BD調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

1、關(guān)于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞不同的亞群，類似的功能調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）在維持機體免疫平衡方面具有非常重要的作用。Tregs通過抑制其他T細(xì)胞的功能而抑制免疫反應(yīng)。一些自身免疫性疾病如多發(fā)性硬化癥、活動性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、I型糖尿病等Tregs的數(shù)量和功能均會發(fā)生變化。在許多惡性疾病如肺、胰腺和乳腺癌等已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Tregs明顯增高。Tregs也阻斷抗腫瘤免疫反應(yīng)從而導(dǎo)致死亡率上升。CD4和CD8 TregsTregs目前確定的兩個主要類別為：CD4 Tregs和CD8 Tregs。CD4 Tregs分為兩類：“天然”Tregs（n Tregs），其表達(dá)CD25和FoxP3；和適應(yīng)性或者稱為誘導(dǎo)性Tregs

2、（i Tregs）。天然Tregs源自胸腺的CD4+ 細(xì)胞，該細(xì)胞CD25強陽性并表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子（和系標(biāo)志）FoxP3。 n Tregs約占總CD4+ T細(xì)胞的5-10%, 并可以在T淋巴細(xì)胞發(fā)育的單陽性階段首先出現(xiàn)， 2 由于具有與自身抗原的高親和力而被陽性選擇，該信號傳遞時通過T細(xì)胞受體和胸腺基質(zhì)細(xì)胞上的帶有自身抗原肽的MCH-II復(fù)合體相互作用傳遞。 3 n Tregs屬于細(xì)胞因子非依賴型。適應(yīng)性或誘導(dǎo)性Tregs來源于胸腺CD4單陽性細(xì)胞，他們分化為CD25和FoxP3表達(dá)的Tregs（i Tregs）需要有足夠的同源抗原和特異

3、的免疫調(diào)節(jié)因子如TGF-、IL-10及 IL-4刺激。 4FoxP3是目前Tregs最特異的標(biāo)記，盡管有報道一小部分Tregs 中 FoxP3 陰性。轉(zhuǎn)錄因子FoxP3作為Tregs標(biāo)志的發(fā)現(xiàn)使科學(xué)家們能夠更好地確定Tregs細(xì)胞群并且發(fā)現(xiàn)包括CD127在內(nèi)的其他的Tregs標(biāo)志。CD127的發(fā)現(xiàn)從Barbara Fazekas de St. Groth（癌癥醫(yī)學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，悉尼，澳大利亞）Jeffrey Bluestone（UCSF的糖尿病中心，舊金山，加州，美國）實驗室的研究和BD生物科學(xué)實驗室證據(jù)表明CD127在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)是下調(diào)的，與FoxP3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。而

4、且，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在表達(dá)高和低水平CD25的細(xì)胞群中也是以不同水平存在的。CD127的發(fā)現(xiàn)提供了Tregs的一個新的表面標(biāo)記 5,6 從而可以通過流式細(xì)胞儀分選活的Tregs進一步進行下游分析。CD127是異構(gòu)IL-7受體的一部分，異構(gòu)IL-7受體是由CD127和通用鏈組成，鏈在其他細(xì)胞因子受體（IL-2R、IL-4R、IL-9R、IL-15R和IL-21R）也存在。CD127表達(dá)于胸腺細(xì)胞、T和B祖細(xì)胞、成熟T細(xì)胞、單核細(xì)胞以及一些其他的淋巴細(xì)胞和骨骼細(xì)胞上。有研究顯示IL-7R在成熟T細(xì)胞增殖和分化過程中其重要作用。體外實驗表明，CD127的表達(dá)隨著T細(xì)胞活化而下調(diào)，&#

5、160;7-9 這是因為FoxP3與CD127啟動子相互作用從而降低Tregs的CD127表達(dá)。 6Treg 亞群 自然調(diào)節(jié)T細(xì)胞 (nTregs)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)T細(xì)胞 (iTregs) nTregsTr1Th3顯型CD4+CD25int/high, CD127lowCD4+CD25-CD4+CD25+ from CD25- precursors其他輔助標(biāo)記CTLA4+, GITR+, FoxP3+, CD127lowCD25low-variable, CD45RBlow, FoxP3-CD25low-variable, CD45RBlow

6、, FoxP3+抑制Contact dependent, granzyme B-dependent, makes TGF-Through cytokines produces IL-10Through cytokines, produces TGF-靶細(xì)胞APC and T effector cellsT effector cellsNot yet Identified包含CD28Thymic development and maintenance in peripheryNot for development or functionNot involved體內(nèi)作用Suppression of

7、 autoreactive T cellsMucosal immunity, inflammatory responseMucosal immunity, inflammatory response體外擴增Expandable using TCR/CD28 stimulation and IL-2CD3, IL-10, rehnoic acidCD3, TGF-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的鑒別FoxP3：經(jīng)典的Tregs標(biāo)志盡管已有多種標(biāo)志可以用于Tregs的鑒別，但在FoxP3發(fā)現(xiàn)之前尚未有特異的Tregs標(biāo)志。目前，F(xiàn)oxP3作為唯一的Tregs特異標(biāo)志已經(jīng)在Sakaguchi和Rudensky的研究中

8、報道過。FoxP3（也稱Scurfin，IPEX和JM2）是轉(zhuǎn)錄因子forkhead或winged helix家族的轉(zhuǎn)錄抑制因子。 13 它在所有CD4+ Tregs中表達(dá)，并具有調(diào)節(jié)活性。FoxP3的突變與鼠遺傳性自身免疫性皮屑疾病和人的IPEX疾?。庖哒{(diào)節(jié)異常，多發(fā)內(nèi)分泌疾病和腸病，X-染色體綜合癥）密切相關(guān)。 14FoxP3對于確定分選出的Tregs的純度和產(chǎn)量，及鑒定確定的Tregs都非常有用。但是，它不適用于分離活的Tregs，因為FoxP3的染色必須要固定細(xì)胞并破膜，所以這CD127-是更好的選擇。FoxP3染色來自于BD生物科學(xué)的人Fox

9、P3單克隆抗體（克隆259D/C7）與人FoxP3轉(zhuǎn)錄因子所有已鑒定過的亞型都能反應(yīng)，并且也與獼猴、恒河猴和狒狒有交叉反應(yīng)。BD Pharmingen的人FoxP3抗體和緩沖液試劑盒是一種高效地用來檢測FoxP3陽性Tregs的試劑盒。這種簡單易行的緩沖液體系可以使研究者只用很少的步驟就能完成細(xì)胞固定和破膜。但如果用凍存樣品的方法至少需72h。支持新的目標(biāo)標(biāo)記列表FoxP3是一種經(jīng)常用于調(diào)節(jié)T細(xì)胞鑒定、分離和表征的標(biāo)記物。但是，Tregs依然是目前研究的熱點，并且文獻(xiàn)中發(fā)表了新型目標(biāo)標(biāo)記物的列表。為了支持這些新的發(fā)現(xiàn)，BD Bioscience也不斷地研發(fā)出新的高質(zhì)量試劑和溶液。CD39：增強

10、Tregs的鑒別以前研究發(fā)現(xiàn)CD39主要位于B細(xì)胞、樹突細(xì)胞和某些T細(xì)胞亞型，現(xiàn)在的研究表明CD39與FoxP3共表達(dá)于人和小鼠的CD4+ Tregs。 15 這一發(fā)現(xiàn)也增加到Tregs不斷增加的表面標(biāo)記物列表中，列表中有諸如CD25、CD45RA、HLA-DR和CTLA-4等表面標(biāo)記物，這些標(biāo)記物對于CD4+ Tregs的識別和功能鑒定是至關(guān)重要的。細(xì)胞外ATP和它的代謝產(chǎn)物是調(diào)節(jié)大部分細(xì)胞和器官功能的有效調(diào)節(jié)分子。細(xì)胞ATP釋放的是組織破壞的標(biāo)記和激活免疫系統(tǒng)的一種危險“信號”。CD39水解細(xì)胞外ATP（或者其他三磷酸苷）成為相應(yīng)的核苷酸，如AMP等

11、。細(xì)胞外的單磷酸核苷很好被可溶性或者膜結(jié)合的5-外核酸酶（CD73）降解為核苷（如腺苷）。然后，細(xì)胞外周的腺苷介導(dǎo)抗炎癥性的T細(xì)胞反應(yīng)。CD39和CD73的共表達(dá)被認(rèn)為是Tregs介導(dǎo)免疫抑制的一個關(guān)鍵機制。 16,17BD Pharmingen的抗人CD39（Clone TÜ66）單克隆抗體是人Tregs的新型標(biāo)記物，并且提供PE及APC標(biāo)記的即用型流式細(xì)胞術(shù)試劑盒。TÜ66能夠識別ENTPD1，ENTPD1是一種胞外酶，屬于核苷三磷酸二磷酸酶類家族（ENTPDase）。該家族的成員參與胞外核苷酸的分解代謝，控制胞外核苷三磷酸的量（NTPs）。CD152 (CT

12、LA-4)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4（CTLA-4或CD152）在對Tregs的抑制功能中是至關(guān)重要的。 18 在zheng等人的一項研究中，將CD152轉(zhuǎn)染CD25-FoxP3-T細(xì)胞，得到具有抑制功能且并不表達(dá)FoxP3。 19其他研究組的研究也表明，阻斷CD152也減弱Tregs細(xì)胞的抑制活性。CD152的異常表達(dá)在自身免疫疾病如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等中也有一定作用。 19CD152在樹突細(xì)胞中介導(dǎo)抑制活性是通過下調(diào)樹突細(xì)胞CD80和CD86的表達(dá)，進而影響抗原呈遞細(xì)胞激活其他T細(xì)胞的能力。 20關(guān)于CD152的研究促進了我們對于Tregs功能的理

13、解。已知的Tregs細(xì)胞類型，現(xiàn)有的標(biāo)記物以及新興的標(biāo)記物將極大地促進Tregs研究的新發(fā)現(xiàn)。已有報道的人類調(diào)節(jié)性T細(xì)胞標(biāo)記這份表格集錦了人類調(diào)節(jié)性T細(xì)胞研究的中最常用到的試劑。我們的試劑品種在不斷擴展。敬請訪問抗原人類表型參考文獻(xiàn)編號CCR4positive21, 22CCR6positive22CCR7positive23CD4positive12, 24, 25CD11ahigh26, 27CD25positive28CD39positive and negative subsets29CD45RApositive30CD45R0positive31CD46positive10CD54

14、(ICAM-1)high CD62Llow and high subsets32CD69positive33CD103positive34CD122 (IL-2R)positive CD127low5, 6CD134 (OX-40)positive and negative subsets35CD152 (CTLA-4)high36, 37CD154 (CD40L)positive38CD223/LAG-3positive39, 40, 46CXCR4positive33CXCR5positive33CXCR6positive33FoxP3positive41, 42GIT

15、Rhigh43GPR83positive44Granzyme Bpositive45IL-10positive46IL-35positive47MHCIIpositive48Neuropilin 1positive49Perforinpositive50TGF-positive51調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的富集利用CD4、CD25和CD127富集TregsTregs含量低，為了下游實驗富集往往是必要的。已有幾種富集全部Tregs或其亞群的方法。雖然FoxP3是目前公認(rèn)的Tregs最特異的指標(biāo)，但因其位于細(xì)胞內(nèi)而限制了它在分離活的Tregs中的應(yīng)用。其他用于富集的有陰性選擇的、陽性選擇的或聯(lián)合使用。一種已報

16、道的陰性選擇方法是除去表達(dá)CD127和CD49d的細(xì)胞。 10 陽性選擇是收集表達(dá)CD4陽性和CD25強陽性的細(xì)胞。聯(lián)合的方法包括在細(xì)胞分選前使用磁珠除去非目的細(xì)胞群。一個最好的富集方法是收集CD4 +、CD25 +和CD127 -細(xì)胞。利用CD4和CD25富集Tregs在人類，最初的Tregs亞群的分析表明只有體外高水平表達(dá)CD25（約占總CD4 T細(xì)胞2-3%）的細(xì)胞在體外才有抑制功能， 11,12 這是相對于把高表達(dá)CD25的細(xì)胞都當(dāng)做Tregs的小鼠細(xì)胞而言。 4,5 而且表達(dá)低到中等水平CD25

17、的細(xì)胞在體外沒有抑制活性另外，CD25表達(dá)的高與低水平缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)并且用流式細(xì)胞儀分選人的活Tregs時有一定局限性。結(jié)果，許多研究者僅選擇高表達(dá)CD25的細(xì)胞，明顯減少Tregs分選產(chǎn)量。這些結(jié)果迫使要想得到高產(chǎn)量的人Tregs必須尋找除了CD4和CD25外其他的表面標(biāo)記。cvscc用CD127判定和分離人的活Tregs用CD4、CD25和CD127染色人CD4 T細(xì)胞可以富集活的Tregs細(xì)胞進行進一步培養(yǎng)或其他的體外實驗。用這種方法，通過細(xì)胞分選可快速分出活的Tregs細(xì)胞。BD Pharmingen的人調(diào)節(jié)T細(xì)胞試劑盒，將三色試劑混在一起，利用CD4+CD25int/highCD127low圈門簡化了富集活Tregs細(xì)胞過程。這種方法分選的CD25int/highTregs細(xì)胞的回收率增加了2-4倍，而且減少了CD25 -/int效應(yīng)細(xì)胞的污染。用磁珠分選預(yù)富集CD4+細(xì)胞可以增加人Treg細(xì)胞的產(chǎn)量人Tregs占全部CD4+細(xì)胞的小部分。一種增加Tregs產(chǎn)量的方法是用BD IMagTM磁珠技術(shù)預(yù)富集CD4+細(xì)胞和采用C