富馬酸氨基酸酯類衍生物的合成及其抑菌活性研究_圖文

1、富馬酸氨基酸酯類衍生物的合成及其抑菌活性研究寧正祥,蘇蘭,廖文鎮(zhèn),袁爾東,韋慶益(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640摘要:本研究以馬來酸酐和氨基酸酯為原料,以無水氯化鋁為異構(gòu)化催化劑,經(jīng)酰胺化、異構(gòu)化合成了八種富馬酸氨基酸酯類衍生物。在以馬來酸酐:氨基酸酯:無水氯化鋁為0.2 mol:0.2 mol:1.0 g的合成條件下,它們合成的產(chǎn)率均超過75%。經(jīng)熔點(diǎn)測定和核磁共振氫譜分析對產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確定。通過對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、乳酸菌和牛奶酸敗混合菌的抑菌活性實(shí)驗(yàn)和涂抹皮膚實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明:富馬酸氨基酸酯類衍生物的最低抑菌摩爾濃度與富馬酸二甲酯的最低

2、抑菌摩爾濃度相當(dāng),但富馬酸氨基酸酯類衍生物對人體皮膚沒有過敏現(xiàn)象,而富馬酸二甲酯具有很強(qiáng)紅斑過敏作用。另外還研究了富馬酸氨基酸酯類衍生物對正常肝細(xì)胞(L02和肝癌細(xì)胞(HepG2存活率實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們對這兩種細(xì)胞都沒有毒害作用。關(guān)鍵詞:富馬酸氨基酸酯類衍生物;抑菌活性;細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn);皮膚過敏測試DerivativesNING Zheng-xiang, SU Lan, LIAO Wen-zhen, YUAN Er-dong, WEI Qing-yi(College of Light Industry and Food Science, South China University of Te

3、chnology, Guangzhou 510640, China Abstract:In this study, eight kinds of fumaric acid amino acid ester derivatives were synthesized through amidation and isomerization, by using maleic anhydride and amino acid ester as raw materials and anhydrous aluminium chloride as an isomerization catalyst. Usin

4、g a ratio of maleic anhydride to amino-acid ester to anhydrous aluminum chloride as 0.2 mol:0.2 mol:1.0 g, the yield of these products was more than 75%. The molecular structure of the compounds was determined by melting point determination and 1H nuclear magnetic resonance imaging. Antimicrobial ac

5、tivity of these compounds against Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp., Bacillus subtilis, Lactobacillus sp., bacteria causing milk spoilage, as well as skin smear tests were conducted. The results showed that the minimum inhibitory concentration of fumaric acid amino acid ester d

6、erivatives were comparable to that of dimethyl fulminate. Moreover, fumaric acid amino acid ester derivatives did not cause skin allergy, while dimethyl fumarate caused strong skin allergic reactions (red rash. Cell viability of normal liver cells (L02 and hepatoma cells (HepG2 exposed to fumaric ac

7、id amino acid ester derivatives was also evaluated, which showed no toxic effect on either cell type.Key words: fumaric acid amino acid ester derivatives; antimicrobial activity; cell viability experiment; skin allergy test富馬酸二甲酯(DMF是國外80年代開發(fā)出來的一種新型食品防腐劑,其可適用的pH范圍較寬,具有廣譜、高效、低毒、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),而且能在人體內(nèi)被酯酶快速水解為富

8、馬酸(機(jī)體內(nèi)的一種正常代謝產(chǎn)物。DMF對大鼠(口服的半數(shù)致死量LD50=2240 mg/kg,因而具有蓄積性低、慢性毒性低等特點(diǎn),并且無致畸性,也不會致突變,因此富馬酸二甲酯曾被歸收稿日期:2014-04-08基金項(xiàng)目:中央高校華南理工大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(2013ZZ0080,2014ZZ0058作者簡介:寧正祥(1954-,男,博士,教授,研究方向:食品化學(xué)通訊作者:韋慶益(1977-,女,博士,副教授,研究方向:食品化學(xué)及功能性食品領(lǐng)域類為低毒類物質(zhì)1。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)富馬酸二甲酯作為防腐劑在食品中應(yīng)用時(shí),它會對人體皮膚產(chǎn)生強(qiáng)烈的刺激性2;它作為防霉劑在皮革家具、鞋業(yè)和家具業(yè)中應(yīng)用

9、時(shí),也會引起一些皮膚炎癥3,因此目前已限制或禁止其在相關(guān)行業(yè)中的使用。由于富馬酸含有兩個(gè),-不飽和羰基結(jié)構(gòu),故其衍生物可能會具有一定程度的抑菌活性4。國內(nèi)關(guān)于富馬酸酯類防腐劑的研究主要是合成出同時(shí)具備抑菌和其它功能的多功能富馬酸酯類衍生物。已有研究表明,若在富馬酸分子上引入維生素C或沒食子丙酯(PG,可合成出同時(shí)具有抑菌和抗氧化功能的富馬酸酯類衍生物。此外還報(bào)道了反丁烯二酸淀粉甲酯、反丁烯二酸甘露糖甲酯以及富馬酸桂醇甲酯等具有多功能的富馬酸酯類衍生物。但是它47們的應(yīng)用或受到分離提純困難、活性不好或受到價(jià)格昂貴等因素的限制5。同時(shí),氨基酸酯是含有酯和氨基的雙官能團(tuán)化合物,是有機(jī)合成的重要中間體

10、。氨基酸酯的合成的方法有很多種67,參考相關(guān)方法,本課題組合成了一系列的氨基酸酯,如甘氨酸甲酯鹽酸鹽、甘氨酸乙酯鹽酸鹽、甘氨酸異丙酯鹽酸鹽、甘氨酸丙酯鹽酸鹽、苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽、苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽、苯丙氨酸異丙酯鹽酸鹽和苯丙氨酸丙酯鹽酸鹽。此外,本實(shí)驗(yàn)以馬來酸酐和氨基酸酯為原料、無水AlCl3為異構(gòu)催化劑,合成了具有良好抗菌活性,卻對皮膚無致敏性的富馬酸氨基酸酯類衍生物(結(jié)構(gòu)見圖1。 圖1 富馬酸氨基酸酯類衍生物的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of fumaric acid amino acid ester derivatives 1 材料與方法1.1 材料與儀器順丁烯二酸酐、

11、富馬酸二甲酯、甘氨酸、苯丙氨酸、吡啶、二氯亞砜、無水氯化鋁(AR。DMEM培養(yǎng)基與磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.4(Invitrogen; MTT、DMSO(sigma。胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司;青霉素-鏈霉素溶液(100X(碧云天生物技術(shù)研究所;大腸桿菌(Escherichia coli,金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,沙門氏菌(Salmonella,枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis,乳酸菌(Lactobacillus,以上菌種由均華南理工大學(xué)生物與科技學(xué)院提供,牛奶酸敗混合菌(Milk spoilage bacteria則用新鮮

12、牛奶自制而得。人肝癌細(xì)胞HepG2與正常肝細(xì)胞L02來著中山大學(xué)腫瘤研究所。其他試劑均為分析純。SPX-100B-Z型生化培養(yǎng)箱,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;KDC-40低速離心機(jī),安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;SW-CJ-1D型凈化工作臺,蘇州凈化設(shè)備有限公司;酶標(biāo)儀Varioskan Flash、二氧化碳培養(yǎng)箱Hepa Class 100,美國hermo公司;倒置熒光顯微鏡BX51,日本Olympus光學(xué)工業(yè)株式會社。1.2 試驗(yàn)方法根據(jù)韓秋敏6和Jiabo Li7的方法,以氨基酸和醇為原料反應(yīng)合成了一系列的氨基酸酯鹽酸鹽。將0.02 mol的氨基酸酯鹽酸鹽和0.02 mol(約1.9

13、6 g順丁烯二酸酐溶解在吡啶中進(jìn)行酰胺化反應(yīng),反應(yīng)溫度55 ,反應(yīng)時(shí)間3 h。待反應(yīng)結(jié)束后再加入異構(gòu)化劑無水氯化鋁1.0 g(催化量進(jìn)行異構(gòu)化反應(yīng),立即升溫至95 并攪拌反應(yīng)2 h8。待反應(yīng)結(jié)束后,將反應(yīng)液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),除去吡啶,得到棕色固體。用乙醇將產(chǎn)物溶解,隨后加入適量的飽和碳酸氫鈉,溶液中產(chǎn)生大量沉淀,離心得上清液,用一定濃度的鹽酸將其調(diào)至pH為35。將此溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),得到固體和液體的混合物,用無水乙醇萃取液體部分以除去混合物中的鹽及不溶物,再次旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),即可得到富馬酸氨基酸酯類衍生物的粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物用硅膠層析柱分離提純(流動(dòng)相為乙酸乙酯:乙醇=3:1。熔點(diǎn)測定,采用毛細(xì)管法測定產(chǎn)品熔

14、點(diǎn)。核磁共振氫譜測定,以氘代DMSO為溶劑,400 MHz。供試菌種經(jīng)牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基接種、培養(yǎng)后,采用比濁法和平板計(jì)數(shù)法制得濃度為104106 CFU/mL的菌懸液備用。準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的富馬酸氨基酸酯類衍生物,用含量為培養(yǎng)基2%(V/V的無水乙醇將其溶解配成不同的濃度。然后將其倒入已溶化好的培養(yǎng)基中,混合均勻,即得到一系列不同濃度(m/V:0.01%、0.05%、0.10%、0.12%、0.15%的富馬酸氨基酸酯類衍生物溶液,趁熱倒入20 mL此培養(yǎng)基于各個(gè)培養(yǎng)皿中。并用同等濃度的富馬酸二甲酯(DMF作為對照組。待冷卻凝固后,每個(gè)培養(yǎng)皿加入100 µL菌懸液涂勻,于37 恒

15、溫箱中培養(yǎng)1824 h,觀察結(jié)果。最后,將不長菌的富馬酸氨基酸酯類衍生物和富馬酸二甲酯最低質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)化成富馬酸氨基酸酯類衍生物的最小抑菌摩爾濃度910。將八種純化后的富馬酸氨基酸酯類衍生物和富馬酸二甲酯(DMF用無水乙醇配成5 g/L的溶液,用棉簽沾取適量此溶液,分別涂在健康試驗(yàn)者(4名男士和4名女士且年齡在1826歲之間的手背上,觀48察所涂部位2 h內(nèi)的變化8。用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素和DMEM 培養(yǎng)基配制得到細(xì)胞培養(yǎng)基。用胰蛋白酶消化對數(shù)期的人正常肝細(xì)胞L02和肝癌細(xì)胞HepG2,終止后離心收集,制成細(xì)胞懸液,采用細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法調(diào)整其濃度至510×104個(gè)/mL。

16、將人正常肝細(xì)胞L02和肝癌細(xì)胞HepG2各100 L接種于96孔板中,使待測細(xì)胞的密度為500010000個(gè)/孔(邊緣孔用無菌PBS填充。將接種好的細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),加入富馬酸氨基酸酯類衍生物,使人肝癌細(xì)胞HepG2和正常肝細(xì)胞L02最終濃度分別為50、100、200、400 g/mL和12.5、25、50、100 g/mL,再于5% CO2,37 的條件下孵育48 h,用倒置顯微鏡下觀察藥物的作用效果。每孔加入20 L MTT溶液(5 mg/mL,0.5% MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,然后吸取上清液,每孔加入100 L DMSO,搖床振蕩10 min后,將96孔板置于酶標(biāo)儀,570 n

17、m 測定OD值。同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜,對照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜1113。并根據(jù)如下公式計(jì)算存活率:%100OD-OD/(OD-OD(%/=空白組對照組空白樣品細(xì)胞存活率注:對照組OD、空白組OD和樣品OD分別表示對照組、空白組和樣品組的吸光度。2 結(jié)果與討論2.1 富馬酸氨基酸酯類衍生物的結(jié)構(gòu)表征從以上的核磁數(shù)據(jù)中,雙鍵的耦合常數(shù)都是18 Hz左右,可以看出合成的8個(gè)富馬酸氨基酸酯衍生物49均成功的進(jìn)行了異構(gòu)化,都是反式結(jié)構(gòu)的富馬酸氨基酸酯衍生物。2.2 富馬酸氨基酸酯類衍生物的抑菌活性實(shí)驗(yàn)表1 富馬酸氨基酸酯類衍生物抑菌活性的最低

18、抑菌濃度(MIC Table 1 Minimal inhibitory concentration (MIC of fumaric acid amino acid ester derivatives防腐劑種類最低抑菌濃度(MIC/(mmol/La1 6.42 6.42 6.42 6.42 6.42 6.42a2 5.97 5.97 5.97 5.97 5.97 5.97a3 5.58 5.58 5.58 5.58 5.58 5.58a4 5.58 5.58 5.58 5.58 5.58 5.58b1 4.43 4.43 4.43 4.43 4.43 4.43b2 4.12 4.12 4.12

19、4.12 4.12 4.12b3 3.93 3.93 3.93 3.93 3.93 3.93b4 3.93 3.93 3.93 3.93 3.93 3.93 DMF 2.78 4.17 4.86 4.17 4.17 4.17 注:Escherichia. coli-大腸桿菌;Staphylococcus. aureus-金黃色葡萄球菌;Salmonella. sp-沙門氏菌;Bacillus subtilis-枯草桿菌;Lactobacillus-乳酸菌;Milk spoilage bacteria-牛奶酸敗菌。由表1可知,富馬酸氨基酸酯類衍生物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿

20、菌、乳酸菌和牛奶酸敗混合菌均有一定的抑制作用,但不同的富馬酸氨基酸酯類衍生物對不同試用菌的最低抑制濃度是不同的。如a1對實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)菌的最低抑制摩爾濃度都為6.42 mmol/L;a2對實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)菌的最低抑制摩爾濃度都為5.97 mmol/L;a3和a4對實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)菌的最低抑制摩爾濃度都為5.58 mmol/L;b1對實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)菌的最低抑菌摩爾濃度都為4.43 mmol/L; b2對實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)菌的最低抑菌摩爾濃度都為4.12 mmol/L;b3和b4對實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)菌的最低抑菌摩爾濃度都為3.93 mmol/L。對比DMF的抑菌試驗(yàn)結(jié)果可知, a1、a2、a3和a4比DMF對實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)

21、菌的抑菌活性稍差,b1和b2對實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)菌的的抑菌活性與DMF 相當(dāng),但是b3和b4對實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)菌的的抑菌活性比DMF稍優(yōu)。2.3 皮膚過敏性結(jié)果經(jīng)過皮膚敏感性測試,由表2可得,所合成的一系列富馬酸氨基酸酯類衍生物對皮膚無致敏性,而富馬酸二甲酯在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行5 min后就出現(xiàn)了過敏現(xiàn)象,由此可以表明富馬酸一側(cè)的羧基與氨基酸酯發(fā)生了酰胺化反應(yīng)后,通過結(jié)構(gòu)的改變,消除了富馬酸類衍生物的致敏現(xiàn)象,所得到新的富馬酸氨基酸酯類衍生物無致敏現(xiàn)象。表2 富馬酸氨基酸酯類衍生物對皮膚過敏性的測試Table 2 Skin allergy test results of fumaric acid amino ac

22、idester derivatives0 min 30 min 60 min 120 min 致敏率/%a10 0 0 0 0a20 0 0 0 0a30 0 0 0 0a40 0 0 0 0b10 0 0 0 0b20 0 0 0 0b30 0 0 0 0b40 0 0 0 0DMF 0 4 6 5 100 注:(1皮膚過敏性反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn):紅斑:無紅斑,0分;勉強(qiáng)可見,1分;明顯可見,2分;中度到嚴(yán)重紅斑,3分;紫紅色紅斑并有焦痂形成,4分;水腫:無水腫,0分;勉強(qiáng)可見,1分;可見(邊緣高出周圍皮膚,2 分;皮膚隆起約1 mm,輪廓清楚,3分;皮膚隆起約1 mm以上且范圍擴(kuò)大,4分。最高總分

23、值為8分。(2%100/=參加實(shí)驗(yàn)人數(shù)出現(xiàn)癥狀致敏率。2.4 富馬酸氨基酸酯類衍生物的細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)研究本論文還研究了富馬酸氨基酸酯類a2、a4、b1、b2對正常肝細(xì)胞株L02和a1、a2、a4、b1對人體肝癌細(xì)胞株HepG2的細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)。從圖2可以看出,當(dāng)藥物的濃度都為12.5 g/mL時(shí),a2對人體正常肝細(xì)胞(L02的細(xì)胞存活率為93.43%;a4對人體正常肝細(xì)胞(L02的細(xì)胞存活率為94.31%;當(dāng)藥物濃度為200 g/mL時(shí),a2對人體正常肝細(xì)胞(L02的細(xì)胞存活率為76.76%;a4對人體正常肝細(xì)胞(L02的細(xì)胞存活率為68.72%;根據(jù)已有的文獻(xiàn)報(bào)道14可得,在0200 g/m

24、L的濃度范圍內(nèi),除了濃度為200 g/mL 的a4的細(xì)胞存活率是68.72%而小于75%被歸類為毒性2級(毒性不大之外,其余的評分都為1級,均屬無毒型。因此,雖隨著a2、a4、b1和b2濃度的升高,正常肝細(xì)胞(L02存活率依次有所減弱,但它們對正常肝細(xì)胞(L02的毒害作用不大。同理,從圖3的結(jié)果看出,不同濃度的a1、a2、a4和b1對人體肝癌細(xì)胞株HepG2的毒害作用非常微小,如濃度分別為50 g/mL、100 g/mL、200 g/mL和400 g/mL是的50a2,其對肝癌細(xì)胞的存活率分別為93.77%、92.48%、92.81%和91.83%,它們的存活率均大于75%,可評分為1級,均屬

25、無毒型。在0400 g/mL的濃度范圍內(nèi), a1、a2、a4和b1均可評分為1級,均屬無毒型。因此,通過細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)可知合成的富馬酸氨基酸酯類衍生物對細(xì)胞的毒性作用相對較小。 圖2 a2、a4、b1、b2對肝細(xì)胞株L02細(xì)胞存活率 Fig.2 Cell viability of L02 cultured with a2, a4, b2,and b1圖3 a1、a2、a4、b1對人體肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞存活率Fig.3 Cell viability of HepG2 cultured with a2, a1, b2, and b4 3 結(jié)論3.1 本文以氨基酸酯和馬來酸酐為原料合成了一系列的

26、富馬酸氨基酸酯類衍生物,本文的合成方法不僅改善了傳統(tǒng)方法對設(shè)備腐蝕和三廢處理等方面的缺點(diǎn),而且還大大提高了產(chǎn)率7。此外,還建立了合成產(chǎn)物的純化方法,并通過熔點(diǎn)測定和核磁共振光譜等對合成產(chǎn)物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。3.2 通過最低抑制濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)合成的富馬酸氨基酸酯類衍生物均有效地抑制各種實(shí)驗(yàn)所用細(xì)菌生長;另外經(jīng)初步的皮膚過敏試驗(yàn)測試,發(fā)現(xiàn)其對人體皮膚無致敏性;最后還發(fā)現(xiàn)富馬酸氨基酸酯類衍生物對人體正常肝細(xì)胞株L02和肝癌細(xì)胞HepG2的細(xì)胞毒性作用較小。本研究成果將為富馬酸氨基酸酯類衍生物的廣泛應(yīng)用提供了良好的理論依據(jù)與數(shù)據(jù)支撐。參考文獻(xiàn)1Islam N M.Inhibition of mold

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