黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)淀粉酶

1、黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)-淀粉酶前言：-淀粉酶能隨機地作用于淀粉的非還原端，生成麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，所得產(chǎn)物的還原性末端葡萄糖單位碳原子為構(gòu)型，同時該酶能使淀粉漿的粘度下降，因此又稱為液化酶。耐酸性-淀粉酶是在酸性條件下水解淀粉的酶類，其最適pH在4.0左右。自從日本研究者 YasujiMinoda等人用黑曲霉生產(chǎn)耐酸性-淀粉酶以來，各國都對耐酸性-淀粉酶進行了研究。通過黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)-淀粉酶的實驗過程，熟悉發(fā)酵罐的構(gòu)造和使用方法。初步了解發(fā)酵生產(chǎn)的原理和常規(guī)發(fā)酵參數(shù)的檢測方法。整個實驗按照“菌種的培養(yǎng) 空消 實消接種 發(fā)酵 放罐”的發(fā)酵過程進行。在整個發(fā)酵的過程中，每隔6h取一次發(fā)酵液樣品

2、檢測其pH值、酶活、殘?zhí)橇考吧锪克膫€生理指標。最后將所測數(shù)據(jù)進行整理、分析，可以得出整個發(fā)酵過程各物質(zhì)的生成和消耗的變化規(guī)律以及如何調(diào)整培養(yǎng)條件來提高發(fā)酵生產(chǎn)的效率，對大工業(yè)生產(chǎn)具有重要的指導意義。正文：一、 實驗目的1了解發(fā)酵罐的幾大系統(tǒng)組成，即空氣系統(tǒng)、蒸汽系統(tǒng)、補料系統(tǒng)、進出料系統(tǒng)、溫度系統(tǒng)、在線控制系統(tǒng)。2掌握發(fā)酵罐空消的具體方法及步驟3掌握發(fā)酵罐進料及實消的具體方法及步驟4掌握發(fā)酵罐各系統(tǒng)的控制操作方法二、 實驗原理1. 蒸汽系統(tǒng)：蒸汽發(fā)生器：主要用于滅菌，分為自動加水和手動加水兩種方式。2. 溫度系統(tǒng)：(1) 夾套升溫：蒸汽通入夾套。(2) 夾套降溫：冷水通入夾套，下進水，上出水

3、。(3) 發(fā)酵過程自動控溫系統(tǒng)3. 空氣系統(tǒng)：空氣除菌設(shè)備：空壓機 貯氣罐 油水分離器 空氣流量計 空氣過濾器 發(fā)酵罐4. 補料系統(tǒng)：補加培養(yǎng)基、消泡劑、酸堿等。5. 在線控制系統(tǒng)6. 進出料系統(tǒng)：進料口（接種口）、出料口（取樣口）7. 管道：包括水流通管道和氣流通管道水流通：冷卻用水：水經(jīng)過進水管道 發(fā)酵罐夾套 出水口 保溫用水：關(guān)閉進出水管道閥門（水注滿后） 加熱保溫 進入夾套氣流通：蒸汽發(fā)生器 蒸汽管道 空氣過濾器/發(fā)酵罐 進入罐內(nèi)空氣：空壓機 貯氣罐 油水分離器 空氣流量計 空氣過濾器 發(fā)酵罐三·方法與注意事項原則1. 通蒸汽前先關(guān)閉所有閥門2粗過濾器不空消也不實消，要定期處

4、理，所以必須關(guān)閉通向粗過濾器的閥門。3活蒸汽，滅過頭，即尾汽不能關(guān)死，要保證有活蒸汽放出，但不能太大，以免分壓。4罐體排汽口排汽，并保持罐內(nèi)正壓。5空氣過濾系統(tǒng)只空消，不實消，以免罐中物料沖入過濾器內(nèi)。但空消一結(jié)束，即要通入無菌空氣吹干管路并保壓，避免染菌。6進蒸汽時順著蒸汽管路開閥門，結(jié)束時逆著進路關(guān)閥門，先開尾閥后開主閥，結(jié)束時先關(guān)主閥后關(guān)尾閥。8蒸汽一停，即由無菌空氣充入保持罐內(nèi)正壓。 空消先開啟蒸汽發(fā)生器，自有蒸汽產(chǎn)生并排掉管路中冷凝水后，按以下步驟進行：1先關(guān)閉所有閥門，檢查處是否關(guān)緊密封，打開罐上方排氣口。2蒸汽先進空氣系統(tǒng)，蒸汽蒸汽過濾器分過濾器，無論蒸汽走到哪一路得先放尾閥，放

5、出冷凝水，排掉冷空氣，待有蒸汽沖出后調(diào)小，打開主閥。3再進罐體：由主路進罐，然后通入取料管路，再入補料系統(tǒng)（兩邊）。4罐壓升至所需溫度（121）時開始計時，保溫保壓30min。保壓方式：（1）調(diào)節(jié)主汽路進汽閥門控制進汽量；（2）調(diào)節(jié)排氣口排氣量大小或尾閥放汽量。5結(jié)束空消：（1）逆著蒸汽進路關(guān)，先關(guān)近罐閥。（2）同時準備好壓縮空氣確保蒸汽一停即充入無菌壓縮空氣以維持空氣系統(tǒng)及罐內(nèi)的正壓。近罐空氣閥的尾閥要一直微開啟。注意：空消前應檢查夾套中是否殘留了冷水，若有，影響罐體升溫，須自夾套出水口將水放出。 種子制備：接種黑曲霉于PDA液體培養(yǎng)基中，液體搖瓶培養(yǎng)。 培養(yǎng)基配制、實消發(fā)酵培養(yǎng)基配方：可溶

6、性淀粉200 g，檸檬酸氫二銨100 g，KH2PO4 15 g，CaCl2 0.5 g，F(xiàn)eSO4.7H2O 0.05 g，MgSO4.7H2O 0.5 g，加水定容至5 L，pH5.0，消泡劑（植物油）5 mL。關(guān)閉氣路入罐閥，主汽路進汽補料口進汽（方法同空消）罐壓升至0.12Mpa（121），保壓、保溫30分鐘實消結(jié)束。 冷卻接種與發(fā)酵待培養(yǎng)基冷卻至28左右時，在加料口周圍放一圈酒精棉球，點燃，在無菌條件下打開進料口，迅速接種。將溫度、攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量等參數(shù)設(shè)定好后，進行發(fā)酵。參數(shù)監(jiān)測每隔6 h取一次樣，檢測其pH、生物量、酶活及殘?zhí)呛康戎笜恕? pH的測定：標準液校準pH計后，測定樣

7、品pH值。. 生物量的測定：每次取20-30mL的發(fā)酵液，先用大離心機(5000 rpm, 3-5 min)離心，收集上清液用來測酶活，沉淀用水清洗幾次后再離心，然后將所得沉淀放入100烘箱中，烘干（2 h左右），然后測其干重，取平均值。. 酶活：試劑：（1）碘液：稱取0.5g I2 和5.0gKI 研磨溶解于少量蒸餾水，定容至100ml，于褐色試劑瓶內(nèi)保存，避免陽光直射。（2）稀碘液：取原碘液1ml稀釋100倍。此溶液現(xiàn)配現(xiàn)用（3）0.5%淀粉液：稱取干燥過的可溶性淀粉0.5克，加5ml緩沖液，攪拌混和，再徐徐傾入70毫升煮沸的緩沖液中。繼續(xù)煮沸2分鐘，冷卻至室溫，定容至100mL。此溶液需

8、要當天配制(4) 磷酸緩沖液（pH 6.0）：0.2 mol/L K2HPO4 (12.3mL)+0.2 mol/L KH2PO4(87.7mL)方法：取5ml 0.5% 的可溶性淀粉溶液，在40水浴中預熱10 min，然后加入適當稀釋(6.0的磷酸鹽稀釋緩沖液)的酶液0.5ml，反應5min后，用5ml 0.1mol/L H2SO4 終止反應。取0.5 ml 反應液與5 ml 碘液顯色，在620 nm處測光密度。以0.5 ml水代替0.5 ml反應液為空白，以不加酶液（加同樣體積的緩沖液）的管為對照（即取5ml 0.5% 的可溶性淀粉溶液，在40水浴中預熱10 min，然后加入6.0的磷酸鹽

9、稀釋緩沖液0.5ml，反應5min后，用5ml 0.1mol/L H2SO4 終止反應。取0.5 ml 反應液與5 ml 碘液顯色）。酶活力根據(jù)下式計算：酶活力（u/ml）(R0-R)/R0×50×D，式中R0，R分別表示對照和反應液的光密度，D為酶的稀釋倍數(shù)。調(diào)整D使(R0-R)/R0在0.2-0.7之間。確定在40、5 min 內(nèi)水解1 mg淀粉的酶量為一個活力單位。. 殘?zhí)橇康臏y定：硫酸-蒽酮法測殘?zhí)呛浚?）原理糖類與濃硫酸脫水生成糖醛或其衍生物，可與蒽酮試劑縮合產(chǎn)生顏色物質(zhì)，反應后溶液呈藍綠色，于620 nm處有最大吸收，顯色與多糖含量有線性關(guān)系。（2）試劑蒽酮試

10、劑。溶解0.2 g蒽酮于濃硫酸（A. R. 95.5 %）100 ml中，當日配制試用。具體實驗過程中，應視樣品分數(shù)多少來準備蒽酮試劑的配置量。比如實測樣品有50份，為了保證結(jié)果的可靠性，安排個份樣品試驗重復數(shù)為3。因為每個試驗點實測需要4 ml蒽酮試劑，所以至少應配置的體積為4×3×50600 ml。此時還應考慮預實驗和實驗差錯所消耗蒽酮試劑量。標準糖試劑。葡萄糖溶液（可加數(shù)滴甲苯防腐）（3）操作及其注意事項分別取0.1 g/l的葡萄糖溶液0.05，0.10，0.20，0.30，0.40，0.60，0.80 ml，用蒸餾水補到1.00 ml，分別加入4.00 ml蒽酮試劑

11、，迅速進入冰水浴中冷卻，各管加完后一起浸入沸水浴中，管口加蓋玻璃球，以防蒸發(fā)。自水浴重新煮沸開始計時，準確煮沸10 min，冷卻后進行比色。以光密度為縱坐標，糖的含量微克數(shù)為橫坐標，制作標準曲線?；蚴褂糜嬎闫鬟M行一元回歸得出計算式，以便于計算使用。（4）樣品含量測定取糖濃度為50g/ml左右的樣品溶液1.00ml，一式3份分別置于不同試管中，對照加入1.0ml蒸餾水，然后給各管加入蒽酮試劑，以標準曲線方法進行比色定。根據(jù)標準曲線和樣品濃度計算含量。色氨酸含量較高的蛋白質(zhì)對顯色反應有一定的干擾。此外，試管在加入蒽酮試劑過程中，移液管尖端在試管中所停留的高度對于加入蒽酮試劑的速度影響較大，而且對反

12、應產(chǎn)生顏色的深淺都會產(chǎn)生一定的影響。因此，實驗操作應該注意。數(shù)據(jù)處理 實驗報告（前言、材料、結(jié)果、討論等）罐體清洗四:結(jié)果及分析酶活變化：時間（h）0612182430364248546066酶活03484567681150123513512886743696281116612980殘?zhí)呛孔兓簳r間（h）0612182430364248546066殘?zhí)呛?.141.9011.5281.151.4122.2010.6481.3751.9461.4391.2310.802Ph值；時間（h）0612182430364248546066pH值 5.085.094.724.994.684.684.5

13、4.274.234.174.043.96生物量（g）時間（h）0612182430364248546066生物量(g)00.0260.0410.1880.03580.05090.07650.06980.07020.12870.06070.1161實驗結(jié)果分析：1、a-淀粉酶的活力總體上是呈上升趨勢，在發(fā)酵初期，由于菌種的代謝慢，總量少，所以0-36h內(nèi)酶活測定數(shù)值比較小，上升幅度也較小，此后，由于菌種達到對數(shù)期和穩(wěn)定期黑曲霉的產(chǎn)酶能力加強，酶活不斷升高，且上升幅度也大大提高，；從總體上看酶活值的變化是越來越大,在開始的一段時間內(nèi)酶活值的變化幅度不大,這是因為剛開始黑曲霉接種到發(fā)酵罐里,有一段時

14、間的延滯期,盡管時間不長;而且剛開始黑曲霉的數(shù)量相對于發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基的量而言畢竟是少的，因此導致曲線開始階段變化較緩慢，以后的時間里黑曲霉大量增殖，數(shù)量增加以后產(chǎn)生的酶量便不斷增加。 2、殘?zhí)堑淖兓碚撋蠎撌窃絹碓叫?，但是實驗中殘?zhí)堑牟▌颖容^大，歸結(jié)原因可能如下： 試驗中所使用的蒽酮和淀粉溶液雖是現(xiàn)配現(xiàn)用，但是由于操作不是很嫻熟，淀粉溶液時間稍長就會出現(xiàn)沉淀，這是結(jié)果波動性變化大的最主要的原因； 操作不規(guī)范，稀釋倍數(shù)不合理，也可能導致數(shù)據(jù)波動性較大3、pH值大體上是呈下降趨勢，但變動的幅度不大，這可能是接入的的黑曲霉量較少，以致黑曲霉在發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的CO2及酸性物質(zhì)對培養(yǎng)基的影響較小。0-12h變化幅度不大，基本上維持在5.1左右，此時是由于黑曲霉在發(fā)酵罐中的延遲效應，菌種代謝不旺盛，故pH的變化不大，隨后隨著菌種的活化，菌種新陳代謝的旺盛，CO2的釋放以及糖濃度的降低使得發(fā)酵液的pH值逐漸下降，發(fā)酵后期，菌種的活力下降，溶液的各理化性質(zhì)趨于穩(wěn)定pH保持在4.5左右。4、生物量變化 理論上其變化是隨著時間的推移而逐漸增加的，但由于取樣后實驗操作的失誤導致結(jié)果的波動性很大。 實驗感受：通過本次試驗我們直觀地觀察了微生物發(fā)酵的