 measured by a fluoroenzymeimmunoassay (Uni-CAP Pharmacia， Uppsala， Sweden). The sera soluble intercellular adhesion molecule-1 (sICAM-1) and E-selectin were performed with ELISA.Results There were 43 patients (82.7%) suffered from artemisia pollen， 26 (50%) from house dust mite， 15(28.8%) from hous

5、e dust， 12(23%) from humulus pollen and 3(5.8%) from dermatophagoides farinae in 52 patients. The values of sICAM-1，sE-selectin and tIgE in combined allergic rhinitis and asthma patients were significantly higher than those of control（P<0.0001）.Conclusion The results demonstrate that the expressi

6、on of sera sICAM-1 and sE-selectin in united airways hyperreactivity are higher than that of health persons. The allergens of induced united seasonal inflammation mainly are artemisia pollen， secondly house dust mite.    【Key words】 united airway hyperreactivity；allergic rhinitis

7、；bronchial asthma； IgE；adhesion molecular    季節(jié)性呼吸系統(tǒng)的過敏性疾病包括上呼吸道的季節(jié)性變應(yīng)性鼻炎和下呼吸道的支氣管哮喘。通常情況下對變應(yīng)性鼻炎和支氣管哮喘分別進行研究，但是，在臨床上經(jīng)常會遇到同一個病人既有發(fā)作性打噴嚏、流大量的清水樣鼻涕，又有支氣管哮喘發(fā)作（聯(lián)合呼吸道過敏癥）。那么，這類患者的主要發(fā)病原因是什么？其血清中的總IgE、特異性IgE、血清可溶性細胞間粘附分子-1（sICAM-1）和E-選擇素（sE-Selectin）有何變化？對此本文進行了探討。    

8、;1 資料與方法    52例聯(lián)合呼吸道變態(tài)反應(yīng)患者（男25例、女27例），在每年7、8、9月主要表現(xiàn)為連續(xù)打5個噴嚏、流清水樣鼻涕，鼻塞、咽喉癢、陣發(fā)性咳嗽和呼吸困難、咯大量白色泡沫狀痰，夜間不能平臥，在發(fā)作期體格檢查可見下鼻甲黏膜呈蒼白色或淡粉白色水腫狀，咽部充血，兩肺可聞及哮鳴音，病程最短的2年，最長的20年。另設(shè)正常對照組20例（男10例，女10例），既往無特殊病情記載，體檢未發(fā)現(xiàn)心肺、肝、脾、泌尿和血液等疾病?；颊呓M（試驗組）和對照組的年齡均在1548歲之間。    對試驗組和對照組均空腹采血2ml，常溫

9、下靜置2h，取血清分裝在3支ependorf管中，-70存放，備用。    1.1 血清總IgE（tIgE）和特異性IgE（sIgE）定量測定（熒光酶聯(lián)免疫法） 取患者血清50l，加入到被特異性抗原包被過的經(jīng)預(yù)洗的CAP中，37孵育后，洗去未結(jié)合的血清，加入-半乳糖苷酶標(biāo)記的抗IgE抗體，繼續(xù)孵育后再沖洗，再加入底物4-甲基傘桂-半乳糖苷，以終止液終止反應(yīng)，并測定其吸光值。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出相應(yīng)的特異性IgE的含量（WHO 75/502標(biāo)準(zhǔn)：0.35100 ku/L）。上述過程均在Uni CAP系統(tǒng)-100型(Pharmacia)自動完成，所有試劑均由Ph

10、armacia公司提供。試驗組檢測血清屋塵螨（d1）、粉塵螨（d2）、屋塵（h1）、蒿花粉（w6）、草花粉（w22）的特異性IgE。試驗組和對照組均測血清總IgE。    1.2 血清可溶性粘附分子分析 sICAM-1和E-選擇素采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。    1.2.1 實驗原理 首先將抗sICAM-1和抗sE-Selectin的抗體分別包被在不同的免疫板微孔的壁上，再將稀釋20倍的血清分別加入不同的已包被的免疫板的微孔內(nèi)，形成sICAM-1與抗ICAM-1的結(jié)合物、sE-Selectin與抗E-Se

11、lectin的結(jié)合物；然后，這兩種結(jié)合物分別與辣根過氧化酶標(biāo)記的抗抗體（anti-ICAM-1-HRP、anti-E-Selectin-HRP 酶標(biāo)二抗）結(jié)合，形成sICAM-1anti-sICAM-1anti-ICAM-1-HRP、sE-Selectinanti-E-Selectinanti-E-Selectin-HRP復(fù)合物。最后加入底物（四甲基聯(lián)苯胺），與辣根過氧化酶發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)，在波長450620nm讀光密度值（OD值）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品描記出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算其每一樣品的sICAM-1、sE-Selectin的含量。    1.2.2 實驗步驟

12、 (1)按1：20濃度稀釋待測血清；(2)在免疫板的微孔中分別加入100lanti-ICAM-1-HRP、anti-E-Selectin-HRP；(3)再分別加入100l標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋液、質(zhì)控參數(shù)液；(4)蓋板后室溫下孵育1.5h；(5)用緩沖液洗板6遍；(6)分別加底物100l蓋板后，室溫下再孵化30min；(7)加100l終止液；(8)在酶標(biāo)儀上選定波長為450nm測吸光值，620nm作為校正值；(9)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；(10)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線將每一測試樣品的OD值換算出sICAM-1和sE-Selectin的含量（ng/ml）。    其試劑從英國RD

13、Systems 購買，酶標(biāo)儀為Bio-Rad（美國）產(chǎn)品。    1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS12.0 軟件對兩組資料進行正態(tài)性檢驗、方差齊性檢驗和t檢驗。    2 結(jié)果    2.1 特異性IgE（sIgE）定量測定結(jié)果 在52例季節(jié)性聯(lián)合呼吸道過敏患者中可檢測到過敏原的特異性IgE的為蒿花粉43例（82.7%）、屋塵螨26例（50%）、屋塵15例（28.8%）、草花粉12例（23%）、粉塵螨3例（5.8%），見表1。 表1 52例聯(lián)合呼吸道過敏患者血清特異性IgE定

14、量（ku/L）分析結(jié)果    2.2 血清總IgE測定結(jié)果 試驗組與對照組的血清tIgE（ku/L）的含量呈正偏態(tài)分布。試驗組的血清tIgE幾何均數(shù)（2.61）顯著高于對照組（1.39），P<0.0001。    2.3 血清可溶性粘附分子定量分析結(jié)果 試驗組的血清可溶性細胞間粘附分子-1（sICAM-1）和E-選擇素（sE-Selectin）的含量均呈正態(tài)分布，方差齊性檢驗示方差齊；雙側(cè)t檢驗提示兩組間差異有非常顯著性。試驗組的sICAM-1算術(shù)均數(shù)（378.61 ng/ml）較對照組（213.42 ng/

15、ml）明顯增高（P<0.0001）；試驗組的sE-Selectin（62.61 ng/ml）高于對照組（35.72 ng/ml），P<0.0001，見表2。    表2 血清可溶性粘附分子（ng/ml）比較    注：*P<0.0001    3 討論    變應(yīng)性鼻炎和支氣管哮喘均是由IgE介導(dǎo)型變態(tài)反應(yīng)，本研究采用熒光酶聯(lián)免疫法對52例既有季節(jié)性過敏性鼻炎，又有季節(jié)性哮喘發(fā)作的患者進行血清總IgE定量分析發(fā)現(xiàn)，患者

16、組高于對照組（P<0.0001）。進一步對這52例夏秋季聯(lián)合呼吸道過敏患者進行了5種吸入性變應(yīng)原的血清特異性IgE定量分析發(fā)現(xiàn)，陽性例數(shù)依次為蒿花粉43例（82.7%）、屋塵螨26例（50%）、屋塵15例（28.8%）、草花粉12例（23%）、粉塵螨3例（5.8%）。由此可見，引起這52例季節(jié)性呼吸道過敏性炎癥的主要因素為蒿花粉，其次是屋塵螨。    在我國北方地區(qū)夏秋季節(jié)的主要致敏花粉是蒿花粉，這與筆者過去的研究結(jié)果相一致的1。雖然在不同的國家和地區(qū)花粉過敏的種類不一樣，但是，花粉既可以引起過敏性鼻炎、結(jié)膜炎、咽炎、皮膚風(fēng)團，也可引起下呼吸道過敏

17、性炎癥2。對花粉過敏者建議：在花粉漂散的高峰期應(yīng)關(guān)閉窗戶（例如在傍晚，氣傳花粉從高空沉降到地面附近），外出時可以考慮用口罩，防止吸入花粉，不要親自去剪草。在剪草時要關(guān)閉窗戶，也可使用空調(diào)或花粉過濾器。    屋塵螨既是引起常年過敏的主要因素，也是夏秋加重或直接導(dǎo)致過敏的重要因素，甚至?xí)龠M患者對卵清蛋白的過敏，加重呼吸道的過敏性炎癥3。    在顯微鏡下的塵螨約0.33mm，無視力，有八只腿。它靠吃人體每天脫落下來的皮膚鱗屑生長繁殖，塵螨最具變應(yīng)原的部分是軀干和糞小球。屋塵螨是世界上引起哮喘的最主要的變應(yīng)原4，且發(fā)

18、病率也高。研究發(fā)現(xiàn)：螨引起過敏的主要成分有兩種蛋白，一種是MW 25 kDa，另一種是MW15kDa。Marjiorie等發(fā)現(xiàn)屋塵螨的同源變應(yīng)原具有多樣性。他們從屋塵螨中分離出47種同源變應(yīng)原蛋白，其中22種變應(yīng)原蛋白與16例哮喘患者的血清IgE結(jié)合率在50%以上。并發(fā)現(xiàn)這些蛋白具有交叉反應(yīng)。屋塵螨以人體脫落的皮屑為食物，床上螨及螨的解體物質(zhì)含量極高，人從一出生就躺在床上，對螨的接觸最早，對其過敏的人也最多。因此，對屋塵螨過敏者通過經(jīng)常用5560的熱水清洗床上用品（每12周1次），來達到減少室內(nèi)塵螨過敏原數(shù)量的目的。    炎癥的本質(zhì)就是有白細胞從血管腔

19、出去浸潤到血管外的組織中，對于變態(tài)反應(yīng)性炎癥而言也不例外。與過敏反應(yīng)有關(guān)的白細胞主要是嗜酸粒細胞和嗜堿粒細胞。已有研究證實白細胞從血管的軸流進入邊流，在沿血管內(nèi)皮“滾動”（rolling），最后穿過內(nèi)皮細胞間隙移行到組織中的每一步都需要細胞粘附分子和相應(yīng)配體（ligand）的共同作用5。    ICAM-1屬于粘附分子免疫球蛋白超家族中的成員，是膜糖蛋白，具有90100個氨基酸的環(huán)狀類似物，并有免疫球蛋白樣的輕鏈和重鏈區(qū)的特征，在分子結(jié)構(gòu)上與免疫球蛋白具有很大的同源性。ICAM-1由76114kD氨基酸組成，核心部分的多肽約重55kDa。它由一短的細胞膜

20、區(qū)（巰水跨膜結(jié)構(gòu)）和5個細胞外的免疫球蛋白樣的區(qū)域組成。ICAM-1的基因位于第19號染色體上。ICAM-1的配基是淋巴細胞功能相關(guān)抗原-1（LFA-1）。在正常情況下，ICAM-1在不同的組織中都有表達，但在炎癥組織中ICAM-1的表達更為廣泛。有人給患呼吸道變態(tài)反應(yīng)性疾病的猴子吸入或靜滴抗ICAM-1的單克隆抗體后，發(fā)現(xiàn)其氣管上皮和黏膜下的嗜酸粒細胞減少，受試猴子的氣道高反應(yīng)亦被阻斷，從而揭示ICAM-1在嗜酸粒細胞-內(nèi)皮細胞的相互作用中起著重要作用，在哮喘的發(fā)病中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用6。另外，在變態(tài)反應(yīng)炎癥中，ICAM-1可能在呼吸道病毒性疾病惡化過程中是一個關(guān)鍵性的因子，因為ICAM-

21、1也是鼻病毒的表面受體。    E-選擇素亦稱內(nèi)皮性白細胞粘附分子-1(ELAM-1)，主要在內(nèi)皮細胞受刺激2h之內(nèi)表達，它與白細胞表面的Sialyl-Lewis X糖蛋白粘附。在選擇素間的相互作用后，促進了內(nèi)皮細胞上的ICAM-1和白細胞表面的2整合素的粘附。2整合素與ICAM-1的粘附是白細胞移行的關(guān)鍵，即白細胞經(jīng)過內(nèi)皮細胞，最后出了血管腔外。    ICAM-1和E-選擇素可以從細胞表面脫落下來成為血清中的可溶性粘附分子。本文通過ELISA方法定量分析了患者血清中的可溶性粘附分子ICAM-1和E-選擇素，結(jié)果

22、表明顯著高于對照組。    兒童的變應(yīng)性鼻炎在發(fā)病狀況方面與支氣管哮喘有密切的相關(guān)性7。提示鼻部疾病和哮喘可能具有共同的潛在發(fā)病基礎(chǔ)，即由外源性變應(yīng)原引起黏膜的過敏性炎癥反應(yīng)，可能累及以鼻腔黏膜為代表的上呼吸道黏膜和以支氣管黏膜為代表的下呼吸道黏膜。Lundblad曾提出過敏性鼻炎與支氣管哮喘是同一種病的問題8。世界變態(tài)反應(yīng)組織報道32%的過敏性鼻炎患者可發(fā)展成支氣管哮喘，50%的支氣管哮喘患者伴發(fā)變應(yīng)性鼻炎。由此提示，預(yù)防支氣管哮喘要從治療過敏性鼻炎入手，只有這樣才能降低聯(lián)合呼吸道過敏的發(fā)病。 【參考文獻】    

23、;1 王蓮蕓，張克軍，喬中東，等.花粉癥患者血清可溶性細胞間粘附分子-1檢測.中華耳鼻咽喉科雜志，1999，34（4）：245-246.    2 Boldogh I， Bacsi A， Choudhury BK. ROS generated by pollen NADPH oxidase provide a signal that augments antigen-induced allergic airway inflammation. Clin Invest， 2005，115：2169-2179.    3 Fattouh R， Pouladi MA， Alvarez D，et al. House Dust Mite Facilitates Ovalbumin-specific Allergic Sensitization and Airway Inflammation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine， 2005，172：314-321.    4 Silvestri M， Sp