飼糧鋅水平對(duì)肉仔雞組織鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)的影響

1、飼糧鋅水平對(duì)肉仔雞組織鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)的影響黃艷玲1,2,3 羅緒剛1,2* 呂 林1,2 劉 彬1,2(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所礦物元素營養(yǎng)室，北京 100094；2.動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100094；3.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041)摘 要: 本文旨在研究飼糧中不同水平鋅對(duì)肉仔雞組織鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)的影響。選用1日齡AA肉公雞720只，隨機(jī)分為8個(gè)處理組，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，分別飼喂不加鋅的玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧（對(duì)照組）和添加水平為20、40、60、80、100、120 和140 mg·kg-1 （硫酸鋅）的飼糧, 試驗(yàn)期21d，分為1-7

2、日齡，8-14日齡和15-21日齡三階段進(jìn)行。結(jié)果表明：各日齡胰臟鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-2的基因表達(dá)均受到飼糧鋅水平顯著的影響（P< 0.01），7日齡時(shí)隨飼糧鋅添加量的增加呈明顯的漸近線變化趨勢(shì)（P< 0.01），而14日齡與21日齡均呈二次曲線變化趨勢(shì)（P< 0.01）。關(guān)鍵詞：鋅；肉仔雞；鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；基因表達(dá)鋅是生物體必需的微量元素，參與了細(xì)胞內(nèi)許多不同的代謝過程，因此細(xì)胞內(nèi)鋅的穩(wěn)態(tài)平衡非常關(guān)鍵。為了在不同的條件下達(dá)到穩(wěn)態(tài)平衡，細(xì)胞必須對(duì)鋅的攝取率和排出率進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)節(jié)。細(xì)胞內(nèi)鋅的穩(wěn)態(tài)平衡是由包含在鋅攝取、分泌以及細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存/運(yùn)輸過程中的不同蛋白質(zhì)協(xié)同作用來調(diào)節(jié)的。這些蛋白主要包

3、括金屬硫蛋白（MT）以及鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ZnTS）。MT通過細(xì)胞內(nèi)結(jié)合的方式協(xié)助調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)游離鋅的水平，而鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要通過調(diào)節(jié)鋅的跨膜運(yùn)輸對(duì)細(xì)胞內(nèi)鋅的濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)。前人的研究已表明，雞組織MT的含量及其基因表達(dá)與飼糧中鋅含量密切相關(guān)1-4。鼠上的研究也表明，鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白受飼糧鋅的調(diào)節(jié)，且不同成員受鋅影響的程度不同，并存在著一定的組織特異性5-7。Liuzzi等（2001）7同時(shí)研究了飼糧鋅對(duì)大鼠ZnT1、ZnT2以及ZnT4基因表達(dá)的影響，結(jié)果表明ZnT2的基因表達(dá)對(duì)鋅的反應(yīng)最敏感。盡管目前還不知ZnT2 蛋白是否有同樣的變化趨勢(shì)，但已有證據(jù)表明，ZnT2 蛋白與ZnT2 mRNA之間有密切的關(guān)聯(lián)

4、8,9。目前對(duì)鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究還只是處在起步階段，一些成員的分布以及主要生物學(xué)功能還沒有完全闡明，且大多的試驗(yàn)都采用體外方法進(jìn)行，體內(nèi)試驗(yàn)相對(duì)較少。而且，在現(xiàn)有文獻(xiàn)中，所有試驗(yàn)均以嚙齒動(dòng)物為研究對(duì)象，至今沒有見到在雞上的研究，有必要進(jìn)行進(jìn)一步的研究。1 材料與方法1.1試驗(yàn)動(dòng)物與飼糧選用北京華都肉雞集團(tuán)提供的720只商品代1日齡AA肉公雞進(jìn)行試驗(yàn)。參照美國NRC（1994）家禽營養(yǎng)需要量中肉仔雞營養(yǎng)建議量，配制021日齡肉仔雞不含鋅的玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧，基礎(chǔ)飼糧配方見表1。表1 基礎(chǔ)飼糧組成和營養(yǎng)水平Table 1 Composition and nutrient levels of bas

5、al diets 項(xiàng)目 Items 03周 week日糧組成 Composition (%)玉米 Corn55.97豆粕 Soybean meal36.00豆油 Soybean oil3.60磷酸氫鈣 CaHPO4 1.95石粉 Limestone1.16食鹽 NaCl0.30蛋氨酸 DL-Met0.20賴氨酸 L-Lys 預(yù)混料a Premix0.32玉米淀粉鋅c CornstarchZinc0.50合計(jì) Total100.00營養(yǎng)水平 Nutrient levels代謝能ME（MJ/kg） 12.53粗蛋白b CP21.56蛋氨酸Met 0.54蛋+胱 Met+Cys0.91賴氨酸Lys1

6、17色氨酸 Trp0.30鈣b Ca1.10有效磷 Available P0.46鋅b Zinc (mg/kg)28.37a每kg預(yù)混料中含有Provided per kg of premix：VA 10000IU；VB11.6mg；VB2 (核黃素, riboflavin) 6mg；泛酸 (VB3 ) D-pantothenic acid (D-泛酸鈣D-calcium pantothenate) 20 mg；VB63 mg；VB120.014mg； VD32600IU； VE20IU；VK3 2 mg；生物素 biotin 0.12mg； 葉酸folic acid0.8mg；煙酸(尼克酸)

7、 nicotinic acid (niacin) 30 mg； 膽堿 choline 1.3 g；Cu (as copper sulfate) 8 mg； Fe (as ferrous sulfate) 80 mg； Mn (as manganese sulfate) 100mg； I (as calcium iodate)0.35mg；Se (as sodium selenite) 0.15 mg。b實(shí)測值A(chǔ)nalyzed composition.C鋅替代等重的玉米淀粉添加1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理采用單因子安排的完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，將720只商品代1日齡AA肉公雞隨機(jī)分成8組，每組分6個(gè)重復(fù)籠飼養(yǎng)

8、，每個(gè)重復(fù)籠8只飼養(yǎng)于一個(gè)不銹鋼鍍塑肉雞籠內(nèi)。飼養(yǎng)管理按AA肉仔雞飼養(yǎng)管理手冊(cè)進(jìn)行。試驗(yàn)期21天。每周末以重復(fù)籠為單位稱空腹體重和耗料量。設(shè)8個(gè)鋅（硫酸鋅）添加水平分別為0、20、40、60、80、100、120和140 mg/kg，共組成8個(gè)處理組。1.3 樣品的采集與制備試驗(yàn)第7、14、21日齡從每個(gè)重復(fù)籠按平均體重選取4只雞于禁食一夜后全部屠宰，立即摘出腎臟和胰臟于-196液氮凍存，以備分析ZnT-2 mRNA水平；每重復(fù)籠4只雞的樣品合并為一個(gè)樣品分析。配合試驗(yàn)飼糧時(shí)現(xiàn)場采樣，研磨過200目篩后置于塑料瓶中低溫保存以備分析。1.4 樣品分析組織ZnT2 mRNA水平的測定： SYBR

9、Green實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法（QRT-PCR）法。主要操作步驟為：用Trizol試劑（15596-026, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA）一步抽提法提取胰臟細(xì)胞中的總RNA，用Ultrospec紫外-可見分光光度計(jì)（Ultrospec III, Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT）測其OD260、OD280，計(jì)算比值并定量，其OD260：OD280比值均在1.8以上。用0.8%的甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。按照SuperScript III TM First-Strand Sy

10、nthesis System for RT-PCR試劑盒（12371-019, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA）使用說明，合成cDNA模板。根據(jù)雞MT、ZnT2序列和-actin cDNA序列，分別設(shè)計(jì)合成其擴(kuò)增引物（表2）。在ABI7000熒光定量分析儀（7000HT, Applied Biosystems Incorporation, Foster, CA, USA）上采用標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)定量法進(jìn)行ZnT2基因表達(dá)的熒光定量分析。定量體系（25ul）為：2×SYBR MasterMix （4309155, Applied

11、 Biosystems Incorporation, Foster, CA, USA）12.5ul；引物F（10M/L）1.0ul；引物R（10M/L）1.0ul ；CDNA 1.0ul；ddH2O 9.5ul。根據(jù)儀器由標(biāo)準(zhǔn)曲線自動(dòng)生成的各樣品的熒光值對(duì)胰臟ZnT-2 mRNA進(jìn)行相對(duì)定量。每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)行三次PCR反應(yīng)，以三次PCR反應(yīng)中ZnT-2與管家基因-actin熒光值的平均值作為該樣品的觀察值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。胰臟ZnT-2 mRNA水平以同一體系中ZnT-2與管家基因-actin的熒光值的相對(duì)比值來表示。表2：雞ZnT-2及-actin（管家基因）的引物序列TABLE 2. Prim

12、er sequence of chicken, zinc transporters-2 (ZnT-2) and -actin (house-keeping gene)引物引物序列位置及擴(kuò)增長度PrimerPrimer sequencePosition and lengthZnT-2上游（ZnT-2 F）TCT TCT CCG TGC TGG TGC T526-624ZnT-2下游（ZnT-2 R）CGG CGT TGA AAT CCA TCC99 bp-actin上游（-actin F）GAG AAA TTG TGC GTG ACA TCA685-818-actin下游（-actin R）CC

13、T GAA CCT CTC ATT GCC A134 bp1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和處理采用SAS8.0統(tǒng)計(jì)軟件中的一般線性模型（GLM）中單因素方差分析，對(duì)所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，每個(gè)重復(fù)籠為一個(gè)試驗(yàn)單元。2 結(jié)果與討論前人研究表明，鼠腎臟ZnT2 mRNA對(duì)鋅的反應(yīng)最敏感10，且胰臟為肉仔雞中鋅反應(yīng)最敏感組織11-13，故本試驗(yàn)選取腎臟和胰臟組織來進(jìn)行ZnT2 mRNA分析。本試驗(yàn)熒光定量結(jié)果顯示腎臟中ZnT2的表達(dá)很弱，幾乎沒有表達(dá)，故本文沒有列出腎臟的結(jié)果。這表明，不同種類的動(dòng)物中ZnT2基因表達(dá)存在組織特異性，在鼠中腎臟為其敏感組織，在肉仔雞中則不然。胰臟ZnT2 mRNA結(jié)果列于表3，擬

14、合曲線見圖1。由表3可見，在各日齡階段，飼糧鋅含量均顯著影響胰臟ZnT2 mRNA水平（P<0.01）。胰臟ZnT2 mRNA水平在7日齡時(shí)隨飼糧鋅添加量的增加呈明顯的漸表3：飼糧鋅水平對(duì)各日齡肉仔雞胰臟ZnT2 mRNA水平的影響1Table3. Effect of dietary zinc on tissue ZnT2 mRNA level of broiler chicks1鋅添加水平胰臟ZnT2 mRNA （R）Added Zn level（mg/kg）7日齡 D714日齡 D1421日齡 D2100.0042c0.0094d0.0271f200.1003b0.0524c0.09

15、35e400.1100b0.1250ab0.1058de600.1461ab0.1430a0.1386bc800.1705a0.1369ab0.1524ab1000.1455ab0.1258ab0.1184cd1200.1380ab0.0965b0.1035de1400.1364ab0.0614bc0.1765a集合標(biāo)準(zhǔn)誤 Pooled SE0.0180.0170.016P-值 P-valuezinc<0.0001<0.0001<0.0001Zinc linear<0.0001<0.0001<0.0001Zinc quadratic<0.0001<

16、;0.0001<0.00011每個(gè)數(shù)據(jù)代表6個(gè)重復(fù)（n=6）的平均值1Results are means with (n=6) per treatmenta, b 同一列中數(shù)值具有不同字母上標(biāo)者差異顯著(P<0.01)a, b Means with different superscripts within the same column differ significantly (P<0.01).Fig1圖1近線變化趨勢(shì)，而14日齡與21日齡均呈二次曲線變化趨勢(shì)。胰臟ZnT2 mRNA水平與飼糧鋅添加量間擬合的方程為（圖1）：7日齡Y=0.1471-0.1424e-0.04

17、98x（P=0.0012，R2=0.9321）14日齡Y=0.0068+0.0035x-0.000022x2（P=0.0003，R2=0.9606）21日齡Y=0.030+0.0030x-0.000020x2（P=0.0029，R2=0.9457）分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用使快速測定痕量mRNA成為可能。熒光定量PCR（Real-Time RT-PCR）為監(jiān)測基因表達(dá)水平的變化提供了一個(gè)高靈敏度和可重復(fù)性方法。這種新的分子生物學(xué)手段的出現(xiàn)為發(fā)現(xiàn)新的營養(yǎng)標(biāo)識(shí)物開拓了前景14。鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Znic Transporters，ZnTs）為近年來才發(fā)現(xiàn)的一組結(jié)構(gòu)和功能相近的蛋白質(zhì)，具有六個(gè)跨膜區(qū)域并且

18、有一個(gè)區(qū)域含有豐富的組氨酸，此區(qū)域可能含有鋅離子的結(jié)合位點(diǎn)，到目前為止已發(fā)現(xiàn)了至少9種ZnTs。研究表明，ZnTs在維持細(xì)胞鋅穩(wěn)態(tài)平衡方面起著重要的作用，其與MT協(xié)同作用對(duì)細(xì)胞內(nèi)鋅的濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)，保證細(xì)胞內(nèi)鋅的穩(wěn)衡。MT通過細(xì)胞內(nèi)結(jié)合的方式協(xié)助調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)游離鋅的水平，而ZnTs主要通過調(diào)節(jié)鋅的跨膜運(yùn)輸對(duì)細(xì)胞內(nèi)鋅的濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)9。Cousins等（2003）14報(bào)道，鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因可能用作反映機(jī)體內(nèi)鋅營養(yǎng)狀況的指標(biāo)。不同鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員對(duì)鋅反應(yīng)的敏感度不同。Liuzzi等（2001）7在大鼠中研究了飼糧鋅對(duì)不同鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白成員ZnT-1 、ZnT-2和ZnT-4基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明，ZnT-

19、2 mRNA對(duì)鋅的反應(yīng)最敏感。Blanchard等（2001）10研究表明，腎臟ZnT-2 mRNA可以作為大鼠鋅營養(yǎng)狀況的評(píng)價(jià)指標(biāo)。但在雞上還未見相似的研究。本研究首次發(fā)現(xiàn)飼糧鋅水平對(duì)肉仔雞胰臟ZnT-2 mRNA水平有顯著的影響，各日齡胰臟ZnT-2 mRNA水平均隨飼糧鋅添加水平的增加呈現(xiàn)二次曲線或漸近線變化趨勢(shì)，這說明胰臟ZnT-2 mRNA水平可以敏感的反應(yīng)肉仔雞鋅的營養(yǎng)狀況，提供了一個(gè)新的鋅營養(yǎng)標(biāo)識(shí)。另外，胰臟ZnT2 mRNA水平在7日齡時(shí)隨飼糧鋅添加量的增加呈明顯的漸近線變化，而14日齡與21日齡均呈現(xiàn)二次曲線變化，這表明在鋅的穩(wěn)態(tài)平衡調(diào)節(jié)中，ZnT2可能發(fā)揮著第一道防線的作用

20、，在其不能有效維持鋅的穩(wěn)態(tài)平衡時(shí)，其它鋅穩(wěn)恒調(diào)節(jié)蛋白會(huì)發(fā)揮更大的作用。黃艷玲（2007）15在同樣的試驗(yàn)條件下研究了肉仔雞飼糧鋅水平對(duì)胰臟MT mRNA水平的影響，結(jié)果表明，胰臟MT mRNA隨飼糧鋅水平的增加呈顯著的線性變化，這可能也說明了在飼糧鋅含量達(dá)到一定水平，ZnT2不能有效維持鋅的穩(wěn)態(tài)平衡時(shí)，MT發(fā)揮著更重要的作用，具體機(jī)理有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。3 結(jié)論本試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，胰臟ZnT-2 mRNA水平可以敏感的反應(yīng)肉仔雞鋅的營養(yǎng)狀況，提供了一個(gè)新的鋅營養(yǎng)標(biāo)識(shí)。在肉仔雞體內(nèi)鋅的穩(wěn)恒調(diào)控作用中，ZnT-2可能在初期發(fā)揮著比較重要的作用，為鋅穩(wěn)態(tài)平衡的第一道防線，而MT則在后期發(fā)揮著重要的作用

21、。參考文獻(xiàn)：1 Oh, S. H., H. Nakaue, J. T. Deagen, P. D. Whanger, and G. H. Arscott. 1979. Accumulation and depletion of zinc in chick tissue metallothionein. J. Nutr. 107: 1720-1729.2 McCormick, C. C. 1984. Induction and accumulation of metallothionein in liver and pancreas of chicks given oral zinc: a ti

22、ssue comparison. J.Nutr. 114: 191-203.3 Sandoval, M., P. R. Henry, X. G. Luo, R. C. Littell, R. D. Miles, and C. B. Ammerman. 1998. Performance and tissue zinc and metallothionein accumulation in chicks fed a high dietary level of zinc. Poult. Sci. 77: 1354-1363.4 Cao, J., P. R. Henry, S. R. Davis,

23、R. J. Cousins, R. D. Miles, R. C. Littell. C. B. Ammerman. 2002 Realtive bioavailability of organic zinc sources based on tissue zinc and metallothionein in chicks fed conventional dietary zinc concentrations. Anim Feed Sci Tech. 101: 161-170.5 McMahon, R. J., and R. J. Cousins. 1998. Regulation of

24、the zinc transporter ZnT-1 by dietary zinc. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 4841-4846.6 Langmade, S. J., R. Ravindra, P. J. Daniels, and G. K. Andrews. 2000. The transcription factor MTF-1 mediates metal regulation of the mouse ZnT1 gene. J. Biol. Chem. 275: 34803-34809.7 Liuzzi, J. P., R. K. Blan

25、chard, and R. J. Cousins. 2001. Differential regulation of zinc transporter 1, 2, and 4 mRNA expression by dietary zinc in rats. J. Nutr. 131: 46-52.8 Kelleher, S. L. and B. Lönnerdal. 2002. Zinc transporters in the rat mammary gland respond to marginal zinc and vitamin A intakes during lactati

26、on. J. Nutr. 132: 3280-3285.9 Liuzzi, J. P, and R. J. Cousins. 2004. Mammalian zinc transporters. Annu. Rev. Nutr. 24: 151-172.10 Blanchard, R. K., J. B. Moore, C. L. Green, and R. J. Cousins. 2001. Modulation of intestinal gene expression by dietary zinc status: effectiveness of cDNA arrays for exp

27、ression profiling of a single nutrient deficiency. Proc Natl Acad Sci U S A. 98: 13507-1351311 McCormick C C. Induction and accumulation of metallothionein in liver and pancreas of chicks given oral zinc: a tissue comparison. J.Nutr. 1984, 114: 191-203.12 Williams S N, Miles R D, Ouart M D, Campbell

28、 D R. Short-term high level zinc feeding and tissue zinc concentration in mature laying hens. Poult. Sci. 1989, 68: 539-545.13 李杰，許振英. 飼糧植酸和鋅水平對(duì)肉雞鋅吸收利用的影響. 中國畜牧雜志. 1994, 30: 3-4. 14 Cousins, R. J., R. K. Blanchard, M. P. Popp, L. Liu, J. Cao, J. Bernadette Moore, and C. L. Green. 2003. A global view

29、 of the selectivity of zinc deprivation and excess on genes expressed in human THP-1 mononuclear cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 100: 6952-6957.15 黃艷玲. 2007. 肉仔雞實(shí)用飼糧中鋅適宜水平及有機(jī)鋅源相對(duì)生物學(xué)利用率研究. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文, p 33-38.The Effect of Dietary Zinc Level on tissue Zinc transporters Gene Expression in Broiler Chicks Huang Yan-ling1,2,3, Luo Xu-gang1,2* Lu Lin1,2 Liu Bin1,2(1. Mineral Nutrition Research Division, Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing 100094, China; 2. State Key Laboratory of Animal Nutrition, Beijing 100094, China;3. Colle