人腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

1、    人腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建        【摘要】目的構(gòu)建人腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因NM23-H1與真核表達(dá)載體PcDNA3.1/Zero的重組體。方法利用分子生物學(xué)克隆技術(shù)從質(zhì)粒puc18中酶切回收900bp的人NM23-H1基因片段，與PcDNA3.1/Zero構(gòu)成重組體，并根據(jù)表達(dá)載體與克隆基因核苷酸序列中酶切位點(diǎn)分析、鑒定插入片段的正反連接。結(jié)果酶切得到900bp的NM23-H1基因片段，5.0kb質(zhì)粒載體，兩者相連構(gòu)建成重組體PcDNA.NM23，利用

2、Pst酶切位點(diǎn)確認(rèn)PstI酶切后得到4條帶的重組體為正向連接。結(jié)論人真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒PcDNA.NM23成功構(gòu)建，為卵巢癌基因治療提供了部分實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。【關(guān)鍵詞】人腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因基因重組 STRUCTURE OF RECOMBINANT FROM HUMANNON-METASTATIC GENE AND MAMMALIANEXPRESSING VECTOR PcDNA3.1/ZeroWen Jie*, Zhang Shifu, Li Shourou*(Department of Cell Biology, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS, B

3、eijing;*Department of Gynecology and Obstetrics, The Second Clinical Hospital, Bethune Medical College, Changchun)【Abstract】 Objective To develop a somatic gene therapy system for ovarian carcinoma treatment, we constructed a human non-metastatic gene(NM23-H1) expressing vector in ovarian carcinoma

4、cells. Methods PUC18-NM23-H1 was treated with BamH1 to release the 900bp fragment. PcDNA3.1/Zero was digested with BamH1, releasing a 5.0kb fragment, NM23-H1(0.9kb) fragment was ligated to the vector PcDNA3.1/Zero(5.0kb). Results 900bp fragment and 5.0kb vector obtained by BamH1 digesting were conne

5、cted with T4 DNA ligase to produce recombinant PcDNA.NM23. According to the enzymatic site Pst, the positive oriention of the recombinant could be digested into four different fragments by Pst. Conclusion The successful construction of PcDNA*NM could provide a rational basis for the gene therapy of

6、ovarian carcinoma.【Key words】 Human non-metastatic gene; DNA recombination卵巢癌是難于早期診斷的婦科惡性腫瘤，大部分病例診斷時(shí)已存在廣泛的微小轉(zhuǎn)移，給手術(shù)、化療帶來(lái)很大困難，以致死亡率居高不下。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們?cè)O(shè)想利用腫瘤抑制基因治療卵巢癌。NM23-H1基因是近幾年來(lái)克隆出的與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的抑癌基因1。國(guó)外已有報(bào)道轉(zhuǎn)染人NM23-H1的乳腺癌細(xì)胞有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的能力2。本研究策略是利用分子生物學(xué)技術(shù)將帶有人NM23-H1基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染高轉(zhuǎn)移卵巢癌細(xì)胞HO-89103，探討其對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用，為卵巢

7、癌基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本文報(bào)道NM23-H1表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其鑒定。材料和方法1.質(zhì)粒、菌株和試劑質(zhì)粒puc18含有人NM23-H1全長(zhǎng)cDNA序列基因，由北京醫(yī)科大學(xué)病理室贈(zèng)送，質(zhì)粒pcDNA3.1/Zero(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室黃炳仁教授贈(zèng)送)，大腸桿菌DH5由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供，各種限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶等分別購(gòu)自Promega公司、Sigma公司，其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?.重組體的構(gòu)建2.12.2質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶解及片段回收：酶解緩沖體系為50100l，DNA<100ng，限制性內(nèi)切酶為35IU/l，置37水浴反應(yīng)1h。酶解后在1.0%

8、瓊脂糖凝膠上電泳，并用DEAE纖維素紙插片法回收DNA片段。3.DNA重組3.1帶有插入片段的重組體篩選：感受態(tài)菌的制備、轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)按常規(guī)方法進(jìn)行4。隨機(jī)挑選轉(zhuǎn)化單菌落培養(yǎng)后小量制備質(zhì)粒DNA，采用限制性內(nèi)切酶結(jié)合質(zhì)粒酶切譜篩選陽(yáng)性克隆。3.2重組體正反向連接鑒定：選擇插入片段及表達(dá)質(zhì)粒上共有的，且不同于連接位點(diǎn)的酶切點(diǎn)Pst對(duì)重組進(jìn)行酶切，根據(jù)酶切片段大小，鑒定正、反向連接。結(jié)果和討論1.重組體的構(gòu)建及篩選從puc18上用BamH1切下0.9kb左右的人NM23-H1基因片段，DEAE纖維素紙插片法回收0.9kb基因片段，再以BamH1酶切表達(dá)質(zhì)粒PcDNA3.1/Zero。將上述兩酶切產(chǎn)物進(jìn)

9、行連接，重組體命名為PcDNA.NM。(1)     將此重組體PcDNA.NM轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，用BamH1對(duì)重組體進(jìn)行酶切鑒定，在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳可得2條大小分別為5.0kb、0.9kb片段，與原質(zhì)粒插入片段大小一致。結(jié)果見(jiàn)2。2質(zhì)粒PcDNA.NM酶切鑒定Fig.2 Identification of the plasmid PcDNA.NM.NM/BamH14.PUC18-NM23-H15.PUC18-NM23-H1/BamH1          2.重組體

10、正、反向連接的鑒定分析人NM23-H1核苷酸序列及表達(dá)載體PcDNA3.1/Zero的多克隆酶切位點(diǎn)，選擇Pst酶切鑒定。人重組體插入片段中含有3個(gè) Pst酶切位點(diǎn)，正向連接酶切后可得4條大小分別為5.0kb、66bp、324bp、508bp左右4個(gè)片段，結(jié)果見(jiàn)3，反向連接酶切后可得大小為5.3kb、324bp、66bp、183bp4個(gè)片段，與理論相符。測(cè)定正向重組序列與文獻(xiàn)一致5，未發(fā)現(xiàn)堿基缺失或突變。然后大量制備質(zhì)粒，以便下一步轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞。3質(zhì)粒PcDNA.NM酶切鑒定正向連接Fig.2 Identification of the orientation of therecombina

11、nt with restriction enzymes1.DNA marker DNA/Hind2.PcDNA.NM/Pst3.PcDNA.NM4.pBR322/BstN          本課題目的是獲得能夠在人卵巢癌細(xì)胞中高表達(dá)的NM23-H1質(zhì)粒。因此我們選擇了帶有CMV啟動(dòng)子的高表達(dá)載體PcDNA 3.1/Zero用于重組體的構(gòu)建。從Puc18上獲得的nm23|H1基因片段兩端均為BamH1酶切位點(diǎn)，因此構(gòu)建中存在正反連接問(wèn)題。本研究根據(jù)目的基因核苷酸序列酶切位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)該序列中存在另外一個(gè)與PcDNA3.1/Zero表達(dá)質(zhì)粒相同的酶切位點(diǎn)PstI，所以選擇再一次酶切，根據(jù)酶切片段數(shù)目、大小即可鑒定正向性連接。就本實(shí)驗(yàn)研究中所用載體及目的基因來(lái)看，兩次選用兩種不同的酶酶切重組體篩選克隆，鑒定正反連接簡(jiǎn)便快捷。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)也體會(huì)到重組體構(gòu)建中，表達(dá)質(zhì)粒PcDNA/Zero BamH1酶切后為線狀質(zhì)粒DNA，先用牛小腸堿性磷酸酶(ALP)去磷酸化，然后與目的基因片段連接，可以減少載體自連，提高連接效率。卵巢癌是高轉(zhuǎn)移腫瘤，臨床上化療、手術(shù)等方法都不能徹底根治轉(zhuǎn)移。研究與卵巢癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，可以從分子水平更深入探討轉(zhuǎn)移機(jī)制、抑制轉(zhuǎn)移的方法，進(jìn)而改變卵巢癌治療