生物質(zhì)譜在糖蛋白結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用

1、生物質(zhì)譜在糖蛋白結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用項目完成人：桑志紅 蔡 耘項目完成單位：國家生物醫(yī)學(xué)分析中心 隨著人們對糖蛋白參與生命活動機理的日益深入了解，對天然糖蛋白及重組糖蛋白類藥物的分析越來越受到重視。重組糖蛋白類藥物的質(zhì)量控制更是直接關(guān)系到藥物的療效及至人類的健康。九十年代以來，隨著帶有反射功能的基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）和納升電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（nano-ESI-Q-TOF）等具有軟電離方式的現(xiàn)代質(zhì)譜 技術(shù)的發(fā)展，質(zhì)譜以其高靈敏度和強有力的分析混合物的能力，提供了生物大分子的分子量、序列、一級結(jié)構(gòu)信息以及結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換、修飾等方面的信息，使糖基化分析有了重要的進展。 通常

2、研究糖蛋白的方法是把蛋白鏈上的寡糖切下來，分別研究蛋白部分和寡糖部分的結(jié)構(gòu)，因此無法研究與兩部分共同相關(guān)的結(jié)構(gòu)問題，也不能區(qū)分不同糖基化位點上切下來的寡糖。自90年代初，國外有人開始用質(zhì)譜法研究糖蛋白的結(jié)構(gòu)，同時描述了各個位點的不均一性。我們用建立的現(xiàn)代生物質(zhì)譜技術(shù)研究糖蛋白一級結(jié)構(gòu)的方法，將其應(yīng)用與基因重組糖蛋白的結(jié)構(gòu)分析。為糖蛋白結(jié)構(gòu)分析及基因重組糖蛋白類藥物的質(zhì)量控制提供新的手段。一、 生物質(zhì)譜研究糖蛋白結(jié)構(gòu)方法的建立實驗所用儀器為：1.德國BRUKER 公司的REFLEXIII型基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜儀，N2激光器，波長337nm，線性飛行距離150cm，加速電壓2kv。2

3、.英國Micromass 公司Q-TOF型電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀。源溫80°C，氣體流速40L/h，槍頭電壓650V，檢測頻率2.4S，氬氣碰撞池壓力6*10-5mbar。1. 基質(zhì)的選擇，在MALDI-TOF-MS分析中，基質(zhì)起著相當(dāng)重要的作用。不同的基質(zhì)對不同類的物質(zhì)響應(yīng)不同，a-氰基-4-羥基肉桂酸用于測定糖蛋白核糖核酸酶B效果相對較好。2. 糖蛋白分子量的測定，糖蛋白核糖核酸酶B由124個氨基酸組成，在34位Asn處連有一個高甘露糖型N-糖鏈。由于糖鏈的微不均一性，與普通蛋白質(zhì)及核酸不同，其分子離子峰在MALDI-TOF-MS 質(zhì)譜圖上表現(xiàn)為一簇峰，各峰之間約相差一個糖基。正是由于

4、這種微不均一性，使得其分子離子峰變寬，靈敏度降低。糖鏈分子量越大，峰越寬，靈敏度越低，所以一般只有糖鏈較短，蛋白的質(zhì)量不太大的糖蛋白才能測定其平均分子量。用MALDI-TOF可直接測定糖蛋白核糖核酸酶B的平均分子量為 15208.6Da。核糖核酸酶B的MALDI-TOF-MS圖 G+（14879.5、15040.1、15203.0、15381.5、15539.1 Da） 平均分子量：X=SXi/n=15208.6 Da3. 糖含量的測定，采用O聚糖酶及內(nèi)糖苷鍵酶F分別作用于核糖核酸酶 B，只有內(nèi)糖苷鍵酶F能夠是其分子量發(fā)生變化，表明核糖核酸酶B分子中不存在O-連接糖鏈存在著N-連接糖鏈。內(nèi)糖苷

5、鍵酶F切斷N-糖鏈五糖核心最內(nèi)側(cè)的GlcNAc-GlcNAc糖苷鍵，得到含一個GlcNAc的肽鏈，減去GlcNAc，可以計算出準(zhǔn)確的肽鏈分子量T=13695.6，與糖蛋白平均分子量之差為糖鏈的平均分子量G=1513.4，平均糖含量為：(糖鏈大小/糖蛋白分子量)×100%=9.95%。4. 糖基化位點的確定，研究糖基化類型及糖基化位點的策略：采用蛋白酶酶解與糖苷內(nèi)切酶酶解相結(jié)合的方法，通過酶切前后含糖肽片的位移，結(jié)合網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫檢索，可以確定糖基化類型和糖基化位點。以不同類型的糖苷內(nèi)切酶作用于糖蛋白（N-糖苷鍵酶或O-糖苷鍵酶），在MALDITOF-MS 上觀察其質(zhì)量的變化，可以直接確定

6、糖蛋白中是否含有響應(yīng)類型的糖鏈，這是我們確定糖蛋白中糖苷鍵類型的基礎(chǔ)。我們采用先將核糖核酸酶B還原烷基化，加Glu-C酶切，產(chǎn)物再用內(nèi)糖苷肩酶F酶切，可觀察到含糖肽段出現(xiàn)位移，將核糖核酸酶B的肽質(zhì)量指紋圖進行數(shù)據(jù)庫檢索，證實發(fā)生位移的肽段中含有N-糖鏈特異連接位點，由此確定34位Asn為糖基化位點。另外我們采用內(nèi)糖苷鍵酶F及肽-N-聚糖酶F兩種酶進行差位酶切法對含糖肽段進行驗證，兩種酶酶切后分子離子峰的差值除以GlcNAc的質(zhì)量，結(jié)果就是N-糖基化位點的個數(shù)5. 質(zhì)譜測定氨基酸序列， 我們對核糖核酸酶B肽質(zhì)量指紋譜中的含糖肽段進行了串聯(lián)質(zhì)譜測定，首先在一級質(zhì)譜圖中選擇離子4972.23，在串聯(lián)

7、質(zhì)譜的碰撞活化室以氬氣與其碰撞產(chǎn)生碎片，從碎片的質(zhì)荷比推算出此肽片中的一段氨基酸序列，檢索結(jié)果為核糖核酸酶B，從而判斷其理論序列是否一致。6. 糖鏈結(jié)構(gòu)的研究，凝集素對糖肽的親和提取，進一步分析糖肽序列及糖鏈結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵是含糖肽段的提取。核糖核酸酶B中糖鏈為高甘露糖型，我們選用對其有特異性吸附的伴刀豆球蛋白對其進行提取利用這種簡捷的親和質(zhì)譜的方法，對糖肽段進行了分析。建立了親和質(zhì)譜分析糖肽類物質(zhì)的方法，為今后糖肽序列分析及糖鏈結(jié)構(gòu)分析奠定了基礎(chǔ)。二、基因重組糖蛋白人促紅細胞生成素（rhEPO）的結(jié)構(gòu)分析。 利用以上建立的方法，我們對樣品重組人促紅細胞生成素進行了分析，斷定此樣品為非完全糖基化，樣品中只存在N-連接的糖鏈，無O-糖鏈。應(yīng)用酶切法用肽-N-聚糖酶處理后，得到兩個含糖肽段，進行數(shù)據(jù)庫檢索，測得38位及83位為N-糖基化位點，與文獻報道相符，結(jié)果可靠。因此，該項課題為糖蛋白結(jié)構(gòu)分析及基因重組糖蛋白類藥物的質(zhì)量