Bax基因誘導(dǎo)鼻咽癌細胞中相關(guān)基因

1、Bax基因誘導(dǎo)鼻咽癌細胞中相關(guān)基因的mRNA差異顯示分析中國生物工程雜志China Biotechnology, 2006, 26(2):6973董加喜1*李運南1陳鄖東1馬澗泉2( 1廣州市微生物研究所廣州5102502 中山大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院廣州51000 )摘要目的：應(yīng)用差異顯示技術(shù)，篩選鼻咽癌相關(guān)基因的異常表達。方法：選用連接有bax基因的真核表達質(zhì)粒pSFFVbaxneo, 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法, 將其轉(zhuǎn)染到CNE2細胞中, 以轉(zhuǎn)染有空載的pSFFV neo 質(zhì)粒的CNE2細胞為對照, 采用Trizol試劑快速抽取法, 提取mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,用錨式引物和隨機引物進行PCR擴增, 加入

2、同位素, 用6%的測序變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳PCR產(chǎn)物進行分離。切下聚丙烯酰胺凝膠上明顯的6條差異帶, 回收差異cDNA, 進行第二次PCR擴增, 經(jīng)低溶點瓊脂凝膠回收, 獲取大量PCR擴增的差異cDNA片段，同位素標記作為探針, 抽取RNA, 進行點樣, 雜交, 洗膜放射自顯影等步驟, 進行細胞RNA的Northern印跡斑點雜交。結(jié)果：表明4條cDNA片段均為CNE2細胞表達片段。結(jié)論：發(fā)現(xiàn)bax可誘導(dǎo)CNE2細胞中有某些相關(guān)基因表達，并抑制了CNE2細胞某些相關(guān)基因表達。關(guān)鍵詞bax基因鼻咽癌細胞差異顯示技術(shù)中圖分類號Q819收稿日期：20050825修回日期：20051209* 電子

3、信箱：Sddongjx本文采用mRNA差異顯示技術(shù)去觀察bax基因?qū)NE2細胞的誘導(dǎo)表達而產(chǎn)生的差異情況, 并檢測出bax基因誘導(dǎo)鼻咽癌CNE2細胞表達的差異相關(guān)基因, 從而探討bax基因誘導(dǎo)細胞凋亡的可能機制1，為進一步研究這些基因的功能作準備。1材料和方法1.1材料baxneo、pSFFV neo和宿主菌JM109：均由中山大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院生物化學(xué)教研室張清秀博士提供。p32dATP：購于北京亞輝生物公司。1.2方法。形成2天1代，用0.25%胰酶消化, 吹打分散細胞, 將1瓶分作3瓶, 待細胞長至七成滿, 用于轉(zhuǎn)染。baxneo、pSFFV neo轉(zhuǎn)染入鼻咽癌CNE2細胞株, 采用常規(guī)的脂

4、質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。baxneo、pSFFV neo質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CNE2細胞總RNA的抽?。喊?Trizol試劑使用說明書提供的方法進行。lDEPC處理蒸餾水溶解RNA, 測A260進行RNA定量，-20保存, 取5l電泳觀察結(jié)果。g/l) 2.0l, 錨式引物(AP)2.0l, 混勻, 70, 5min, 冰上冷卻 5min, 各管再按下述操作, 5×buffer 4.0l, dNTA(250mol/L) 2.0l, DTT(100mol/L) 2.0l, MMLV(200mol/L) 2.0l, H2O 7.8l, 各管總體積20l, 混勻, 加消毒石蠟油30l, 37或42水浴1h, 轉(zhuǎn)入

5、70,15min, 4保存。2006, 26(2)董加喜 等： Bax基因誘導(dǎo)鼻咽癌細胞中相關(guān)基因的mRNA差異顯示分析中國生物工程雜志 China Biotechnology Vol.26 No.2 2006×buffer 1.0l, MgCl2(50mmol/L) 0.75l, dNTA(250mol/L)2.0l, 5ARP(2mol/L) 1.75l, 3AP(2mol/L)1.75l, ap23dATP 0.55l, 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.0l，Taq酶(5U/l) 0.2l, 振蕩混勻各管, 離心, 各加30l石蠟油，置PCR儀中反應(yīng)。×TBS 12ml, 置45水浴攪

6、拌10min, 使尿素全部溶解, 定容為60ml, 加TEMED 35ml, 新配制10%過硫酸銨250l, 混勻, 灌膠, 凝聚3h后, 在1200V 電壓下預(yù)電泳30min。上樣。上樣操作程序為：吸取上述PCR 樣品5l, 加上樣緩沖液1l, 沸水浴10min, 冰浴5min, 離心。電泳條件為：室溫下, 電壓1200V, 電泳3h，關(guān)閉電泳。將凝膠轉(zhuǎn)移至3m濾紙上, 用保鮮膜包被凝膠, 放入干燥機上, 80, 抽直空干燥1h,標記定位后, 將凝膠和X光片一冊同時放入膠片盒，-20曝光120h，用沖片機沖洗X光片, 比較不同組別表達差異帶。l蒸餾水的離心管中, 浸泡10min。蓋上離心管蓋

7、, 100水浴15min。4, 5000r/min, 離心5min, 上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管。加入10l 3mol/L醋酸鈉, 5l糖原(10g/ml)及450l無水乙醇, 置-80過夜。4,20000r/min, 離心30min, 去上清, 沉淀用85%乙醇漂洗, 室溫干燥去乙醇。用15l蒸餾水溶解DNA，-20貯存。2次PCR：取0.5ml離心管6支, 每管按下述操作， 10×buffer 4.0l, MgCl2 (50mmol/L) 1.2l, dNTP(250m mol/L)3.2l, 錨試引物(AP.2mol/L) 4.0l, 隨機引物(ARP.2mol/L) 4

8、.0l, 上述回收差異帶cDNA液 6.0l, Taq酶(5.0U/l) 0.4l, H2O 17.2l, 反應(yīng)總體積為 40l, 振蕩混勻各管, 離心, 各加50l消毒石蠟油,置PCR儀中反應(yīng)。PCR循環(huán)條件同前。baxneo所誘導(dǎo)表達或其抑制表達的相關(guān)基因, 本文分別利用己分離獲得的差異cDNA作為探針, 對細胞RNA進行了Northern印跡斑點雜交, 方法是, 細胞RNA的抽取同前。隨機引物法標記差異cDNA探針：模板DNA 2l(25mg), 隨機引物(690) mer (1mmol/L) 2l, H2O 10l, 95加熱3min, 立即水上冷卻, 5min, 10×Ke

9、now buffer 2.5l, dNTP(0.2mmol/L dATP、dGTP、dTTP)2.5l, 111TBq/mmolap23dCTP 5l, Kenow酶 1l, Total 25l, 37水浴, 3h, 65水浴, 5min。將各反應(yīng)管分別過G50層析柱, 收集流出組分。點樣：將尼龍膜浸泡在20×SSC浴液中30min, 再用10×SSC裝滿加樣孔, 抽干重新裝滿抽干。待測細胞RNA加入2倍體積20×SSC , 抽干樣孔, 加樣后抽干, 用10×SSC裝滿抽干2次, 繼續(xù)抽干5min, 80干烤1h，備用。雜交：將上述尼龍膜標記后, 放入預(yù)

10、雜交液中42 20min, 用液量為0.1ml/cm2膜。雜交：分別將32P 標記的各探針液加入預(yù)雜交液中, 混勻, 42 0.52h,加入探針量為05pmol/ml。洗膜：用100ml 2×SSPE, 0.1%SDS 在室溫下洗膜2次,5min/次。用洗膜液I、洗膜液II、在室溫下洗膜2次，20min/次。顯影：壓片、沖片。2結(jié)果2.1pSFFVbaxneo和pSFFVneo細胞株（圖1、2、3）圖1 G418篩選第3天大量CNE2細胞死亡×200Fig.1Most dead CNE2 cells screened by G418 three days later圖2G4

11、18篩選第7天有成活的獨立細胞×200Fig.2Survival cells screened by G418 seven days later圖3G418篩選第10天形成的CNE2細胞克隆×200Fig.3Formed CNE2 cell clones screened by G418 ten days later上述抽取的總RNA, 經(jīng)過RTPCR后, 進行多次差異顯示技術(shù), 并在同一條件下重復(fù)實驗, 從DNA聚丙烯凝膠電泳的放射自顯影的X光片可發(fā)現(xiàn)2株CNE2有差異基因表達, 最終發(fā)現(xiàn)有10條明顯的基因表達水平存在差異,其中由pSFFVbaxneo誘導(dǎo)CNE2細胞基因

12、表達的差異帶有4條, 在pSFFVbaxneo的CNE2細胞中不被表達的差異帶有6條。具體表現(xiàn)在由錨鏈引物AP3和隨機引物ARP3組合進行PCR擴增, 產(chǎn)生在pSFFVbaxneo的CNE2細胞中有2條明顯基因表達的差異帶, 而在pSFFVneo的CNE2細胞中表達, 在pSFFVbaxneo的CNE2細胞中不表達的差異帶有3條（圖4）。錨鏈引物AP1和隨機引物ARP3組合進行PCR擴增, 在膠片上出現(xiàn)pSFFVbaxneo的CNE2細胞有2條明顯基因表達的差異帶（圖5）。錨鏈引物AP2和隨機引物ARP4組合進行PCR擴增。在膠片上出現(xiàn)pSFFVbaxneo的CNE2細胞不表達, 而在pSFF

13、Vneo的CNE2細胞中表達3條差異帶（圖6）。圖4AP3、ARP3組合擴增的電泳差異圖A泳道：轉(zhuǎn)染有pSFFVbaxneo的CNE2差異圖;B泳道：轉(zhuǎn)染有pSFFV neo的CNE2差異圖; ：差異帶Fig.4Combined amplification of AP3 and APR3圖5AP1、ARP3組合擴增的電泳差異圖A泳道：轉(zhuǎn)染有pSFFVbaxneo的CNE2差異圖; B泳道：轉(zhuǎn)染有pSFFV neo的CNE2差異圖; ：差異帶Fig.5Combined amplification of AP1 and APR3圖6AP2、ARP4組合擴增的電泳差異圖A泳道：轉(zhuǎn)染有pSFFVbax

14、neo的CNE2差異圖；B泳道：轉(zhuǎn)染有pSFFV neo的CNE2差異圖； ：差異帶Fig.6Conbined amplification of AP2 and APR42.2二次PCR在將10個有差異顯示的帶從凝膠上選擇切下6條最明顯的條帶, 進行PCR, 發(fā)現(xiàn)有4個條帶能擴增出PCR產(chǎn)物, 另有2條則沒有PCR條帶出現(xiàn)。2.3Northern 印跡斑點雜交將抽取pSFFVbaxneo的CNE2細胞和pSFFV neo的CNE2細胞中的RNA與低熔點瓊脂糖凝膠回收的差示cDNA, 經(jīng)32P同位素標記成探針, 分別與對應(yīng)細胞的RNA進行雜交。在放射自顯影的X片上有印跡斑點出現(xiàn), 本實驗所得到的

15、cDNA均為CNE2細胞表達的cDNA片段（圖7）。圖7差示cDNA Northern 印跡斑點雜交圖Fig.7cDNA Northern blot of differentially expressed genes3討論凋亡bax基因是Oltvai1在1993年發(fā)現(xiàn)的一種bcl2相關(guān)基因; 長為4.5kb, 含有6個外顯子, 編碼3種蛋白質(zhì)1。在體內(nèi)有較廣泛的分布, 說明bax可能是比較重要的凋亡調(diào)節(jié)基因2 。研究發(fā)現(xiàn)bax的分布與細胞的分化有關(guān), 如與正常大腸粘膜表層上皮細胞的正常脫落及隱窩底部上皮的增生一致2，還發(fā)現(xiàn)鼻咽良性上皮多數(shù)有bax表達, 上皮表層細胞基質(zhì)層表達增強, bax表達

16、與腫瘤發(fā)生有關(guān), Bargou等3觀察到正常乳腺細胞系和乳腺組織中bax出現(xiàn)高表達, 而在癌細胞系和惡性乳腺細胞中bax表達降低或消失，郭琳瑯等4研究發(fā)現(xiàn)鼻咽良性上皮有較高bax表達, 鼻咽癌組織中bax表達減少, 且組織分化程度越低, bax表達減少,顯示bax異常表達可能與鼻咽上皮癌變有關(guān)。因而本文是將bax連接在pSFFVneo真核表達質(zhì)粒中5，轉(zhuǎn)人鼻咽癌CNE2細胞中去探討bax對CNE2的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)bax可誘導(dǎo)CNE2細胞中有某些相關(guān)基因的表達, 還抑制了CNE2細胞某些相關(guān)基因表達。隨著有關(guān)腫瘤發(fā)生機制的研究有了較深入的發(fā)展, 癌基因和抑癌基因理論的提出6,7，使人們認識到腫瘤

17、的發(fā)生是基因表達失調(diào)的結(jié)果, 因而探索腫瘤發(fā)生的分子生物學(xué)基礎(chǔ), 尋找出腫瘤細胞與正常細胞或腫瘤細胞不同影響因素中不同表達的基因, 發(fā)現(xiàn)新的癌基因和抑癌基因, 已成為當今腫瘤研究的一個方向8 ；1992年Liang及Pardee等首創(chuàng)了信使RNA差異顯示技術(shù), 為腫瘤分子生物學(xué)研究提供了良好的途徑。mRNA差異顯示技術(shù)(DDPCR)基本原理9是將基因背景相同的2個或幾個細胞系或組織mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA, 用不同引物對, 進行PCR擴增, 擴增時加入同位素, 用測序膠電泳將PCR產(chǎn)物進行分離, 在放射自顯影上即可找出差異表達基因的被擴增片段。DDPCR在理論上十分簡捷明了, 但在實際應(yīng)用中卻

18、存在著許多的問題1，其中最主要是：DDPCR中, PCR產(chǎn)物極多, 幾乎所有模板的啟動均有引物的錯配; DDPCR技術(shù)會產(chǎn)生假陽性條帶。本研究為了克服這些問題, 選用了貝克曼公司的DDPCR引物體系1012，因本引物體系經(jīng)改進設(shè)計, 很好地解決了上述問題, 明顯增加了DDPCR的可靠性, 使我們利用DDPCR篩選鼻咽癌CNE2細胞差異表達基因的效率大大提高。具體表現(xiàn)在如下幾個方面：其一, 3錨鏈引物，長度為31個堿基, 每個錨鏈引物使用2個非dT堿基來促進引物配對和合成不同的mRNA亞群的cDNA第一鏈。這將顯著地降低cDNA的數(shù)量, 明顯提高了每道DDPCR膠中片段的分辨率; 并減少了錯配率

19、。而且由于DDPCR中參與競爭引物和其他試劑的片段數(shù)量減少, 兩核苷酸錨鏈設(shè)計可將稀少的mRNA種類轉(zhuǎn)變成cDNA片段而顯現(xiàn)在DDPCR膠上。又因錨鏈引物還含有部分T7RNA聚合酶啟動子, 因此每一個cDNA片段切割回收, 再擴增后可直接合成放射性標記的反義RNA或者直接測序而無需將片段克隆在質(zhì)粒載體上。其二, 5隨機引物, 長度為26堿基, 明顯長于過去DDPCR所用的引物長度, 因而這種隨機引物配對位點的選擇缺乏絕對的嚴格性, 使得每種cDNA的第一鏈合成不止一個引物配對位點, 這就保證了每種mRNA至少有一個對應(yīng)的雙鏈cDNA片段, 并通過電泳而在DDPCR膠上顯示出來; 這些隨機引物的

20、靈活性為其提供了相互重疊的機會, 從而避免了隨機引物配對區(qū)域覆蓋的空白區(qū)。cDNA片段從DDPCR膠上切下后, 可用M13(48)的24mer反向引物再擴增。這樣就能對原轉(zhuǎn)錄子編碼鏈從5端單向測序。其三：引物長度，錨引物和隨機引物明顯長于以前DDPCR所用引物，這可提高DDPCR退火溫度, 從而避免錯誤引物配對產(chǎn)生假陽性。本實驗結(jié)果顯示在4條錨引物和4條隨機引物配對進行擴增的電泳結(jié)果, 在膠上只呈現(xiàn)10條明顯差異帶, 其中擴增出的4條差異帶經(jīng)Northern印跡斑點雜交, 均有印跡斑點, 說明本研究己克服了DDPCR中PCR產(chǎn)物多和假陽性條帶的缺點。參考文獻1 Oltvai Z N, Mill

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27、nce to DemonstrateDONG Jiaxi1LI Yunnan1CHEN Yundong1MA Jianquan2(1 Guangzhou Microbiology Research InstituteGuangzhou510250, China)(2 Medcollege of Sun YatSen UniversityGuangzhou510000, China)AbstractObjective ：To look for the correlated gene of CNE2 cell after bax gene transfection. Method: In CNE2 cell after bax gene transfection analysed by mRNA defference to demonstrat