總RNA的提取及相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法

1、總RNA的提?。═rizol法提取）在收集到生物材料之后，最好能即刻進(jìn)行RNA制備工作。若需暫時(shí)儲(chǔ)存，則應(yīng)以液氮將生物材料急速冷凍后，儲(chǔ)存于-80冷凍柜。在制備RNA時(shí)，將儲(chǔ)存于冷凍柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破細(xì)胞，不可以先行解凍，以避免RNase的作用。1. 提取組織RNA時(shí)，每50100mg組織用1ml Trizol試劑對(duì)組織進(jìn)行裂解；提取細(xì)胞RNA時(shí)，先離心沉淀細(xì)胞，每5-10 106個(gè)細(xì)胞加1ml Trizol后，反復(fù)用槍吹打或劇烈振蕩以裂解細(xì)胞；2. 將上述組織或細(xì)胞的Trizol裂解液轉(zhuǎn)入EP管中,在室溫1530C下放置5分鐘；3. 在上述EP管中，按照每1ml TR

2、IZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，蓋上EP管蓋子，在手中用力震蕩15秒，在室溫下（1530）放置23分鐘后，12000g（28）離心15分鐘；4. 取上層水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml異丙醇的量加入異丙醇，在室溫下（1530）放置10分鐘,12000g（28）離心10分鐘；5. 棄上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇進(jìn)行洗滌，渦旋混合，7500g（28）離心5分鐘，棄上清；6. 讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥；7. 用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。 PCR 實(shí)驗(yàn)室常用DNA聚合酶有三種：TaKaRa TaqTM，TaKaRa

3、EXTaqTM和PyrobestTM DNA Polymerase。TaKaRa TaqTM是一般的DNA聚合酶，保真性較差，但價(jià)錢便宜，一般用于基因表達(dá)的檢測(cè)等。TaKaRa EXTaqTM是具有Proof reading活性的耐熱性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物3端附有一個(gè)“A”堿基，如果希望直接將產(chǎn)物克隆到T-vector可以用此酶。PyrobestTM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐熱性DNA聚合酶，其特點(diǎn)是保真性極高，擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物為平滑末端。如果進(jìn)行基因的擴(kuò)增請(qǐng)使用此酶。1. 按下列組成在PCR反應(yīng)管中調(diào)制反

4、應(yīng)液：TaKaRa TaqTM或TaKaRa EXTaqTM的配方ReagentQuantity, for 50µl of reaction mixture10X PCR buffer （Mg2+ free）5 µlMgCl2（25mM）如TaKaRa TaqTM加3 µl 如TaKaRa EXTaqTM加4 µl2.5mM dNTP mix4 µl 10µM Primer 上游1 µl10µM Primer下游1 µlTemplate DNA1 µlTaq或EXTaqDNA Polymeras

5、e0.25 µlSterile deionized waterUp to 50µlTotal50 µl /SamplePyrobestTM DNA Polymerase的配方ReagentQuantity, for 50µl of reaction mixture10X Pyrobest buffer 5µl2.5mM dNTP mix4µl 10µM Primer上游1µl10µM Primer 下游1µlTemplate DNA1µlPyrobestTM DNA Polymeras

6、e0.25µlSterile deionized waterUp to 50µlTotal50µl /Sample 反應(yīng)總體積根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)控，可以做2050µl以節(jié)約試劑； 將上表各成分加入到0.2ml或0.5ml滅菌的PCR薄壁管中； 如果不用PCR儀的加熱蓋，在反應(yīng)混合液的上層加30 50µl 的礦物油防止樣品在PCR的過(guò)程中蒸發(fā)；2. 按以下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件視模板、引物等的結(jié)構(gòu)條件不同而各異，在實(shí)際操作中需根據(jù)具體的情況以及PCR結(jié)果而進(jìn)行優(yōu)化。StepTemperature, °C Time, minN

7、umber of cyclesNote起始變性94951-31變性94950.5-225-35退火溫度比理論退火溫度大概低5°C，再根據(jù)反應(yīng)結(jié)果優(yōu)化退火37-700.5-2延伸70-75根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小每分鐘延伸1000bp最終延伸70-75101反應(yīng)結(jié)束后，抽取擴(kuò)增樣品5µl，用瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增結(jié)果，用DNA marker判斷擴(kuò)增片段的大小或冷凍保存，以備以后分析使用。RT-PCRProtocol: TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV) 1. 按下列組成在PCR反應(yīng)管中調(diào)制反應(yīng)液ReagentQuantity, for 50µ

8、;lof reaction mixture10×One Step RNA PCR Buffer5µl25 mM MgCl210µl10 mM dNTP mix5µlRNase Inhibitor (40 U/µl)1µlAMV-Optimized Taq1µlAMV RTase XL (5 U/µl)1µl上游特異Primer (20 µM)1µl下游特異Primer (20 µM)1µl實(shí)驗(yàn)樣品RNA（1 µg Total RNA）1µlRNa

9、se Free dH2O24µlTotal50µl /Sample1. 反應(yīng)總體積根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)控，可以做2050µl以節(jié)約試劑；2. 將上表各成分加入到0.2ml或0.5ml滅菌的PCR薄壁管中；3. 如果不用PCR儀的加熱蓋，在反應(yīng)混合液的上層加30 50µl 的礦物油防止樣品在PCR的過(guò)程中蒸發(fā)；2 按以下條件進(jìn)行反應(yīng)StepTemperature, °CTime, minNumber of cyclesNote逆轉(zhuǎn)錄50301逆轉(zhuǎn)錄酶失活9421變性940.525-35退火37-650.5退火溫度比理論退火溫度大概低5°C

10、，再根據(jù)反應(yīng)結(jié)果優(yōu)化延伸72根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小Taq酶每分鐘延伸1000bp最終延伸72101反應(yīng)結(jié)束后，抽取擴(kuò)增樣品5µl，用瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增結(jié)果，用DNA marker判斷擴(kuò)增片段的大小或冷凍保存，以備以后分析使用。瓊脂糖核酸電泳1. 用蒸餾水將制膠模具和梳子沖洗干凈，放在制膠平板上，封閉模具邊緣，架好梳子；2. 根據(jù)欲分離DNA片段大小用凝膠緩沖液配制適宜濃度的瓊脂糖凝膠：準(zhǔn)確稱量瓊脂糖干粉，加入到配膠用的三角燒瓶?jī)?nèi)，定量加入電泳緩沖液（一般2030 ml）；3. 放入到微波爐內(nèi)加熱熔化。冷卻片刻，加入一滴熒光染料，輕輕旋轉(zhuǎn)以充分混勻凝膠溶液，倒入電泳槽中，待其凝固；4.

11、 室溫下3045分鐘后凝膠完全凝結(jié)，小心拔出梳子，將凝膠安放在電泳槽內(nèi)；5. 向電泳槽中倒入電泳緩沖液，其量以沒過(guò)膠面1mm為宜，如樣品孔內(nèi)有氣泡，應(yīng)設(shè)法除去；6. 在DNA樣品中加入10×體積的載樣緩沖液（loading buffer），混勻后，用槍將樣品混合液緩慢加入被浸沒的凝膠加樣孔內(nèi)；7. 接通電源，紅色為正極，黑色為負(fù)極，切記DNA樣品由負(fù)極往正極泳動(dòng) (靠近加樣孔的一端為負(fù))。一般60100V電壓，電泳2040min即可；8. 根據(jù)指示劑泳動(dòng)的位置，判斷是否終止電泳；9. 電泳完畢，關(guān)上電源，在凝膠成像儀上觀察電泳帶及其位置，并與核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker比較被擴(kuò)增產(chǎn)物的

12、大小。 瓊脂糖凝膠濃度與線形DNA的最佳分辨范圍瓊脂糖凝膠濃度線形DNA的最佳分辨范圍（bp）0.5%1,00030,0000.7%80012,0001.0%50010,0001.2%4007,0001.5%2003,0002.0%502,000膠回收純化DNA1. 瓊脂糖電泳，將特異電泳帶用刀切下放入到EP管中，稱瓊脂糖帶的重量；2. 按照每100mg加400µl的量加入binding buffer，放入到EP管振蕩器中，4555溫育振蕩，直到所有的瓊脂糖都溶解（大概要5分鐘）；3. 取出純化柱，將上述溶解液轉(zhuǎn)移至柱中，室溫下放置2分鐘，8,000rpm 離心1分鐘，棄EP管中的液

13、體，將純化柱放回EP管中；4. 加500µl的wash buffer至柱中，8,000rpm 離心1分鐘。棄管中的溶液；5. 重復(fù)操作4步的操作1次，最后將純化柱放入EP管中10,000rpm離心30秒，除去痕量的wash buffer；6. 將純化柱放入一個(gè)新的EP管。加3040µl H2O或者elution buffer至純化柱膜的中央，在37或50下放置2分鐘，10,000rpm離心1分鐘洗脫DNA，將EP管中的DNA溶液放在-20保存。7. 注：若想要不電泳而直接純化DNA溶液，只需要在第2步中按100µl液量加400µl的binding buf

14、fer,其余的步驟不變。血清制備1. 取血后，37oC下，讓血液凝固1到2小時(shí)（不加抗凝劑）；2. 4oC冰箱過(guò)夜（讓血塊固縮）；3. 當(dāng)血清自然析出后， 4oC，3000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，分離血清，棄去不溶物；4. 將血清移至一干凈試管，并分裝成小份，儲(chǔ)藏在-80oC。ELISA一、包被抗原1. 用50mM的碳酸鹽包被緩沖液（pH 9.6）溶解抗原，使抗原濃度為10-20 g/ml，加100 l/孔到96孔酶標(biāo)板，4 oC放置過(guò)夜。2. 第二天棄去包被液后，用PBST洗滌3次，每孔加入150 l 1 BSA 37 oC封閉1小時(shí)。3. PBST洗滌3次后，每孔加入100 l不同倍比稀釋度

15、的血清，并加入對(duì)照樣品，37 oC孵育2小時(shí)。4. PBST洗滌5次后，加入100l稀釋后的HRP標(biāo)記的二抗，37 oC孵育1小時(shí)。5. PBST洗滌5次后，顯色劑顯色20 min后，酶標(biāo)儀上讀取A405吸收值。二、包被細(xì)胞1. 在96孔培養(yǎng)板上接種細(xì)胞數(shù)為1 x 104 cells/well，37過(guò)夜培養(yǎng)。2. 第二天用PBS洗滌培養(yǎng)板2-3次。3. 加入125 µl/well 10% Formalin（1:10稀釋）, 室溫下固定15 min。4. 用ddH2O洗滌培養(yǎng)板3次，并晾干，儲(chǔ)藏在2-8oC備用。5. 用PBST洗滌3次，每孔加入150 l 1 BSA 37 oC封閉1

16、小時(shí)。6. PBST洗滌3次后，每孔加入100 l不同倍比稀釋度的血清，并加入對(duì)照樣品，37 oC孵育2小時(shí)。7. PBST洗滌5次后，加入100 l稀釋后的HRP標(biāo)記的二抗,37 oC孵育1小時(shí)。8. PBST洗滌5次后，顯色劑顯色20 min后，酶標(biāo)儀上讀取A405吸收值。l 50mM的碳酸鹽包被緩沖液：0.05mol/L pH9.6碳酸緩沖液,4，保存,Na2CO3 0.15克, NaHCO3 0.293克,蒸餾水稀釋至100 ml。l ABTS作為底物進(jìn)行顯色反應(yīng)(10ml)：² 0.2M Na2HPO4 2.4ml² 0.1M 檸檬酸2.6ml² ddH

17、2O 5ml² ABTS 5mg² H2O2(30%) 4 ul（用前加入）注 意：² 一般做倍比稀釋進(jìn)行檢測(cè)，需要有相應(yīng)的對(duì)照血清。² 不同的顯色系統(tǒng)對(duì)應(yīng)不同的光吸收值。組織病理技術(shù)組織處理：1. 取新鮮組織厚度不超過(guò)5mm，10% 中性福爾馬林固定，大于24小時(shí)。2. 固定后沖水12-24小時(shí)，3. 75%酒精， 1次，1小時(shí)，4. 85%酒精， 1次，1小時(shí)，5. 95%酒精， 3次，1小時(shí)，6. 100%酒精， 3次，1小時(shí)，7. 二甲苯， 2次，1小時(shí)，8. 石蠟浸泡， 3次，2小時(shí)，HE 染色： 水化1. 二甲苯， 2次，5-10分鐘，2.

18、100%酒精， 1次，1-2 分鐘，3. 95%酒精， 1次，1-2 分鐘，4. 85%酒精， 1次，1-2 分鐘，5. 75%酒精， 1次，1-2 分鐘，6. 過(guò)蒸餾水， 染色1. Mayer 氏蘇木素，1 分鐘，2. 溫水沖洗， 5-10 分鐘，3. 75% 鹽酸酒精， 1-2 分鐘，4. 自來(lái)水沖洗， 30 秒鐘，5. 依紅復(fù)染， 1-2 分鐘，6. 自來(lái)水洗， 30 秒鐘，7. 85%酒精， 1次，1-2 分鐘，8. 95%酒精， 2次，1-2 分鐘，9. 100%酒精， 2次，1-2 分鐘，10. 二甲苯， 2次，5-10分鐘，11. 中性樹膠封片。免疫組化染色一石蠟切片免疫組化染色

19、實(shí)驗(yàn)步驟： 1石蠟切片脫蠟至水：（石蠟切片染色前應(yīng)置60 1小時(shí)）。 （1）二甲苯I、II,各10分鐘。 （2）梯度酒精：100%，2分鐘® 95%，2分鐘® 80%，2分鐘® 70%2分鐘。 （3）蒸餾水洗：5分鐘，2次（置于搖床）。 2過(guò)氧化氫封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：3%H2O2，室溫10分鐘（避光）。 3蒸餾水洗：5分鐘，2次（置于搖床）。 4抗原修復(fù)：根據(jù)待檢測(cè)的抗原，選擇適當(dāng)?shù)姆椒?。附：抗原修?fù)液（10mM pH 6.0枸櫞酸鈉緩沖液）的配制 （1）儲(chǔ)備液的配制： A液：枸櫞酸三鈉-2H2O 29.41g + 蒸餾水1000ml B液：枸櫞酸 21g +

20、蒸餾水1000ml （2）工作液的配制：A液82ml + B液18ml + 蒸餾水900ml 抗原修復(fù)的方法：（1） 高壓鍋處理技術(shù)：枸櫞酸鈉緩沖液（10mM，PH6.0）,淹沒切片,蓋 上鍋蓋，高壓鍋內(nèi)煮沸,上汽3分鐘后緩慢冷卻（可用自來(lái)水在高壓鍋外沖，以助冷卻）。（2） 微波處理技術(shù):用塑料切片架,置于塑料或耐溫玻璃容器內(nèi)，枸櫞酸鈉緩沖液淹沒切片，選擇中高或高檔,5分鐘;取出并補(bǔ)充已預(yù)熱的枸櫞酸鈉緩沖液；再選擇中高或高檔,5分鐘.（最佳溫度為9295） （3）酶消化處理：此略。 抗原修復(fù)的注意事項(xiàng)： （1）組織不能干。 （2）選擇抗原修復(fù)方法要因抗體而異。 （3）該方法主要用于10%福爾馬

21、林固定、石蠟包埋組織。 （4）抗原修復(fù)后至DAB顯色的過(guò)程中，均需用PBS緩沖液。 5PBS：5分鐘，2次（置于搖床）。 6正常血清封閉：從染片缸中取出切片，擦凈切片背面水分及切片正面組織 周圍的水分（保持組織呈濕潤(rùn)狀態(tài)）,滴加正常山羊或兔血清（與第二抗 體 同源動(dòng)物血清）處理，37，15分鐘。 附：正常血清配制 (或按試劑盒規(guī)定的濃度配制) 按1:20比例,用PBS配制,每張切片需要量按50ml+5ml (10%拋灑量)計(jì)算。 7滴加第一抗體：用濾紙吸去血清，不洗，直接滴加第一抗體，37 2小時(shí) （也可置于4冰箱過(guò)夜）。 8PBS：5分鐘，2次（置于搖床）。 9滴加生物素化的二抗，37，40

22、分鐘。 10PBS：5分鐘，2次（置于搖床）。 11滴加三抗 （SAB復(fù)合物），37，40分鐘。 12PBS：5分鐘，2次（置于搖床）。 13DAB 顯色，鏡下觀察，適時(shí)終止（自來(lái)水沖終止）。 附：DAB的配制（1） 儲(chǔ)備液(DAB 25mg/ml)的配制：DAB 250mg + PBS 10ml，待完全溶解后分裝成 1ml,100ml,50ml，20ml等，20，凍存。 （2）工作液：DAB 儲(chǔ)備液20ml + PBS 1000ml + 3% H2O2 5ml 14自來(lái)水（細(xì)水）充分沖洗。 15蘇木素復(fù)染，室溫，30秒，自來(lái)水沖洗。 16自來(lái)水沖洗返藍(lán)，15分鐘。 17梯度酒精脫水： 80%

23、，2分鐘 ® 95%，2分鐘 ® 100%，2次，5分鐘。 18二甲苯透明： I，II（二甲苯）各5分鐘 19封片：加拿大樹膠（或中性樹膠）封片。Western Blot(免疫印跡法)主要包括以下4個(gè)基本步驟：n 樣品制備n 電泳分離n 蛋白的膜轉(zhuǎn)移n 免疫雜交與顯色蛋白檢測(cè)溶液和試劑n 1X 磷酸鹽緩沖液(PBS)n Modified RIPA buffer Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;PMSF: 1 mM ;Aprotinin

24、, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mMn 1X SDS 樣品緩沖液62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于 25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚藍(lán)n 轉(zhuǎn)移緩沖液25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇 (pH 8.3)n 10X Tris緩沖鹽 (TBS)準(zhǔn)備1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl調(diào)pH為 7.6n 脫脂奶粉或BSAn 甲

25、醇n TBS/T緩沖液1X TBS, 0.1% Tween-20n 封閉緩沖液（TBS/T）1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脫脂奶粉或BSAn 一抗的稀釋1X TBS, 0.1% Tween-20 加 5% BSA (多抗)或 5%脫脂奶粉(單抗)Note: 一般來(lái)說(shuō), BSA被推薦用于多克隆抗體，脫脂奶粉用于單克隆抗體，這樣可得到較高的信噪比。抗體的稀釋度參考抗體說(shuō)明書或根據(jù)實(shí)驗(yàn)確定。n 預(yù)染的蛋白質(zhì)Marker，可用于監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)膜的效率樣品制備原始樣品可為細(xì)胞、組織、培養(yǎng)上清、免疫沉淀或親和純化的蛋白，以下為定性檢測(cè)目的蛋白時(shí)細(xì)胞樣品的處理方法，其余的樣品制備方法參閱相

26、關(guān)文獻(xiàn)。1 培養(yǎng)細(xì)胞或藥物處理。2 棄培養(yǎng)基，用1X PBS漂洗細(xì)胞2次，去盡殘留培養(yǎng)基。3 加入1X SDS樣品緩沖液(6-well plate, 100 µl /w或 75 cm2 plate, 500-1000 µl/瓶)，刮落細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到Ep管。注意：冰上操作。4 超聲 1015秒剪切DNA以減低樣品粘性。5 煮沸樣品5 minutes。6 離心12000g, 5 min，取上清。7 電泳分離：上樣15µl20 µl 至 SDS-PAGE 膠 (10 cm x 10 cm)電泳。如要定量檢測(cè)某蛋白的表達(dá)水平，應(yīng)用RIPA裂解液(1 ml per

27、107 cells/100 mm dish/150 cm2 flask)裂解細(xì)胞，收集裂解液至離心管中，在振蕩器上混勻415min，14000g離心15min（4），棄沉淀，用Bradford法或其它蛋白質(zhì)測(cè)定方法測(cè)定上清中蛋白濃度以調(diào)整上樣體積和上樣量，進(jìn)行Western雜交時(shí)還需設(shè)置內(nèi)或外參照，通常用beta-actin。注意：一般上樣2030 µg已足夠，如待檢蛋白為低豐度蛋白，可加大上樣量至100µg，但電泳條帶易拖尾，可制備亞細(xì)胞組份或采用更敏感的檢測(cè)方法。電泳分離（參照SDS-PAGE電泳方法）轉(zhuǎn)膜雜交膜的選擇是決定Western blot成敗的重要環(huán)節(jié)。應(yīng)根據(jù)

28、雜交方案、被轉(zhuǎn)移蛋白的特性以及分子大小等因素，選擇合適材質(zhì)、孔徑和規(guī)格的雜交膜。用于Western blot的膜主要有兩種：硝酸纖維素膜(NC) 和PVDF膜。NC膜是蛋白印跡實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)固相支持物，在低離子轉(zhuǎn)移緩沖液的環(huán)境下，大多數(shù)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)會(huì)與膜發(fā)生疏水作用而高親和力的結(jié)合在一起，但在非離子型的去污劑作用下，結(jié)合的蛋白還可以被洗脫下來(lái)。根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，選擇不同孔徑的NC膜。因?yàn)殡S著膜孔徑的不斷減小，膜對(duì)低分子量蛋白的結(jié)合就越牢固。通常用0.45µm和0.2µm兩種規(guī)格的NC膜。大于20kD的蛋白可用0.45µm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2µm的膜了，如用0.45µm的膜就會(huì)發(fā)生“Blowthrough”的現(xiàn)象。PVDF膜靈敏度、分辨率和蛋白親和力比常規(guī)的膜要高，非常適合于低分子量蛋白的檢測(cè)。但PVDF膜在使用之前必需用純甲醇浸泡飽和1-