稀釋培養(yǎng)測數(shù)法

1、稀釋培養(yǎng)測數(shù)法（MPN）一、實驗?zāi)康耐ㄟ^對好氣性自生固氮菌的計數(shù)，了解稀釋培養(yǎng)計數(shù)（MPN）的原理和方法。二、實驗原理     &n一、實驗?zāi)康耐ㄟ^對好氣性自生固氮菌的計數(shù)，了解稀釋培養(yǎng)計數(shù)（MPN）的原理和方法。二、實驗原理       最大或然數(shù)(most probable number，MPN)計數(shù)又稱稀釋培養(yǎng)計數(shù)，適用于測定在一個混雜的微生物群落中雖不占優(yōu)勢，但卻具有特殊生理功能的類群。其特點是利用待測微生物的特殊生理功能的選擇性來擺脫其他微生物類群的干擾，并通過該生理功能的表現(xiàn)來判斷該類群微生物的

2、存在和豐度。本法特別適合于測定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化、纖維素分解、固氮、硫化和反硫化細(xì)菌等。見附表23-1）的數(shù)量和檢測污水、牛奶及其他食品中特殊微生物類群（如大腸菌群）的數(shù)量，缺點是只適于進(jìn)行特殊生理類群的測定，結(jié)果也較粗放，只有在因某種原因不能使用平板計數(shù)時才采用。  MPN計數(shù)是將待測樣品作一系列稀釋，一直稀釋到將少量（如lm1）的稀釋液接種到新鮮培養(yǎng)基中沒有或極少出現(xiàn)生長繁殖。根據(jù)沒有生長的最低稀釋度與出現(xiàn)生長的最高稀釋度，采用“最大或然數(shù)”理論，可以計算出樣品單位體積中細(xì)菌數(shù)的近似值。具體地說，菌液經(jīng)多次10倍稀釋后，一定量菌液中細(xì)菌可以極少或無菌，然后每個

3、稀釋度取35次重復(fù)接種于適宜的液體培養(yǎng)基中。培養(yǎng)后，將有菌液生長的最后3個稀釋度（即臨界級數(shù)）中出現(xiàn)細(xì)菌生長的管數(shù)作為數(shù)量指標(biāo)，由最大或然數(shù)表（見附錄九）上查出近似值，再乘以數(shù)量指標(biāo)第一位數(shù)的稀釋倍數(shù)，即為原菌液中的含菌數(shù)。如某一細(xì)菌在稀釋法中的生長情況如下；    稀釋度          lO-3    10-4    10-5    lO-6    1

4、0-7   10-8    重復(fù)數(shù)           5      5      5      5      5     5    出現(xiàn)生長的管數(shù)   5&#

5、160;     5      5      4      1     0    根據(jù)以上結(jié)果，在接種lO-310-5稀釋液的試管中5個重復(fù)都有生長，在接種lO-6稀釋液的試管中有4個重復(fù)生長，在接種10-7稀釋液的試管中只有1個生長，而接種10-8稀釋液的試管全無生長。由此可得出其數(shù)量指標(biāo)為“541”，查最大或然數(shù)表得近似值17，然后乘

6、以第一位數(shù)的稀釋倍數(shù)（10-5的稀釋倍數(shù)為100 000）。那么，1ml原菌液中的活菌數(shù)17×100 000 = 17×105。即每毫升原菌液含活菌數(shù)為l700000個。在確定數(shù)量指標(biāo)時，不管重復(fù)次數(shù)如何，都是3位數(shù)字，第一位數(shù)字必須是所有試管都生長微生物的某一稀釋度的培養(yǎng)試管，后兩位數(shù)字依次為以下兩個稀釋度的生長管數(shù)，如果再往下的稀釋仍有生長管數(shù)，則可將此數(shù)加到前面相鄰的第三位數(shù)上即可。如某一微生物生理群稀釋培養(yǎng)記錄為：    稀釋度         &

7、#160; lO-1      10-2     10-3     lO-4     10-5     10-6    重復(fù)數(shù)            4       4  

8、;     4      4       4       4    出現(xiàn)生長的管數(shù)    4       4       3      2  

9、;     1       0    以上情況，可將最后一個數(shù)字加到前一個數(shù)字上，即數(shù)量指標(biāo)為“433”，查表得近似值為30，則每毫升原菌液中含活菌30×102個。按照重復(fù)次數(shù)的不同，最大或然數(shù)表又分為三管最大或然數(shù)表、四管最大或然數(shù)表和五管最大或然數(shù)表。    應(yīng)用MPN計數(shù)，應(yīng)注意兩點，一是菌液稀釋度的選擇要合適，其原則是最低稀釋度的所有重復(fù)都應(yīng)有菌生長，而最高稀釋度的所有重復(fù)無菌生長。對土壤樣品而言，分析每個生理群的微生

10、物需57個連續(xù)稀釋液分別接種，微生物類群不同，其起始稀釋度不同(見附表1)；二是每個接種稀釋度必須有重復(fù)，重復(fù)次數(shù)可根據(jù)需要和條件而定，一般25個重復(fù)，個別也有采用2個重復(fù)的，但重復(fù)次數(shù)越多，誤差就會越小，相對地說結(jié)果就會越正確。不同的重復(fù)次數(shù)應(yīng)按其相應(yīng)的最大或然數(shù)表計算結(jié)果。若要求出土樣中每克干土所含的活菌數(shù)，則要將前述兩例中所得的每毫升菌數(shù)除以干土在土樣中所占的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（烘干后的土樣質(zhì)量原始土樣的質(zhì)量）。計算式為：         三、實驗器材      

11、60;              1. 土壤樣品：肥沃菜園土2. 培養(yǎng)基：阿須貝（Ashby）無氮培養(yǎng)液(附錄三、15)22管(每管裝5ml，加1cm×4.5cm濾紙l條)3. 器材：90ml無菌水（裝入250 ml三角瓶中，并裝有1520個玻璃珠）、9ml無菌水、lml刻度無菌吸管、試管架、記號筆。四、實驗方法    1稱取10克土樣，放入90ml無菌水中，振蕩20min，讓菌充分分散，然后按十倍稀釋法將供試土樣制成10-1

12、10-6的土壤稀釋液。2將22支裝有Ashby無氮培養(yǎng)液的試管按縱4橫5的方陣排列于試管架上，第一縱列的4支試管上標(biāo)以10-2，第二縱列的4支試管上標(biāo)以10-3第五縱列的4支管上際以10-6（即采用5個稀釋度，4個重復(fù)），另外2支試管留作對照。3 用lml無菌吸管按無菌操作要求吸取10-6的土壤稀釋液各lml放入編號10-6的4支試管中，再吸取10-5稀釋液各lml放入編號10-5的4支試管中，同法吸取10-4、10-3、10-2稀釋液各lml放入各自對應(yīng)編號的試管中。對照管不加稀釋液。4將所有試管置2830培養(yǎng)7天后觀察結(jié)果。5精確稱取3份10克稀釋用土，放入稱量瓶中，置105-110烘2h

13、后放入干燥器中，至恒重后稱重，然后計算干土在土樣中所占的質(zhì)量份數(shù)。五、實驗作業(yè)：    培養(yǎng)7天后，取出試管，檢查實驗結(jié)果。    凡有固氮菌生長的試管，則培養(yǎng)液與濾紙接觸處有黑褐色或粘液狀菌膜，即為陽性，否則為陰性。對照管應(yīng)為陰性。依次檢查每管生長情況，將結(jié)果填入下表，計算每克干土所含的活菌數(shù)。土壤稀釋度10-210-310-410-510-6重復(fù)次數(shù)44444固氮菌生長管數(shù)          數(shù)量指標(biāo)          干土的質(zhì)量分

14、數(shù)  菌數(shù)近視值  每克干土固氮菌數(shù)個/克干土        附表23-1 幾種主要微生物生理群MPN計數(shù)法一覽表微生物生理群培養(yǎng)基常用稀釋度常用重復(fù)次數(shù)培養(yǎng)時間 (天)主 要 檢 查 方 法氨化細(xì)菌蛋白胨氨化培養(yǎng)基0-610-947根據(jù)培養(yǎng)液加奈氏試劑后是否出現(xiàn)棕色或褐色，確定是否產(chǎn)生氨。亞硝酸細(xì)菌銨鹽培養(yǎng)基0-210-7314根據(jù)培養(yǎng)液加格利斯試劑及的反應(yīng)，出現(xiàn)絳紅色證明有NO-2生成；或在培養(yǎng)中加鋅碘淀粉試劑及體積比值為20%的H2SO4，若出現(xiàn)藍(lán)色，證明有NO-3生成。硝酸細(xì)菌亞硝酸鹽培

15、養(yǎng)基0-210-6314根據(jù)培養(yǎng)液加入濃硫酸及二苯胺試劑后，是否出現(xiàn)藍(lán)色，確定是否有NO-3生成。反硝化細(xì)菌反硝化細(xì)菌培養(yǎng)基0-410-8314根據(jù)杜氏小管有無氣體，確定有無N2生成；利用格利斯試劑及和二苯胺試劑、濃硫酸檢測有無NO-2生成及有無NH3存在，判斷反硝化作用進(jìn)行情況。好氣性自生固氮菌阿須貝無氮培養(yǎng)基0-210-637-14根據(jù)培養(yǎng)液表面與濾紙接觸處有無褐色或粘液狀菌膜生成，判斷有無好氣性自生固氮菌生長。好氣性 纖維素分解菌赫奇遜噬纖維培養(yǎng)基0-110-5314根據(jù)各試管中濾紙條上有無黃色或桔黃色菌斑出現(xiàn)及濾紙斷裂狀況，確定有無好氣性纖維素分解細(xì)菌的生長。厭氣性纖維素分解菌嫌氣性纖

16、維素分解細(xì)菌培養(yǎng)基0-110-5314-21根據(jù)各試管中濾紙條上有無穿洞、破裂、完全分解情況，確定有無嫌氣性纖維素分解細(xì)菌的生長。硫化細(xì)菌硫化細(xì)菌培養(yǎng)基0-210-8321-23在每管培養(yǎng)液中加入10g/L的BaCL2溶液2滴，如有白色沉淀出現(xiàn)，則證明有硫化菌活動。反硫化細(xì)菌斯塔克反硫化細(xì)菌培養(yǎng)基0-210-7321-30根據(jù)培養(yǎng)液試管底部、管壁有無黑色沉淀出現(xiàn)，判斷有無反硫化細(xì)菌活動。窗體頂端 EMBED Forms.HTML:Hidden.1 稀釋平板測數(shù)法一、實驗?zāi)康牧私庀♂屍桨逵嫈?shù)的原理，掌握涂抹平板培養(yǎng)法和混合平板培養(yǎng)法，認(rèn)識細(xì)菌、放線菌、霉菌的菌落特征。二、實驗原一、實驗?zāi)康牧私庀?/p>

17、釋平板計數(shù)的原理，掌握涂抹平板培養(yǎng)法和混合平板培養(yǎng)法，認(rèn)識細(xì)菌、放線菌、霉菌的菌落特征。二、實驗原理    稀釋平板計數(shù)是根據(jù)微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的單個菌落，即是由一個單細(xì)胞繁殖而成這一培養(yǎng)特征設(shè)計的計數(shù)方法，即一個菌落代表一個單細(xì)胞。計數(shù)時，首先將待測樣品制成均勻的系列稀釋液，盡量使樣品中的微生物細(xì)胞分散開，使成單個細(xì)胞存在（否則一個菌落就不只是代表一個細(xì)胞），再取一定稀釋度、一定量的稀釋液接種到平板中，使其均勻分布于平板中的培養(yǎng)基內(nèi)。經(jīng)培養(yǎng)后，由單個細(xì)胞生長繁殖形成菌落，統(tǒng)計菌落數(shù)目，即可計算出樣品中的含菌數(shù)。此法所計算的菌數(shù)是培養(yǎng)基上長出來的菌落數(shù)，故

18、又稱活菌計數(shù)。一般用于某些成品檢定（如殺蟲菌劑等）、生物制品檢驗、土壤含菌量測定及食品、水源的污染程度的檢驗。三、實驗器材        1活材料：蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）菌劑。2培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（附錄三、1）3器材：90ml無菌水、9ml無菌水、無菌平皿、lml無菌吸管、天平、稱樣瓶、記號筆、玻璃刮鏟等。四、實驗方法    1樣品稀釋液的制備  準(zhǔn)確稱取待測樣品l0g，放入裝有90ml無菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手或置搖床上振

19、蕩20 min，使微生物細(xì)胞分散，靜置20-30s，即成10-1稀釋液；再用1ml無菌吸管，吸取10-1稀釋液lml，移入裝有9ml無菌水的試管中，吹吸3次，讓菌液混合均勻，即成10-2稀釋液；再換一支無菌吸管吸取10-2稀釋液1 ml，移入裝有9ml無菌水的試管中，也吹吸三次，即成l0-3稀釋液；以此類推，連續(xù)稀釋，制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9等一系列稀釋菌液（圖22-1）。圖22-1  平板計數(shù)法中樣品的稀釋和稀釋液的取樣培養(yǎng)用稀釋平板計數(shù)時，待測菌稀釋度的選擇應(yīng)根據(jù)樣品確定。樣品中所含待測菌的數(shù)量多時，稀釋度應(yīng)高，反之則低。通常測定細(xì)菌菌劑含菌

20、數(shù)時，采用10-7、10-8、10-9稀釋度，測定土壤細(xì)菌數(shù)量時，采用10-4、10-5、10-6稀釋度，測定放線菌數(shù)量時，采用l0-3、10-4、10-5稀釋度，測定真菌數(shù)量時，采用10-2、10-3、10-4稀釋度。2平板接種培養(yǎng)  平板接種培養(yǎng)有混合平板培養(yǎng)法和涂抹平板培養(yǎng)法兩種方法。    （1）混合平板培養(yǎng)法  將無菌平板編上10-7、10-8、10-9號碼，每一號碼設(shè)置三個重復(fù)，用無菌吸管按無菌操作要求吸取10-9稀釋液各1ml放入編號10-9的3個平板中，同法吸取10-8稀釋液各lml放入編號10-8的3個平板中，再吸取10-7稀釋液各lml放入編號10-7的3個平板中（由低濃度向高濃度時，吸管可不必更換）。然后在9個平板中分別倒入已融化并冷卻至4550的細(xì)菌培養(yǎng)基(圖22-2)，輕輕轉(zhuǎn)動平板，使菌液與培養(yǎng)基混合均勻，冷疑后倒置，適溫培養(yǎng)。至長出菌落后即可計數(shù)。（2）涂抹平板計數(shù)法  涂抹平板計數(shù)法與混合法基本相同，所不同的是先將培養(yǎng)基熔化后趁熱倒入無菌平板中，待凝固后編號，然后用無菌吸管吸取0