熒光原位雜交的認(rèn)識(shí)

1、對(duì)熒光原位雜交技術(shù)的認(rèn)識(shí)摘要:熒光原位雜交技術(shù)（FISH）作為分子水平的微生物檢測(cè)技術(shù)，已成為目前首要生物學(xué)核酸檢測(cè)技術(shù)，本文主要介紹了FISH的發(fā)展及在污水處理中的應(yīng)用，重點(diǎn)介紹了在硝化細(xì)菌方面的應(yīng)用，并給出了FISH技術(shù)存在的缺陷及改進(jìn)的方法。Abstract: Fluorescence in situ hybridization (FISH) , as a microbial molecular detection technology, has become the first biology nucleic acid detection technology. This paper

2、introduces the development of FISH and the application in wastewater treatment, and mainly introduces the application in nitrifying bacteria.Further more,it also describes the disvantages in FISH and the improved methods.關(guān)鍵詞：熒光原位雜交技術(shù)（FISH），16S rDNA(16S rRNA),污水生物處理熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybri

3、dization）是在同位素原位雜交技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的非放射性原位雜交方法，起始于20世紀(jì)70年代后期。它以16S rDNA(16S rRNA)探針用特殊的核苷酸分子標(biāo)記然后將探針直接雜交到染色體或DNA纖維切片上，再用與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體與探針?lè)肿犹禺愋越Y(jié)合來(lái)檢測(cè)DNA序列在染色體或DNA纖維素切片上的定性，相對(duì)定量分析。有不同細(xì)菌的16S rDNA都有其獨(dú)特序列，利用這些獨(dú)特的序列制成的探針可以鑒別和跟蹤自然樣品中的目標(biāo)細(xì)菌。最初FISH技術(shù)應(yīng)用于醫(yī)療事業(yè)，目前FISH技術(shù)的應(yīng)用范圍也來(lái)越廣，特別是FISH流程的簡(jiǎn)化完善和檢測(cè)靈敏度的提高，使FISH成為一種首要的生物學(xué)核酸檢測(cè)技

4、術(shù)。1. FISH的發(fā)展歷史1969 年, Pardue【1】 等和John【2】?jī)蓚€(gè)研究小組開(kāi)發(fā)了原位雜交技術(shù), 用放射性同位素標(biāo)記的DNA 或28S rRNA 和爪蟾卵細(xì)胞制備物進(jìn)行雜交, 然后進(jìn)行顯微放射自顯影檢測(cè)。這一技術(shù)可以在保持細(xì)胞形態(tài)完整的條件下, 檢測(cè)出細(xì)胞核酸序列, 自此, 原位雜交技術(shù)在染色體進(jìn)化、腫瘤病人和白血病人的染色體分析以及多種細(xì)胞遺傳學(xué)研究方面得到應(yīng)用。早期的同位素標(biāo)記沒(méi)有專(zhuān)門(mén)的標(biāo)記方法，將隨機(jī)同位素標(biāo)記的堿基添加到生長(zhǎng)的細(xì)胞中再進(jìn)行放射自顯影。雖然靈敏度高，但是放射性材料因半衰期較短引起探針不穩(wěn)定，且分辨率有限，檢測(cè)周期長(zhǎng)，價(jià)格相對(duì)較昂貴，必須按照嚴(yán)格的程序轉(zhuǎn)運(yùn)

5、、貯存和處理有放射性的材料?！?】1980年，Bauman【4】首次將熒光原位雜交用于核酸檢測(cè)，直接接將RNA-3端用熒光素標(biāo)記作為特異DNA 序列的探針。氨基-烯丙基標(biāo)記堿基技術(shù)可以與任何半抗原或者熒光素結(jié)合，這對(duì)于原位雜交是至關(guān)重要的，因?yàn)榘被?烯丙基標(biāo)記的堿基技術(shù)可以?xún)H通過(guò)簡(jiǎn)單的化學(xué)反應(yīng)就可以獲得一系列的低背景信號(hào)探針，通過(guò)雜交探針的二級(jí)檢測(cè)系統(tǒng)使得雜交信號(hào)被放大。早在19 世紀(jì)80 年代，缺口平移法檢測(cè)、生物素標(biāo)記探針，二級(jí)熒光標(biāo)記抗體檢測(cè)等方法已經(jīng)用于DNA【6】 和mRNA 【7】檢測(cè)。FISH 不僅用于單基因或核酸檢測(cè)，F(xiàn)ISH 技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展擴(kuò)展到多色FISH 多基因位點(diǎn)同時(shí)

6、檢測(cè)，從基因檢測(cè)發(fā)展到基因組、染色體、活細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNAs 原位檢測(cè)以及組織水平的核酸檢測(cè)，并且在今后的研究中還有可能應(yīng)用到整個(gè)生物體的檢測(cè)?！?】Pinkel【8】等（1986）首次將熒光圖像定量分析用于基本細(xì)胞遺傳檢測(cè)，采用雙色激發(fā)塊裝置照相機(jī)檢測(cè)熒光信號(hào)，而且定量分析技術(shù)很快用于了mRNA 檢測(cè)。1988年, Giovannoni【9】 等首次將FISH 技術(shù)引入細(xì)菌學(xué)研究中, 使用放射性標(biāo)記rRNA 寡核苷酸探針檢測(cè)微生物。隨著熒光標(biāo)記的發(fā)展, 非同位素染料逐漸代替。1989 年, Delong【10】首次使用熒光標(biāo)記寡核苷酸探針檢測(cè)單個(gè)微生物細(xì)胞。2. FISH的應(yīng)用在廢水處理

7、工藝中，對(duì)微生物鑒定的方法很多，傳統(tǒng)的微生物的檢測(cè)方法基本上有菌種分離培養(yǎng)法，鏡檢計(jì)數(shù)法。菌種分離培養(yǎng)法對(duì)一些培養(yǎng)條件苛刻或沒(méi)被培養(yǎng)過(guò)的細(xì)菌用途不大，重要的是它不能精確的反應(yīng)菌群的組成及多樣性。鏡檢計(jì)數(shù)法，不但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，還可能因?yàn)槲⑸镄螒B(tài)、特性類(lèi)似把它們當(dāng)作同種微生物記錯(cuò)數(shù)，同時(shí)，沒(méi)有活性的微生物有可能也會(huì)被計(jì)入總數(shù)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,分子生物學(xué)方法已經(jīng)成為現(xiàn)代環(huán)境微生物學(xué)的重要手段。與放射性探針相比, 熒光探針更安全, 具有較好的分辨力, 不需要額外的檢測(cè)步驟。此外, 可用不同激發(fā)和散射波長(zhǎng)的熒光染料標(biāo)記探針, 在一步反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)幾個(gè)靶序列。該技術(shù)特異性和敏感度都很高，使得那些環(huán)

8、境中數(shù)量少，培養(yǎng)難度高的微生物的研究方便快捷了很多。不僅可以應(yīng)用到環(huán)境樣品微生物多樣性和污水處理中生物多樣性的研究還可以應(yīng)用到微生物群落組成及空間分布，原位生理學(xué)和功能性研究和特殊菌種的研究。在聚磷菌方面的應(yīng)用熒光原位雜交(FISH)技術(shù)在聚磷菌的研究中可以在一定程度上反映污泥中聚磷菌的組成和空間結(jié)構(gòu)。2008年，張勇【11】等通過(guò)正交試驗(yàn)篩檢可以確定FISH技術(shù)在檢測(cè)反應(yīng)器中聚磷菌最佳的優(yōu)化條件。在固定前應(yīng)先經(jīng)過(guò)1 ×PBS清洗兩次, 37熱固定3 h,乙醇脫水3 min; FISH技術(shù)檢測(cè)反應(yīng)器中聚磷菌的最佳實(shí)驗(yàn)條件為:雜交溫度46,雜交時(shí)間2 h,清洗緩沖液中NaCl濃度70

9、mmol/L。使聚磷菌的定量檢測(cè)更加快、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確。亢涵,王秀蘅【12】等應(yīng)用FISH 對(duì)以乙酸鈉為碳源的強(qiáng)化生物除磷(EBPR) SBR 反應(yīng)器啟動(dòng)期的微生物進(jìn)行原位分析,考察了除磷生態(tài)系統(tǒng)形成過(guò)程中聚磷菌種群結(jié)構(gòu)、空間分布關(guān)系動(dòng)態(tài)變化及其聚磷特性。在厭氧反應(yīng)細(xì)菌的應(yīng)用Santegoeds 【13】等人利用ARC915 ,SRB385 ,DSV698 和DSS658 等探針發(fā)現(xiàn),產(chǎn)甲烷菌主要分布在顆粒污泥的內(nèi)部,而硫酸鹽還原菌則分布在外層;Sekiguchi【14】 等人也得到類(lèi)似結(jié)論。2006年，許鑫【15】等應(yīng)用FISH檢測(cè)厭氧反應(yīng)器里的硫酸鹽還原細(xì)菌，并對(duì)其試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。硫酸鹽還原

10、菌的較好的雜交條件是雜交溫度46，雜交時(shí)間3h, NaCl濃度為90mmol/L。雜交時(shí)間和溫度均影響探針的特異性，在一定溫度范圍內(nèi)提高雜交溫度會(huì)提高探針的特異性；雜交時(shí)間過(guò)短會(huì)造成探針結(jié)合不完全，過(guò)長(zhǎng)會(huì)增加非特異性著色；雜交洗脫液NaCl濃度過(guò)高會(huì)降低探針特異性。同年，陳瑛，任南琪【16】等應(yīng)用FISH技術(shù)研究了連續(xù)流攪拌槽(CSTR)解析發(fā)酵產(chǎn)氫細(xì)菌中的2 種產(chǎn)氫發(fā)酵類(lèi)型的菌群組成和發(fā)酵類(lèi)型轉(zhuǎn)化過(guò)程中的菌群種類(lèi)和數(shù)量變化及其對(duì)產(chǎn)氫速率、生物量和發(fā)酵產(chǎn)物的影響.結(jié)果表明,梭菌屬和腸桿菌科在決定產(chǎn)氫發(fā)酵類(lèi)型方面有重要作用. 以梭菌為優(yōu)勢(shì)種群的乙醇型發(fā)酵比以腸桿菌為優(yōu)勢(shì)種群的丁酸型發(fā)酵具有更佳的

11、產(chǎn)氫能力。Harmsen【17】等人利用EUB338 ,ARC915 ,MX825 和MG1200 等探針的不同組合以蔗糖為基質(zhì)和以混合酸為基質(zhì)的顆粒污泥分層不同。其前者為：三層，由外到內(nèi)，真細(xì)菌，產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌和產(chǎn)甲烷絲菌的共生體，較大空洞有少量產(chǎn)甲烷細(xì)菌和無(wú)機(jī)物。后者為兩層，外層真細(xì)菌，內(nèi)層產(chǎn)甲烷絲菌為主。對(duì)腸道細(xì)菌的應(yīng)用1995年，Langendijk等【18】首次采用探針Bif164用FISH對(duì)人腸道雙歧桿菌進(jìn)行定量分析。2004年，Takada等【19】用3種不同熒光集團(tuán)組合，并用7種針對(duì)雙歧桿菌的探針染上不同的探針，成功的運(yùn)用了多色熒光原位雜交技術(shù)。2004年，王建龍【20】利用F

12、ISH檢測(cè)水體中大腸桿菌，可以在一天內(nèi)給出定量檢測(cè)結(jié)果。但還沒(méi)有廣泛用于飲用水中的大腸菌群計(jì)數(shù)，原因是飲用水中的細(xì)菌因缺乏營(yíng)養(yǎng)物處于饑餓狀態(tài)且受消毒劑的影響。其細(xì)胞內(nèi)的染色體含量較低，是雜交產(chǎn)物的熒光信號(hào)很弱。利用PAN（是一種合成的核酸,用肽骨架取代了核酸中的戊糖- 磷酸骨架,是一種新型的DNA 模擬物,具有與DNA 和RNA 結(jié)合的高度親合性和良好的穩(wěn)定性)代替DNA或利用熒光擴(kuò)增系統(tǒng)可以提高檢測(cè)的靈敏度和雜交信號(hào)的熒光強(qiáng)度。在生物脫氮方面的應(yīng)用Helmer【21】等以NSO1225探針和Amx208202a2A222探針?lè)謩e對(duì)生物膜內(nèi)細(xì)菌進(jìn)行了FISH檢測(cè), 發(fā)現(xiàn)亞硝酸細(xì)菌主要分布于生物

13、膜的好氧表層, 而厭氧氨氧化菌( Kuene2nia stuttga rtiensis) 則主要分布于生物膜的缺氧內(nèi)層。Michael【22】等用同樣探針對(duì)CANON(Completely Autotrophic Nitrogen OverNitrite) 反應(yīng)器中的顆粒污泥進(jìn)行研究時(shí)也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的結(jié)果。Schramm【23】等應(yīng)用FISH技術(shù)并將聚焦顯微鏡和相差顯微鏡圖像疊加，對(duì)硝化流化床反應(yīng)器中活性污泥內(nèi)硝化細(xì)菌的空間分布進(jìn)行原位分析，發(fā)現(xiàn)氨氧化細(xì)菌和亞硝酸鹽氧化細(xì)菌緊密結(jié)合在一起的形態(tài)特征。IngoSchmidt【24】等在研究好氧與厭氧氨氧化菌的生存關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)Kuenenia stut

14、tga rtiensis和Brocadia anammoxidans Dokhaven緊密結(jié)合在一起的形態(tài)特征。Jang等用Nsm156作為探針研究SBR中的好氧顆粒污泥的群落結(jié)構(gòu)特征時(shí)發(fā)現(xiàn):氨氧化菌含量很高,但分布并不均勻,大部分集結(jié)成球狀, 有些甚至在顆粒污泥的缺氧區(qū)。這一研究結(jié)果表明顆粒污泥中的氨氧化菌含量可能高于絮狀活性污泥, 從而可以實(shí)現(xiàn)更高的氨負(fù)荷。Silyn【25】等對(duì)廢水處理濕地生物進(jìn)行了研究, 結(jié)果也表明亞硝化單胞菌是其生物膜上的主要氨氧化細(xì)菌。Kazuaki【26】等用EUB338、NSO190、NIT3和NSR1156等探針研究了同時(shí)硝化反硝化好氧膜生物反應(yīng)器中生物膜上的

15、菌群結(jié)構(gòu), 結(jié)果表明氨氧化菌是生物膜中的優(yōu)勢(shì)菌群, 而亞硝酸鹽氧化菌則未被檢出。Han-Woong Lee【27】等用EUB338作為一級(jí)探針, ALF1b, BET42a, GAM42a和CF319a作為二級(jí)探針對(duì)兩個(gè)不同脫氮反應(yīng)器活性污泥中的分子生物學(xué)特征進(jìn)行了定量研究，變形菌綱-亞綱是反應(yīng)器中的優(yōu)勢(shì)菌群，變形菌綱-亞綱是反應(yīng)器中的第二大優(yōu)勢(shì)菌群。Sachiko【28】等用自己設(shè)計(jì)的Clw844、PSMg43、Hlm474等探針對(duì)含鹽廢水處理脫氮系統(tǒng)中的生物群落進(jìn)行了定量研究，結(jié)果表明, Hlm474 探針?biāo)淼腍alom onas1.sp是反應(yīng)器能實(shí)現(xiàn)脫氮最重要的菌屬。張丹【29】等研

16、究了OLAND (Oxygen-Limited Autotrophic Nitrification-Denitrification)反應(yīng)器中硝化菌群隨溶氧濃度降低的變化規(guī)律, 在限氧條件下, 硝酸細(xì)菌不能與亞硝酸細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)氧, 也不能與厭氧氨氧化菌競(jìng)爭(zhēng)亞硝酸鹽。FISH與PCR-DGGE和16S rRNA / rDNA序列分析等技術(shù)相結(jié)合是對(duì)污水處理構(gòu)筑物中生物脫氮群落進(jìn)一步研究的發(fā)展方向。3. FISH的檢測(cè)步驟各種微生物的FISH的檢測(cè)步驟基本相似，都是預(yù)處理，固定，雜交，洗脫，鏡檢。只是由于微生物的生理性質(zhì)不同，所以預(yù)處理方法不同，探針、雜交溫度、雜交時(shí)間，脫水時(shí)間，洗脫液NaCl濃度各不

17、相同。探針都是采取16srDNA(16srRNA)用特殊的核苷酸分子標(biāo)記，其他條件需要根據(jù)可以根據(jù)正交試驗(yàn)測(cè)出來(lái)。首先，簡(jiǎn)單介紹一下幾類(lèi)細(xì)菌的預(yù)處理。厭氧顆粒污泥的預(yù)處理從處理裝置或試驗(yàn)裝置取出顆粒污泥,經(jīng)沉淀和清水漂洗后,用多聚甲醛磷酸緩沖液進(jìn)行固定,然后浸入熔化的塑化石蠟(paraplast) 中,冷卻后切片,切片厚度一般為510m ,將切片在50 水中進(jìn)行延展后轉(zhuǎn)移到玻片上,在42 條件下干燥后在二甲苯中浸泡30 min ,再用二甲苯- TBA - 乙醇混合液進(jìn)行沖洗,即完成了顆粒污泥樣品的預(yù)處理。聚磷菌的預(yù)處理過(guò)程(1)取1. 5 ML 污泥于2ML 離心管并于14000轉(zhuǎn)離心5分鐘。

18、(2)去除1. 25 ml上清液,震蕩使之重新懸浮,并加入0. 75 ml固定液。(3)震蕩1分鐘后于4冷藏2小時(shí)。(4) 6000轉(zhuǎn)離心5分鐘,去除上清液,加入0. 9ml 1 ×PBS。震蕩1分鐘。(5)重復(fù)步驟4兩次。最后離心去除上清液后加入0. 2 ml 1 ×PBS,震蕩1分鐘。(6)加入等體積96%酒精可在- 20下冷藏?cái)?shù)月備用。(7)取3 ul預(yù)處理過(guò)的污泥到載玻片上, 37 的烘箱熱固定3小時(shí);依次用50% , 80%, 96% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))乙醇室溫下脫水3分鐘。硝化細(xì)菌的預(yù)處理（1） 活性污泥用0.1% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)) D EPC 浸泡的聚乙烯管子采樣; 4

19、% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))的多聚甲醛于4 固定4 h; 將固定樣本用磷酸緩沖液離心漂洗2次,用w ( PBS ) w (乙醇) = 1 1液稀釋備用;10L 的樣品涂于包埋明膠的玻片, 37 的烘箱熱固定; 依次用50% , 80% , 96% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))乙醇室溫下脫水.（2） 水樣水樣直接按1 1加入4% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))的多聚甲醛, 4 固定4 h,用蘇丹黑B 染色,硝酸纖維膜過(guò)濾后,進(jìn)行熱固定、脫水等處理步驟.其次，以硝化細(xì)菌的具體檢測(cè)步驟如下：1）玻片處理（a）玻片清洗：熱肥皂水刷洗，1%鹽酸浸泡24h，再在0.1%焦炭酸二乙酯（DEPC）中浸泡24h。（b）硅化處理：玻片和蓋玻片1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）

20、鹽酸煮沸10min，烘干，錫紙包好4保存?zhèn)溆谩＃╟）明膠涂片制備：將烘干的玻片放入明膠中10min，然后60烘干過(guò)夜備用。（d）試劑瓶、塑料器皿及組織勻漿器的處理試劑瓶、組織勻漿器先清洗干凈，用1 mL/LDEPC (Diethyl Pyrocarbonate) 水溶液浸泡處理(37 、2 h ，室溫過(guò)夜) ，高壓消毒去除DEPC ，然后250 烘干4 h 以上或200 過(guò)夜。稱(chēng)量試劑勺也要干烤。塑料器皿最好用滅菌的一次性塑料用品，使用前進(jìn)行高壓消毒，為保證質(zhì)量，凡使用的槍頭、試管等均經(jīng)0. 5mL/L DEPC 水溶液處理3 h 以上，然后再高壓滅菌，烘干。若為進(jìn)口已處理的無(wú)RNase和DN

21、ase 的槍頭、試管可不必處理直接使用。（e）各種溶液的配制：凡是水溶性液體均用1 mL/L DEPC 水配制。2）樣品制備及其所涉及的試劑包括：（a）緩沖溶液1×PBS緩沖溶液：NaCl 8g，Na2HPO4 2.9g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，溶入1000mL超純水；3×PBS緩沖溶液：NaCl 24g，Na2HPO4 8.7g，KCl 0.6g，KH2PO4 0.6g，溶入1000mL超純水；通常配制成10×PBS的儲(chǔ)備液，3×PBS和1×PBS可用DEPC水稀釋獲得。（b） 4%多聚甲醛（Paraformaldehyde

22、, PFA）稱(chēng)取2g PFA加入30ml約60的熱水，滴幾滴20%NaOH放在磁力攪拌器攪拌至完全溶解。然后向其中加入16.5 ml 3×PBS緩沖液，在冰浴中充分混勻冷卻，冷卻后，用HCl調(diào)整至中性（7.2左右），拿出攪拌子。向PFA溶液中加入超純水，定容在50ml。用0.45微米的膜過(guò)濾后使用。（室溫或4保存?zhèn)溆茫?。注意?、配制時(shí)應(yīng)在通風(fēng)條件下操作，并避免接觸皮膚和吸入（戴手套及口罩），因PFA有較強(qiáng)的固定作用及毒性，對(duì)粘膜及皮膚有固定及毒性，刺激作用；2、加熱時(shí)，溫度不宜過(guò)高，常為6065，否則，PFA降解失效；3、配制好的PFA雖可存放一定時(shí)間，但過(guò)久的液體，固定效果下降，

23、應(yīng)盡早使用。4% PFA是目前原位雜交組織化學(xué)技術(shù)中最常用的固定液，它能較好地保持組織及細(xì)胞內(nèi)的RNA，同時(shí)對(duì)形態(tài)保持也較好。樣品固定時(shí)間在23小時(shí)，RNA含量較為恒定。過(guò)度延長(zhǎng)固定時(shí)間會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)生物大分子的過(guò)度交聯(lián)，影響探針的穿透力，降低雜交效率。（c）配制50%，80%，98%無(wú)水乙醇溶液，每個(gè)總量20mL。（d）DAPI溶液用1 ml ddH2O將DAPI溶解，制得2.9 mM的DAPI溶液 （1 mg DAPI/1 mL H2O）。（DAPI不能直接用PBS等緩沖液溶解，需要先用水將其溶解）。取適量DAPI水溶液加到PBS中，制備成10-50 µM的DAPI溶液。3）取樣及

24、保存方法（a）反應(yīng)器沉淀前取樣25mL至離心管。（b）離心（2000r/min）5min，去上清液（加蒸餾水重復(fù)兩次）。（c）樣品加入1mL多聚甲醛，搖勻，4下放置3h。（d）樣品離心(12000r/min)5min， 去上清夜。（e）加入1×PBS，搖勻，離心(10000r/min)5min， 去上清夜（重復(fù)3次）。（f）加0.5mL 1×PBS，0.5mL無(wú)水乙醇，搖勻，-20保存（可保存6個(gè)月）。4）樣品固定：稀釋樣品35倍，對(duì)樣品進(jìn)行超聲處理（3W超聲23min，沉降1min，去沉淀物，5W超聲5min），將活性污泥絮體打散成單個(gè)細(xì)胞以便于顯微鏡計(jì)數(shù)。然后取3L樣品

25、涂于包埋明膠的玻片上（檢查樣片本底），37的熱烘箱固定2h（或者在空氣中干燥2h或者過(guò)夜）。依次用50%、80%、98%（質(zhì)量比）乙醇浸漬3min，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行脫水后，立放，并進(jìn)行干燥。 5）樣品雜交試驗(yàn)所涉及的緩沖液包括雜交緩沖液（Hybridization Buffer, HB）和淋洗緩沖液（Washing Buffer, WB），其組分如表3-2和表3-3。表3-2 雜交緩沖液（Hybridization Buffer）5%10%20%30%35%40%0.05%SDS（L）1.21.21.21.21.21.250mMTri-HCl（L）2424242424245mol NaCl（mL）4

26、.324.324.324.324.324.32甲酰胺（mL）1.22.44.87.28.49.6蒸餾水（mL）18.454817.254814.854812.454811.254810.0548探針Nsm156Ntcoc206Ntspn693Nsv443Ntspa662 NSO1225 NmvNIT3表3-3 淋洗緩沖液（Washing Buffer）組分體積0.05%SDS0.6L50m MTri-HCl12L5mol NaCl2.16mL蒸餾水42.8274mL（a）吸取2mL雜交緩沖液遍布在雜交盒內(nèi)折好的吸水紙上，將已固定好樣品的載玻片放入雜交管中，然后在46雜交爐中放置數(shù)分鐘。（b）吸

27、取10L探針貯存液和80L雜交緩沖液混合后，用箔紙包好放入46雜交爐中預(yù)熱數(shù)分鐘；探針貯存液濃度為25ng/L，用無(wú)菌水稀釋購(gòu)買(mǎi)的探針，實(shí)驗(yàn)用的探針序列及雜交條件見(jiàn)表3-4所示。 表3-4用于檢測(cè)樣品中AOX、NOX的寡核苷酸探針及雜交條件探針探針序列(53)標(biāo)記細(xì)菌種屬濃度a參考文獻(xiàn)NSO1225CGCCATTGTATTACGTGTGAAmmonia oxidizing beta-proteobacteria3538Nsv443CCGTGACCGTTTCGTTCCGNitroso-spira, -lobus, -vibrio3038NmvTCCTCAGAGACTACGCGGNitroso-c

28、occus3539Ntspa662GGAATTCCGCGCTCCTCTNitrospira3540NIT3CCTGGCTCCATGCTCCGNitrobacter4041Ntcoc206CGGTGCGAGCTTGCAAGCNitrococcus mobilis1042Ntspn693TTCCCAATATCAACGCATTNitrospina gracilis2042注：a 表示雜交緩沖液中去離子甲酰胺濃度（%）（c）吸取9L預(yù)熱后的探針稀釋液涂于載玻片待測(cè)樣品上，然后將載玻片迅速地移回雜交管中于46下進(jìn)行雜交（黑暗中進(jìn)行），雜交時(shí)間為23h；（d）雜交后的洗脫：打開(kāi)恒溫水浴槽，加熱到48，對(duì)雜

29、交緩沖液、淋洗緩沖液進(jìn)行預(yù)熱。雜交盒中取出載玻片用雜交緩沖液沖洗樣品后， 快速放入淋洗緩沖液，48水浴20min后用4冰水，沖洗樣品，樣品潔凈臺(tái)中揮干。6） DAPI染色每孔滴9uLDAPI， 4暗處5min，4冰水（BPS緩沖溶液）沖洗，揮干。用帶有360 nm激發(fā)波長(zhǎng)，460 nm發(fā)射波長(zhǎng)的濾光片的熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。DAPI（4，6-diamido-2-phenylindole）染色用于全細(xì)胞計(jì)數(shù)。7） 封片涂封片劑，蓋蓋玻片，無(wú)氣泡后指甲油封裝。8） 熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)每個(gè)樣品及每個(gè)探針都采集20個(gè)不同區(qū)域。每個(gè)區(qū)域中的細(xì)胞個(gè)數(shù)要超過(guò)1000個(gè)，然后進(jìn)行平均以獲得每個(gè)探針對(duì)于每個(gè)樣品的

30、雜交結(jié)果。細(xì)菌豐度或細(xì)菌數(shù)目（cells/g或cells/L）為AS1/(S2V)，其中A為視野中細(xì)菌平均數(shù)；S1為樣品涂抹面積；S2為視野涂抹面積；V為樣品體積。FISH技術(shù)存在的不足及改進(jìn)FISH檢測(cè)有時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果。造成假陽(yáng)性的原因有兩種：自身熒光和缺乏特異性。微生物的培養(yǎng)基、固定方法和封閉劑對(duì)熒光的信號(hào)強(qiáng)度均有很大的影響。使用狹窄波段的濾鏡和信號(hào)放大系統(tǒng)能降低自身背景熒光。在進(jìn)行數(shù)字處理時(shí)減少像數(shù)可以消除自身熒光，使用共聚焦激光掃描顯微鏡可以通過(guò)分析自身熒光減少FISH檢測(cè)影響。FISH 檢測(cè)的精確性和可靠性主要依賴(lài)于寡核苷酸探針的特異性，探針的特異性和靈敏性也取決于雜交條

31、件, 雜交和洗脫溫度、變性劑的濃度等。造成假陰性原因有：探針穿透力不足；rRNA 形成的三維結(jié)構(gòu), 導(dǎo)致寡核苷酸探針的差別感受性而無(wú)法接近靶序列, 阻礙了雜交；低rRNA含量和光脫色。細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)影響探針穿透力，因此要對(duì)革蘭氏陰性菌進(jìn)行特殊的固定和預(yù)處理，采用PAN探針可以克服寡核苷酸探針的差別感受性，提高雜交效果。使用高亮度的熒光染料Cy3 或Cy5 和多重探針標(biāo)記, 以及應(yīng)用信號(hào)放大系統(tǒng)或多聚核苷酸探針均可增強(qiáng)雜交信號(hào)。使用細(xì)菌探針是控制因方法學(xué)問(wèn)題而導(dǎo)致假陰性結(jié)果的最好手段參考文獻(xiàn)【 1 】Pardue ML ,Gall J G.Molecular hybridization of rad

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