不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳

1、生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳第一頁，共31頁。http:/ 理理聚丙烯酰胺凝膠是由單體聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺丙烯酰胺(acrylamide(acrylamide，簡稱，簡稱Acr)Acr)和交和交聯(lián)劑聯(lián)劑N,N-N,N-甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺(N(N，Nmethylene-bisacylamideNmethylene-bisacylamide，簡，簡稱稱Bis)Bis)在加速劑在加速劑N N，N N，N N ，N N 四甲基乙二胺四甲基乙二胺(N(N，N N，N N ，N N tetramethyl ethylenedia mine

2、tetramethyl ethylenedia mine，簡稱，簡稱TEMEDTEMED) )和催化劑和催化劑過硫酸銨過硫酸銨(ammonium persulfate (NH(ammonium persulfate (NH4 4) )2 2S S2 2O O8 8，簡稱，簡稱AP)AP)或或核黃素核黃素(ribofavin(ribofavin即即vita min Bvita min B2 2，C C1717H H2020O O6 6N N4 4) )的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠 ， 以 此 凝 膠 為 支 持 物 的 電 泳 稱 為 聚 丙 烯 酰 胺

3、 凝 膠 電 泳膠 ， 以 此 凝 膠 為 支 持 物 的 電 泳 稱 為 聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳(polyacrylamide gel electrophoresis(polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱，簡稱PAGE)PAGE)。第十五頁，共31頁。http:/ 分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系 分子量范圍 適用的凝膠濃度/(%) 蛋 白 質(zhì) 104 20-30 1-4104 15-20 1-5104-1105 10-15 1105 5-10 5105 2-5 核酸(RNA) 104 1520 104105 5-10 105-2106 2-2.6

4、第十七頁，共31頁。http:/ 聚丙烯酰胺凝膠電泳分為連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類。 目前常用的多為圓盤電泳(如圖1)和板狀電泳(如圖2)，兩者電泳原理完全相同。 第十八頁，共31頁。http:/ 不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HC1。分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9 Tris-HC1。電極緩沖液是pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液。2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素。第二十七頁，共31頁。http:/ 前導(dǎo)離子或快離子：HC1解離出的氯根(C1-) 尾隨離子(trailing ion)或慢離子：甘氨酸根(甘氨酸等電點：5.97) mclclmppmGG(Cl代表氯根，P代表蛋白質(zhì)，G代表甘氨酸根)有效遷移率=m，m為遷移率，為解離度)當(dāng)進入pH8.9的分離膠時，甘氨酸解離度增加