課題3　分解纖維素的微生物的分離 (2)

1、青海省大通縣第一完全中學青海省大通縣第一完全中學 雷乙個雷乙個閱讀課本閱讀課本27頁基礎知識部分第一、二段，回答下列問題頁基礎知識部分第一、二段，回答下列問題：1、纖維素在生物圈的分布狀況？、纖維素在生物圈的分布狀況？2、纖維素酶的組成及作用？、纖維素酶的組成及作用？纖維素是地球上含量最豐富的多糖類物質。植物的根、纖維素是地球上含量最豐富的多糖類物質。植物的根、莖、葉等器官都含有大量的纖維素。其中莖、葉等器官都含有大量的纖維素。其中棉花棉花是自然界是自然界中纖維素含量最高的天然產物。中纖維素含量最高的天然產物。纖維素酶是一種復合酶，一般認為它至少包括三種纖維素酶是一種復合酶，一般認為它至少包括

2、三種組分，即組分，即CX酶酶、 C1酶酶和和葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。葡萄糖。一、纖維素和纖維素酶一、纖維素和纖維素酶二、纖維素分解菌的篩選二、纖維素分解菌的篩選閱讀課本課本閱讀課本課本28頁相關部分，回答下列問題：頁相關部分，回答下列問題：1、纖維素分解菌的篩選方法、纖維素分解菌的篩選方法2、纖維素分解菌的篩選方法的原理、纖維素分解菌的篩選方法的原理剛果紅染色法剛果紅染色法：這種方法能夠通過顏色反應直接這種方法能夠通過顏色反應直接 對微生物進行篩選對微生物進行篩選 (1)剛果

3、紅可以與纖維素形成紅色復合物，但并不剛果紅可以與纖維素形成紅色復合物，但并不和水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應。和水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應。(2)纖維素分解菌能產生纖維素酶分解纖維素，從纖維素分解菌能產生纖維素酶分解纖維素，從而使菌落周圍形成透明圈。而使菌落周圍形成透明圈。 實驗原理實驗原理 即：可根據是否產生透明圈來篩選纖維素分解菌。即：可根據是否產生透明圈來篩選纖維素分解菌。三、實驗操作三、實驗操作土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上挑選產生透明圈的菌落(1)方案方案土壤取樣土壤取樣選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng)梯度稀釋梯度稀釋將樣品涂布到鑒將樣品涂布到鑒別纖維

4、素分解菌的培養(yǎng)基上別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上挑選產生透明圈的菌落。挑選產生透明圈的菌落。(2)選擇培養(yǎng)的目的：增加纖維素分解菌的濃度，確選擇培養(yǎng)的目的：增加纖維素分解菌的濃度，確保能夠從樣品中分離到所需要的微生物。保能夠從樣品中分離到所需要的微生物。(3)涉及到的微生物技術主要有：培養(yǎng)基的制作、無涉及到的微生物技術主要有：培養(yǎng)基的制作、無菌操作技術、稀釋涂布平板法、選擇培養(yǎng)基的作用、土菌操作技術、稀釋涂布平板法、選擇培養(yǎng)基的作用、土壤取樣等。壤取樣等。 答：本實驗流程與課題答：本實驗流程與課題2的流程的區(qū)別如下。課題的流程的區(qū)別如下。課題2是將土樣成的菌懸是將土樣成的菌懸液直接涂布在以尿素為惟一

5、氮源的選擇性培養(yǎng)基上，直接分離得到菌落。液直接涂布在以尿素為惟一氮源的選擇性培養(yǎng)基上，直接分離得到菌落。本課題通過選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到增殖后，再將菌液涂布在選擇本課題通過選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到增殖后，再將菌液涂布在選擇培養(yǎng)基上。其他步驟基本一致培養(yǎng)基上。其他步驟基本一致.1、本實驗的流程與課題、本實驗的流程與課題2中的實驗流程有哪些異同中的實驗流程有哪些異同？2.為什么要在富含纖維素的環(huán)境中尋找纖維素分解菌？為什么要在富含纖維素的環(huán)境中尋找纖維素分解菌？答：由于生物與環(huán)境的相互依存關系，在富含纖維素的環(huán)境中，纖維素分答：由于生物與環(huán)境的相互依存關系，在富含纖維素的環(huán)境中，纖維素分

6、解菌的含量相對提高，因此從這種土樣中獲得目的微生物的幾率要高于普通解菌的含量相對提高，因此從這種土樣中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。環(huán)境。答：將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對聚集，實際上是人工設置纖維答：將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對聚集，實際上是人工設置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應將紙埋于深約素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應將紙埋于深約10 cm左右腐殖土壤中。左右腐殖土壤中。3.將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認為濾紙應該埋進土壤多深？將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認為濾紙應該埋進土壤多深？土壤取樣取樣的環(huán)境是怎樣的，作出這種選擇的理由是什么取樣的環(huán)境是怎樣的，作出這種選

7、擇的理由是什么？ 選擇纖維素豐富的環(huán)境，如樹林中多年落葉形成的選擇纖維素豐富的環(huán)境，如樹林中多年落葉形成的腐殖土，多年積累的枯枝敗葉等等。腐殖土，多年積累的枯枝敗葉等等。 生物與環(huán)境的互相依存關系，在富含纖維素的環(huán)境生物與環(huán)境的互相依存關系，在富含纖維素的環(huán)境中纖維素分解菌的含量相對提高，因此從這種土壤中獲中纖維素分解菌的含量相對提高，因此從這種土壤中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng)1、選擇培養(yǎng)的目的：、選擇培養(yǎng)的目的：增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠從樣品中分離到所需要的微增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠從樣品中分離到所需要的微生物生物.

8、2、制備選擇培養(yǎng)基、制備選擇培養(yǎng)基參照課本參照課本29頁旁欄中的比例配置，回答下列問題頁旁欄中的比例配置，回答下列問題a、旁欄中的配方是液體培養(yǎng)基還是固體培養(yǎng)基？為什么？、旁欄中的配方是液體培養(yǎng)基還是固體培養(yǎng)基？為什么？b、這個培養(yǎng)基對微生物是否具有選擇作用？如果具、這個培養(yǎng)基對微生物是否具有選擇作用？如果具 有，是如何進行選擇的？有，是如何進行選擇的？ c、你能否設計一個對照實驗，說明選擇培養(yǎng)基的作用、你能否設計一個對照實驗，說明選擇培養(yǎng)基的作用是液體培養(yǎng)基，原因是配方中無凝固劑是液體培養(yǎng)基，原因是配方中無凝固劑有選擇作用，本配方中的碳源是纖維素，所以能分解纖維素的有選擇作用，本配方中的碳源

9、是纖維素，所以能分解纖維素的 微生物可以大量微生物可以大量繁殖繁殖.用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基與之對照用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基與之對照3、操作方法、操作方法：將土樣加入裝有將土樣加入裝有30ml選擇培養(yǎng)基的錐形瓶中，將錐選擇培養(yǎng)基的錐形瓶中，將錐形瓶固定在搖床上，在一定溫度下震蕩培養(yǎng)形瓶固定在搖床上，在一定溫度下震蕩培養(yǎng)12天，天，直至培養(yǎng)液變渾濁。也可重復選擇培養(yǎng)直至培養(yǎng)液變渾濁。也可重復選擇培養(yǎng)思考：為什么選擇培養(yǎng)能夠為什么選擇培養(yǎng)能夠“濃縮濃縮”所需的微生物？所需的微生物？在選擇培養(yǎng)的條件下，可以使那些能夠適應這種營在選擇培養(yǎng)的條件下，可以使那些能夠適應這種營養(yǎng)條件的微生物得到迅速繁殖，而那些不適

10、應這種養(yǎng)條件的微生物得到迅速繁殖，而那些不適應這種營養(yǎng)條件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到營養(yǎng)條件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“濃縮濃縮”的作用的作用.梯度稀釋梯度稀釋 按照課題按照課題1 的稀釋操作方法，將選擇培的稀釋操作方法，將選擇培養(yǎng)后的培養(yǎng)基進行等比稀釋，稀釋最大倍數養(yǎng)后的培養(yǎng)基進行等比稀釋，稀釋最大倍數到到106將樣品涂布到鑒別纖維將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上素分解菌的培養(yǎng)基上1、制備培養(yǎng)基、制備培養(yǎng)基:參照旁欄中的比例參照旁欄中的比例2、涂布平板：將稀釋度為、涂布平板：將稀釋度為104106的菌懸液各的菌懸液各取取0.1ml涂布在培養(yǎng)基上，涂布在培養(yǎng)基上，30倒置

11、培養(yǎng)倒置培養(yǎng)挑選產生透挑選產生透明圈的菌落明圈的菌落 參照課本參照課本剛果紅染色法剛果紅染色法，挑選產生透明，挑選產生透明圈的菌落，一般即為分解纖維素的菌落圈的菌落，一般即為分解纖維素的菌落剛果紅染色法剛果紅染色法方法一：先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進行顏色反應方法二：在倒平板時就加入剛果紅思考：這兩種方法各有哪些優(yōu)點與不足 方法一方法一 缺點是操作煩瑣，加入剛果紅溶液會使菌落之缺點是操作煩瑣，加入剛果紅溶液會使菌落之間發(fā)間發(fā) 生混雜；優(yōu)點是這樣顯示出的顏色反應基本上是纖生混雜；優(yōu)點是這樣顯示出的顏色反應基本上是纖維素分解菌的作用維素分解菌的作用 方法二方法二 優(yōu)點是操作簡便，不存在菌落混雜問題

12、優(yōu)點是操作簡便，不存在菌落混雜問題缺點一是由于培養(yǎng)基中還含有淀粉類物質，可以使能產缺點一是由于培養(yǎng)基中還含有淀粉類物質，可以使能產生淀粉酶的微生物出現假陽性反應；缺點二有些微生物生淀粉酶的微生物出現假陽性反應；缺點二有些微生物具有降解色素的能力，它們在長時間培養(yǎng)過程中會降解具有降解色素的能力，它們在長時間培養(yǎng)過程中會降解剛果紅，形成明顯的透明圈，與纖維素分解菌不易區(qū)分剛果紅，形成明顯的透明圈，與纖維素分解菌不易區(qū)分.染色法染色法優(yōu)點優(yōu)點缺點缺點方法一方法一顏色反應基本顏色反應基本上是纖維素分上是纖維素分解菌的作用解菌的作用操作繁瑣剛果紅會使菌落之操作繁瑣剛果紅會使菌落之間發(fā)生混雜間發(fā)生混雜方法

13、二方法二操作簡便操作簡便不存在菌落混不存在菌落混雜問題雜問題產生淀粉酶的微生物也產生產生淀粉酶的微生物也產生模糊透明圈，有些微生物能模糊透明圈，有些微生物能降解色素，形成明顯的透明圈。降解色素，形成明顯的透明圈。4、想一想，這兩種方法各有哪些優(yōu)點與不足？你打算選想一想，這兩種方法各有哪些優(yōu)點與不足？你打算選用哪一種方法？用哪一種方法？四、結果分析與評價四、結果分析與評價（一）培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否一）培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落篩選出菌落（二）分離的結果是否一致（二）分離的結果是否一致 設置對照，若對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中無菌落生長設置對照，若對照的培養(yǎng)基在

14、培養(yǎng)過程中無菌落生長則說明培養(yǎng)基制作合格。如果觀察到產生透明圈的菌落，則說明培養(yǎng)基制作合格。如果觀察到產生透明圈的菌落，則說明可能獲得了分解纖維素的微生物。則說明可能獲得了分解纖維素的微生物。如果不同，分析產生不同結果的原因。如果不同，分析產生不同結果的原因。 由于在土壤中細菌的數量遠遠高于真菌和放線菌由于在土壤中細菌的數量遠遠高于真菌和放線菌的數量，因此最容易分離得到的是細菌。但由于所取的數量，因此最容易分離得到的是細菌。但由于所取土樣的環(huán)境不同，學生也可能得到真菌和放線菌等不土樣的環(huán)境不同，學生也可能得到真菌和放線菌等不同的分離結果。同的分離結果。五、課題延伸五、課題延伸 本課題對分解纖維

15、素的微生物進行了初步的篩選，本課題對分解纖維素的微生物進行了初步的篩選，但是這只是分離純化的第一步。為確定得到的是纖但是這只是分離純化的第一步。為確定得到的是纖維素分解菌，還需要進行發(fā)酵產纖維素酶的實驗，維素分解菌，還需要進行發(fā)酵產纖維素酶的實驗，纖維素酶的測定方法一般是對纖維素酶分解濾紙等纖維素酶的測定方法一般是對纖維素酶分解濾紙等纖維素后所產生的葡萄糖進行定量的測定。纖維素后所產生的葡萄糖進行定量的測定。3 31 1為了確定分離得到的是纖維素分解菌，還需要進行為了確定分離得到的是纖維素分解菌，還需要進行 發(fā)發(fā)酵產纖維素酶酵產纖維素酶 實驗，纖維素酶的發(fā)酵方法有實驗，纖維素酶的發(fā)酵方法有 液體液體 發(fā)酵和發(fā)酵和 固體固體 發(fā)酵。發(fā)酵。3 32 2纖維素酶測定方法是對纖維素酶分解濾紙等纖維素所產纖