海藻糖對(duì)液態(tài)低溫保存血小板保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究(一)

1、海藻糖對(duì)液態(tài)低溫保存血小板保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究(一)    作者：崔云，劉璐，黃成垠，尹其華,黃鷹 摘要 目的：研究海藻糖對(duì)液態(tài)低溫（4）保存血小板的保護(hù)作用。方法：采集兔心臟血，按常規(guī)方法制備濃縮血小板（CP），在CP中加入不同濃度的海藻糖，4儲(chǔ)存，用51Cr鉻酸鈉進(jìn)行標(biāo)記后自體回輸入兔體內(nèi)，于回輸后1、24、48、72h抽取兔耳動(dòng)脈血，測定放射性計(jì)數(shù)率，計(jì)算24、48、72h血小板存活率，同時(shí)設(shè)常溫對(duì)照組及單純4儲(chǔ)存的低溫對(duì)照組進(jìn)行比較。結(jié)果：加入不同濃度海藻糖各儲(chǔ)存組的血小板壽命明顯長于低溫對(duì)照組，并且隨著海藻糖濃度的增加而延長。結(jié)論：海藻糖可延長4

2、液態(tài)保存血小板的壽命，對(duì)血小板具有保護(hù)作用。關(guān)鍵詞海藻糖；血小板；液態(tài)；儲(chǔ)存；4；51鉻Abstract：Objective To study the protection of trehalose for liquid rabbit platelets stored at 4 traced by 51Cr. Methods Cardiac blood was taken and made into concentrated platelet(CP).CP were stored at different conditions,such as low temperature and low t

3、emperature+different dose of trehalose for 24h.Platelets were transfused into rabbits bodies after being labelled with 51Cr and platelet lifespan of 24,48,72h was calculated. Results After trehalose was added into the platelets stored at 4,the lifespan was obviously longer than that of platelets sto

4、red at low temperature. And with the dose increasing,the lifespan of platelets wes prolonged obviously till the dose was more than 50mg?ml-1. Conclusion Trehalose， protecting platelets, can prolong the lifespan of liquid platelets stored at low temperature.Key words：trehalose; platelet; liquid;stora

5、ge; 4; 51Cr 海藻糖對(duì)液態(tài)低溫保存血小板保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究在對(duì)大量失血和化療、放療等處理造成血小板減少患者的治療過程中,需要進(jìn)行血小板輸注。血小板在儲(chǔ)存過程中存在的一些不足，使之不能適應(yīng)臨床需求，如：22 常溫振蕩儲(chǔ)存易使血小板遭受細(xì)菌污染，污染幾率是低溫儲(chǔ)存的50倍，輸入體內(nèi)后可能會(huì)造成機(jī)體膿毒性敗血癥，并且儲(chǔ)存時(shí)間短于5d；深低溫可長期大量儲(chǔ)存血小板,并能夠進(jìn)行遠(yuǎn)距離運(yùn)輸,有效利用全血中的血小板成分，但血小板深低溫儲(chǔ)存時(shí)所用的保護(hù)劑二甲基亞砜（DMSO）對(duì)患者有毒副作用，在洗滌去除DMSO的過程中，血小板易被激活、損傷而喪失其臨床應(yīng)用價(jià)值 1。近年來，血小板液態(tài)低溫保存倍受關(guān)注。

6、隨著對(duì)液態(tài)低溫下血小板誘導(dǎo)活化及在體內(nèi)清除機(jī)制研究的不斷深入，血小板保存技術(shù)取得了突破性的進(jìn)展。液態(tài)低溫可使血小板被激活、損傷，壽命縮短。海藻糖（trehalose）是一種非還原性雙糖，能抑制寒冷所致的血小板膜側(cè)向分離和血小板聚集1，阻止血小板活化、損傷，是很有潛力的血小板低溫保護(hù)劑。本實(shí)驗(yàn)采用同位素51Cr示蹤技術(shù)對(duì)海藻糖是否可延長4液態(tài)儲(chǔ)存中血小板的壽命進(jìn)行探索。1 材料和方法1.1 主要材料海藻糖：C12H22O11?2H2O，相對(duì)分子質(zhì)量378.33，上海恒信化學(xué)試劑有限公司（原上海試劑二廠）生產(chǎn)；ACD抗凝劑：型號(hào)DIN00788139，美國Baxter Fenwal公司生產(chǎn)；GC9

7、11放射免疫計(jì)數(shù)器：科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司生產(chǎn)。2.02.5kg健康雄性新西蘭大白兔21只，912月齡，由東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.2 方法每只兔取10ml心臟血，與1.5ml ACD抗凝劑混勻， 1000 r?min-1離心10min；取上層血漿至另一離心管中，再以3000 r?min-1離心20min（22）；之后將上層血漿移至另一試管中備用，下層血小板中加備用自體血漿1ml，使血小板懸浮。第1組（常溫對(duì)照組）：將以上制備的CP置于22水浴鍋中溫浴24h；第2組（低溫對(duì)照組）：將以上制備的CP置于4冰箱儲(chǔ)存24h；第38組：CP中依次加入濃度為20、30、40、50、60

8、及70mg?ml-1的海藻糖1ml，混勻，37水浴鍋中溫浴后于4 冰箱儲(chǔ)存24h。取出儲(chǔ)存的CP，于室溫（22）下以3000r?min-1離心20min，棄上清，加生理鹽水1ml，使血小板懸浮，然后加入1.11MBq Na251CrO4，37水浴鍋中溫浴45min，其間振蕩數(shù)次；之后再以3000r?min-1離心20min，棄上清，加備用自體血漿1ml，使血小板懸浮2。將以上標(biāo)記好的1ml血小板通過兔耳緣靜脈自體回輸入兔體內(nèi)，于回輸后1、24、48、72h抽取1ml兔耳動(dòng)脈血，測定放射性計(jì)數(shù)率，并以1h時(shí)血液的放射性計(jì)數(shù)率作為100%，計(jì)算24、48、72h血小板存活率。根據(jù)公式A=lg1（l

9、gC-b），將測量所得的動(dòng)物器官組織樣本的計(jì)數(shù)率值換算成動(dòng)物器官組織樣本的放射性攝取（ID%?g-1）。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所得數(shù)據(jù)以±s表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2 結(jié)果4儲(chǔ)存的低溫對(duì)照組血小板各時(shí)間段的存活率非常低，24h存活率只有(6.38±2.88)%, 72h時(shí)只有（3.86±1.06）%，說明4儲(chǔ)存的血小板輸入體內(nèi)后壽命很短。加入不同濃度海藻糖4 24h儲(chǔ)存各組（第38組）各時(shí)間段血小板存活率明顯高于4儲(chǔ)存的低溫對(duì)照組（P0.05），并且隨著海藻糖濃度的增加，各時(shí)間段存活率也增加，當(dāng)濃度達(dá)到50mg?ml -1時(shí)，24、48及72h存活率分別達(dá)到（5

10、9.16±2.05）%、（51.95±2.81）%及（40.44±2.43）%，并且超過此濃度，各時(shí)間段存活率不再增加，即50mg?ml-1海藻糖組與60、70mg?ml -1海藻糖組無明顯差異。見表1。表1 不同儲(chǔ)存條件下血小板的存活率（略）3 討論研究表明，低溫下血小板的生理學(xué)性質(zhì)及形態(tài)會(huì)發(fā)生改變，使其被活化、損傷，壽命縮短1,3。當(dāng)它們置于低溫下時(shí)，形態(tài)會(huì)從正常的鐵餅狀變成圓球狀，周邊形成許多偽足，同時(shí)伴有血小板胞漿內(nèi)的鈣離子明顯增加，微管解聚，肌動(dòng)蛋白增加5倍以上。此外，血小板4低溫保存24h以上會(huì)出現(xiàn)顆粒的聚集和釋放，類似于血小板正常生理激活過程，之后血

11、小板幾乎失去活性。胞漿內(nèi)鈣離子的迅速增加及骨架肌動(dòng)蛋白的集結(jié)裝配，不僅使血小板形態(tài)發(fā)生異常改變,還可以使其膜發(fā)生脂相轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致側(cè)向分離,使細(xì)胞膜通透性增加,一些離子通過離子通道不受控制而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),最終結(jié)果是出現(xiàn)蛋白變性和水腫、自由基過度產(chǎn)生、細(xì)胞骨架改變等現(xiàn)象,使血小板容易被激活。膜側(cè)向分離可形成許多小的集團(tuán),這些集團(tuán)由一些排列整齊的膜蛋白組成。研究者將這些小的集團(tuán)分離出來后,發(fā)現(xiàn)其中包含有血小板凝血酶蛋白受體CD36及非受體類酪氨酸激酶類src、lyn及fyn,表明這些集團(tuán)在細(xì)胞信號(hào)通路中起著一定作用,并且通常是使血小板激活的信號(hào)通路,在沒有凝血酶存在的情況下可使血小板發(fā)生異常激活4。海藻

12、糖是一種天然存在的非還原性雙糖,無論是內(nèi)源性還是外源性,對(duì)生物體和生物大分子都具有良好的非特異性保護(hù)作用,還能夠有效抑制寒冷所致的血小板膜側(cè)向分離和血小板聚集1，因此，近年來倍受人們關(guān)注，成為一種很有潛力的血小板低溫保護(hù)劑。以往海藻糖都是作為血小板冷凍干燥保存保護(hù)劑，并且顯示出良好的應(yīng)用前景。但是，冷凍干燥保存再水化過程容易使血小板形態(tài)結(jié)構(gòu)、表面糖蛋白發(fā)生改變，不可避免地發(fā)生血小板的激活、損傷。因此，近年來許多研究者對(duì)液態(tài)保存血小板進(jìn)行新的嘗試,如在4液態(tài)保存血小板中加入抑制細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白、第二信使抑制劑、海藻糖和抗凍蛋白等,防止血小板受到激活而損傷5。本實(shí)驗(yàn)即對(duì)液態(tài)低溫血小板中加入海藻糖進(jìn)

13、行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血小板加海藻糖4 24h儲(chǔ)存各組各時(shí)間段血小板存活率明顯高于4儲(chǔ)存組（P0.05），說明海藻糖可有效延長液態(tài)低溫儲(chǔ)存后血小板在體內(nèi)的壽命。其原因在于海藻糖可防止蛋白質(zhì)變性，抑制低溫下血小板膜側(cè)向分離及損傷。海藻糖與葡萄糖及蔗糖一樣,其羥基也能代替水分子同蛋白質(zhì)分子表面部分結(jié)合,對(duì)蛋白質(zhì)形成保護(hù),同時(shí)海藻糖的分子較小,易于以分子形式填充到蛋白質(zhì)分子的空隙中,有效限制蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,從而避免蛋白質(zhì)變性失活6。低溫下,海藻糖可作為一種水分替代分子,避免血小板生物膜發(fā)生固相液相轉(zhuǎn)變、側(cè)向分離，防止血小板活化而壽命縮短7。此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加入不同濃度海藻糖低溫儲(chǔ)存各

14、組血小板壽命雖均低于常溫對(duì)照組，但常溫下血小板容易受細(xì)菌污染，儲(chǔ)存時(shí)間短于5d，而海藻糖對(duì)血小板有良好保護(hù)作用的同時(shí)，還能使血小板長時(shí)間儲(chǔ)存，可滿足臨床上對(duì)血小板的大量需求?？傊?，海藻糖對(duì)液態(tài)低溫下血小板的壽命有較明顯的延長作用，因此，海藻糖在血小板液態(tài)低溫儲(chǔ)存中具有一定的應(yīng)用前景。相信本實(shí)驗(yàn)將為血小板儲(chǔ)存技術(shù)的發(fā)展及其適應(yīng)臨床需求提供依據(jù)。參考文獻(xiàn)1TABLIN F, WOLKERS W F, WALKER N J, et al. Membrane reorganization during chilling: implications for longterm stabilization of plateletsJ. Cyobiology, 2001, 43(2): 114123.2李家增，王鴻利，韓忠朝.血液實(shí)驗(yàn)學(xué)M