高蛋白飲食及大量蛋白尿?qū)β阅I功能衰竭大鼠的加重損害作用

1、高蛋白飲食及大量蛋白尿?qū)β阅I功能衰竭大鼠的加重損害作用    【摘要】  觀察高蛋白飲食及大量蛋白尿?qū)β阅I功能衰竭（chronic renal failure， CRF）大鼠的加重損害作用。方法:通過先用5/6腎切除大鼠法制作CRF動物模型，成功后再分別給予5/6腎切除大鼠不同蛋白飲食喂養(yǎng)2個月，制作有大量蛋白尿的CRF動物模型。生化檢測不同蛋白飲食喂養(yǎng)的5/6腎切除大鼠血尿素氮（blood urea nitrogen， BUN）、血清肌酐（serum creatinine， Scr）和24 h尿蛋白定量;放免檢測血內(nèi)皮素-1（endoth

2、elin-1， ET-1）、血栓素B2（thromboxane B2， TXB2）、6-酮-前列腺素Fl（6 ketone prostaglandin Fl， 6-Keto-PGFl）;分光光度計比色法檢測血和腎組織超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）、丙二醛（malondialdehyde， MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase， GSH-Px）水平。結(jié)果:高蛋白飲食及大量蛋白尿可通過加重CRF大鼠的血液動力學(xué)異常，升高TXB2和ET-1，降低血 6-keto -PGFl;減弱大鼠血SOD和GSH-Px的活性，加速腎損害。

3、結(jié)論:高蛋白飲食可通過導(dǎo)致5/6腎切除大鼠大量蛋白尿，影響腎臟血管活性物質(zhì)表達，降低5/6腎切除大鼠抗氧化能力而加速CRF的進展。 【關(guān)鍵詞】  腎功能衰竭， 慢性蛋白尿既是各種慢性腎臟病的主要臨床癥狀，又是慢性腎臟病進展的獨立危險因素之一。已有研究表明，沒有蛋白尿的腎小球腎炎，腎功能極少發(fā)生進行性衰退，大量蛋白尿?qū)δI臟具有直接損傷作用，可以使原有的腎小球損害逐漸加重，促使腎小球硬化的發(fā)生1。因此，研究高蛋白飲食及大量蛋白尿加重慢性腎功能衰竭（chronic renal failure， CRF）進展的作用，具有重要的臨床指導(dǎo)意義。本研究通過給予5/6腎切除大鼠高蛋白飲食，觀察高蛋白

4、飲食及大量蛋白尿?qū)RF大鼠的加重損害作用。1 材料與方法1.1 實驗動物及造模 成年雄性SD大鼠40只， 68 周齡，體質(zhì)量160190 g，由上海必凱實驗動物有限公司提供。大鼠在上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心分籠飼養(yǎng)，于12 h光照、45%左右相對濕度的普通設(shè)施中自由飲食。大鼠適應(yīng)1周后，隨機抽取 7只 作為正常對照組，其余33只為造模組，正常對照組給予自由進食及飲水。CRF模型制作參照文獻2進行，造模組先以苯巴比妥（100 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，然后以乙醚誘導(dǎo)麻醉，使大鼠仰臥，后肢交叉固定于手術(shù)臺上以暴露背部左腎區(qū)，從距左脊肋骨1.5 cm處作斜向外方切口。經(jīng)后腹膜取腎臟，暴露皮質(zhì)部

5、分并以剪刀切除，用明膠海綿壓迫止血片刻，再滴加數(shù)滴纖維蛋白原溶液或凝血酶溶液，稍等片刻，當(dāng)切面上不再有活動性出血后復(fù)位剩余左腎，縫合，1周后切除整個右腎，2次手術(shù)共切除腎臟約80%左右。2周后在大鼠尾靜脈采血測定血肌酐（serum creatinine Scr），造模組大鼠血肌酐明顯高于正常對照組為造模成功，共有27只造模成功。再根據(jù)造模組大鼠的血肌酐值將其分為模型組、中蛋白組和高蛋白組，每組9只，各組間血肌酐差異無統(tǒng)計學(xué)意義（ P >0.05）。模型組給予普通飼料喂養(yǎng);中蛋白組給予普通飼料+20%的蛋白喂養(yǎng);高蛋白組給予普通飼料+40%的蛋白喂養(yǎng)，各組均自由進食及飲水，共喂養(yǎng)2月。實驗

6、結(jié)束，模型組死亡1只，中蛋白組和高蛋白組均死亡2只。1.2 觀察指標 提前1周開始收集各組大鼠的蛋白尿檢測24 h尿蛋白定量，常規(guī)檢測血尿素氮（blood urea nitrogen， BUN）和Scr。采用放射免疫法于曙光醫(yī)院同位素室檢測血內(nèi)皮素-1（endothe-lin-1， ET-1）、血栓素B2（thromboxan B2， TXB2）和6-酮-前列腺素Fl（6 ketone prostaglandin Fl， 6-Keto-PGFl）。采用分光光度計比色法檢測血和腎組織超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）、丙二醛（malondialdehyde， M

7、DA）和谷胱甘 肽過氧化物酶（glutathione peroxidase， GSH-Px）含量（每克腎組織加入2 ml蒸餾水中）。1.3 腎組織勻漿制備 取下大鼠殘腎組織即刻制成10%的組織勻漿，標本測定過程均嚴格按說明書要求進行。1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)用 x ± s 表示，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，采用ANOVA過程進行多樣本兩兩比較的 q 檢驗。2 結(jié)果2.1 腎功能及蛋白尿變化 不同蛋白飼料喂養(yǎng) 2個 月后，各造模組BUN均明顯高于正常對照組（ P <0.05），各造模組之間隨著蛋白飲食的增加，BUN雖然有上升趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義;各造模組血肌酐和蛋白尿

8、值均明顯高于正常對照組 （ P < 0.01），高蛋白組的血肌酐及24 h蛋白定量均明顯高于模型組和中蛋白組（ P <0.05或 P < 0.01 ），模型組及中蛋白組24 h蛋白定量約為正常大鼠的10倍，而高蛋白組24 h蛋白定量約為正常大鼠的20倍，說明給予5/6腎切除大鼠高蛋白飲食，會使其24 h蛋白定量及血肌酐明顯升高，從而建立有大量蛋白尿的CRF動物模型。見表1。2.2 血管活性物質(zhì)變化 模型組、中蛋白組及高蛋白組的血ET-1和TXB2均明顯高于正常對照組（ P < 0.01），6-Keto-PGF l明顯低于正常對照組（ P < 0.01）;各造模組間

9、血ET-1有上升趨勢，而 6-Keto -PGF l有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義;而高蛋白組的血TXB2則明顯高于模型組及中蛋白組（ P <0.05），提示CRF大鼠存在血管活性物質(zhì)異常，且以TXB2異常更為明顯，大量蛋白尿可通過升高CRF大鼠的血TXB2從而加重腎功能衰竭。見表2。2.3 血氧化指標變化 各造模組血SOD和GSH-Px值明顯低于正常對照組（ P <0.05， P <0.01）;隨著蛋白飲食的增加，SOD和GSH-Px值下降，以高蛋白組最明顯，高蛋白組SOD和GSH-Px值明顯低于模型組（ P <0.05）。各造模組血MDA明顯高于正常對照組（ P &

10、lt;0.01），隨著蛋白飲食的增加，血MDA逐漸增加，以高蛋白組為甚，說明不同蛋白飲食喂養(yǎng)的CRF大鼠血氧化與抗氧化指標存在異常，以高蛋白組最嚴重，推測高蛋白飲食可明顯降低CRF大鼠的SOD和GSH-Px，增加血MDA，加重CRF。見表3。2.4 組織氧化指標變化 正常對照組大鼠腎組織的SOD和GSH-Px均明顯高于各造模組（ P < 0.05， P <0.01），隨著蛋白飲食的增加腎組織MDA有上升趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。中蛋白組腎組織SOD明顯低于模型組（ P <0.05）。     GSH-Px隨蛋白飲食的增加無明顯變化。見表

11、4。表1 不同蛋白飲食對CRF大鼠腎功能及蛋白尿的影響（略）Table 1 Effects of protein diet on renal function and proteinuria in CRF rats*P <0.05，*P <0.01， vs high-protein diet group;P <0.01， vs normal control group.表2 不同蛋白飲食對CRF大鼠血管活性物質(zhì)的影響（略）Table 2 Effects of protein diet on vasoactive substances in CRF rats*P <0.0

12、5， vs high-protein diet group;P <0.05，P <0.01， vs normal control group.表3 不同蛋白飲食對CRF大鼠血氧化指標的影響（略）Table 3 Effects of protein diet on oxidation indexes of blood in CRF rats*P <0.05， vs high-protein diet group;P <0.05，P <0.01， vs normal control group.表4 不同蛋白飲食對CRF大鼠腎組織氧化指標的影響（略）Table 4 E

13、ffects of protein diet on oxidation indexes of renal tissue in CRF rats*P <0.05， vs untreated group;P <0.05，P <0.01， vs normal control group.3 討論 蛋白尿?qū)δI小球的直接損害，是由于通過腎小球毛細血管的蛋白導(dǎo)致腎小球系膜擴張，而引起腎 小球濾過面積和濾過率下降。大量蛋白尿?qū)δI小球上皮細胞及系膜細胞的內(nèi)在毒性作用表現(xiàn)在腎小球超濾液中大量蛋白尿可引起上皮細胞的形態(tài)改變，如足突融合和消失，繼而出現(xiàn)持續(xù)性結(jié)構(gòu)和功能改變，包括腎小球的變性、壞死和

14、上皮細胞從基底膜分離，腎小球硬化，且蛋白尿的大量漏出，使近端小管細胞蛋白負荷過重，小管細胞膨脹、破裂而釋放出溶酶體酶導(dǎo)致小管間質(zhì)損害及纖維化，導(dǎo)致CRF3。進一步研究顯示，過量的蛋白在腎小管上皮細胞的沉積可刺激某些生長因子如血小板源生長因子（platelet-derived growth factor， PDGF）以及轉(zhuǎn)化生長因子等的產(chǎn)生，這些細胞因子可引起腎小管上皮細胞的活化、大量膠原的產(chǎn)生和間質(zhì)細胞的增殖，最終導(dǎo)致間質(zhì)纖維化和CRF的出現(xiàn)4?？梢姡叩鞍罪嬍臣按罅康鞍啄蚩芍苯訐p害腎小球和腎小管而加重腎損害。已知ET是一種具有很強的含21個氨基酸、分子量為2 492 D的血管收縮小分子活性肽

15、。在CRF大鼠及患者血、尿及腎組織局部ET-1含量增高，可加重腎臟損害:（1）ET對血管有強大的收縮作用，而腎血管對ET的反應(yīng)尤為敏感。ET對腎小球出球動脈的收縮作用強于入球動脈，從而使腎小球毛細血管內(nèi)壓升高，還可收縮腎小球系膜細胞使腎小球濾過面積和超濾系數(shù)減少，并可劑量依賴性地減少腎血流量，降低腎小球濾過率5;（2）ET-1促進血管平滑肌及腎髓質(zhì)間質(zhì)細胞增殖及間質(zhì)纖維化，直接或間接刺激醛固酮分泌，影響腎素活性及促炎癥作用6。血栓素A2（thromboxane A2， TXA2）和前列環(huán)素I2（prostacyclin I2， PGI2）均系花生四烯酸的代謝產(chǎn)物。正常時保持動態(tài)平衡，對維持血小

16、板功能、保護血管和防止血栓形成具有重要意義，因而PGI2與TXA2是調(diào)節(jié)血小板及血管壁機能狀態(tài)的兩個生物學(xué)對立面。PGI2可拮抗內(nèi)皮素所引起的腎血管收縮，有負反饋調(diào)節(jié)作用。血管損傷可引起TXA2等致炎因子釋放，這些炎癥介質(zhì)大多能刺激ET的合成和分泌，而ET又可促進TXA2、白細胞介素6 （interleukin -6， IL-6）等炎癥介質(zhì)的生成7，8。TXB2和6-Keto-PGF1為TXA2和PGI2的終末代謝產(chǎn)物，可反映TXA2和PGI2兩者水平。若TXA2增多和（或）PGI2減少，TXA2/PGI2比值升高，可導(dǎo)致血小板活化增強和血管收縮，促進血栓形成和血管損傷9，10。本研究中各造模

17、組大鼠的血ET-1以及模型組、高蛋白組的TXB2明顯高于正常對照組，而造模組的6-Keto-PGF1明顯低于正常對照組，且隨著蛋白飲食的增加模型大鼠血ET-1有上升趨勢，而6-Keto-PGF1則有下降趨勢，TXB2在高蛋白組上升更明顯，明顯高于模型組及中蛋白組，表明CRF各造模組大鼠均存在血管活性物質(zhì)的異常，而高蛋白飲食使腎 臟血管活性物質(zhì)異常表達更明顯?？梢姼叩鞍罪嬍晨赏ㄟ^加重CRF大鼠血管活性物質(zhì)異常表達，而加速腎臟的病理進程。在正常情況下腎組織內(nèi)大約1%2%的氧發(fā)生單電子轉(zhuǎn)移形成自由基，因腎組織內(nèi)含有豐富的SOD、過氧化氫酶、GSH-Px及其他抗氧化物質(zhì)，產(chǎn)生的自由基很快被清除。因此腎

18、組織內(nèi)抗氧化能力與不斷產(chǎn)生自由基的氧化能力之間保持著動態(tài)平衡，不引起腎組織損傷11。本研究結(jié)果表明，各造模組血SOD、GSH-Px值明顯低于正常對照組（ P <0.05， P <0.01），隨著蛋白飲食的增加，SOD和GSH-Px值下降，以高蛋白組最明顯。高蛋白組SOD和GSH-Px值明顯低于模型組（ P <0.05）。各造模組血MDA明顯高于正常對照組（ P <0.01），隨著蛋白飲食的增加，血MDA逐漸增加，以高蛋白組為重，說明不同蛋白飲食喂養(yǎng)的CRF大鼠血存在氧化與抗氧化能力動態(tài)平衡異常，以高蛋白組最嚴重。但組織的變化不明顯，正常對照組大鼠腎組織的SOD和GSH-Px均明顯高于各造模組（ P <0.05， P <0.01），隨著蛋白的增加腎組織MDA有上升趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。造成這一現(xiàn)象的原因可能與各造模組大鼠組織氧化物質(zhì)變化首先表現(xiàn)于血液，隨著病程的進展，組織病變?nèi)找鎳乐?，因此增加實驗周期可能有助于檢測組織氧化物質(zhì)的變化。上述情況說明不同蛋白飲食喂養(yǎng)的CRF大鼠存在氧化和抗氧