天然產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

1、實(shí)驗(yàn)一 水蒸氣蒸餾法提取萜類(lèi)及揮發(fā)油一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解水蒸汽蒸餾的基本原理和應(yīng)用，掌握水蒸汽蒸餾的方法。2、掌握萜類(lèi)和揮發(fā)油的提取原理及方法。二、基本原理水蒸汽蒸餾的操作是將水蒸汽通入有機(jī)物中，或?qū)⑺c有機(jī)物一起加熱，使有機(jī)物與水共沸而蒸餾出來(lái)的過(guò)程。水蒸汽蒸餾是分離和提純有機(jī)物質(zhì)的常用方法。當(dāng)兩種互不相溶的液體混合在一起時(shí)，混合物的蒸氣壓應(yīng)為各組分蒸氣壓之和。由于兩種組分互不相溶，彼此相互影響很小，混合物中每一組分在某溫度下的分壓等于其純態(tài)時(shí)在該溫度下的蒸氣壓。當(dāng)混合物受熱至各組分的蒸氣壓之和等于外界大氣壓時(shí)混合物即沸騰。例如，把苯胺和水的混合物加熱至98.4，混合物開(kāi)始沸騰。因?yàn)樵?8.

2、4時(shí)，苯胺的蒸氣壓為42mmHg，水的蒸氣壓為718mmHg，兩者相加等于760mmHg。顯然，苯胺水混合物的沸點(diǎn)既低于苯胺的沸點(diǎn)（184.4），也低于水的沸點(diǎn)。因此，沸點(diǎn)高于100的有機(jī)物，利用水蒸汽蒸餾，可以在低于100的溫度下蒸餾出來(lái)。根據(jù)氣體分壓定律，水蒸汽蒸餾的混合蒸氣中個(gè)別氣體分壓（PA、P水）之比等于它們的摩爾數(shù)之比（nA、n水表示這兩種物質(zhì)在一定容積的氣相中的摩爾數(shù)），即：PA：P水= nA：n水 ，因?yàn)轲s出液是由蒸氣冷凝而來(lái)的，餾出液中A與水的摩爾數(shù)之比同樣是nA：n水。而nA = WA / MA，n水= W水/ M水，（MA、M水為A和水的分子量；WA、W水為A和水的重量）

3、。因此有：WA / W水= (MAnA) / (M水n水) = (MAPA) / (M水P水)由上式可見(jiàn)，餾出物中有機(jī)物和水的相對(duì)重量與其蒸氣壓和分子量成正比。式中P 水可通過(guò)手冊(cè)查得，PA可近似地以大氣壓與P水之差計(jì)算（PA=P大氣P水），P大氣可由氣壓計(jì)上讀得。例如，將苯胺與水的混合物進(jìn)行水蒸汽蒸餾，混合沸騰（98.4）時(shí)，查水的蒸氣壓為718mmHg，大氣壓為760mmHg，P苯胺= 760718 = 42mmHg。苯胺的分子量為93，所以餾出液中苯胺與水和重量比為：W苯胺/ W水= （93×42）/（18×718）=1 / 3.3，即每蒸出3.3g水能夠帶出1g 苯

4、胺。由于苯胺略溶于水，這個(gè)計(jì)算所得的僅為近似值。從以上公式和計(jì)算可以看出，水蒸汽蒸餾的效率與有機(jī)物的分子量MA和蒸氣壓PA有關(guān)，MA愈大；PA愈高，水蒸汽蒸餾的效率也愈高。但由于分子量愈大的物質(zhì)其蒸氣壓愈低，因而實(shí)際上很難兩全。由上述原理可見(jiàn)，使用水蒸汽蒸餾分離提純有機(jī)物應(yīng)具備以下條件：(1) 不溶于水或難溶于水；(2) 與水長(zhǎng)時(shí)間煮沸不發(fā)生化學(xué)變化；(3) 在100左右，必須具有一定的蒸氣壓（至少5mmHg 以上，（一般不少于1.3332 kPa）。）；水蒸汽蒸餾常用于下列幾種情況：(1) 某些沸點(diǎn)高的有機(jī)物，在常壓下蒸餾雖可與副產(chǎn)品分離，但其本身易破壞；(2) 混合物中含有大量樹(shù)脂或不揮發(fā)

5、性雜質(zhì)，采取普通蒸餾、萃取等方法都難以分離；(3) 從較多固體反應(yīng)物中分離出被吸附的液體；(4) 從天然物中提取精油等。三、基本操作1、水蒸汽蒸餾裝置如圖所示，主要由水蒸汽發(fā)生器，長(zhǎng)頸圓底燒瓶、直形冷凝管和接受器組成。水蒸氣蒸餾有兩種方法：種是將水蒸氣發(fā)生器產(chǎn)生的水蒸氣通入盛有被蒸物的燒瓶中，使被蒸物與水一起蒸出；另一種方法是將水加入到裝有被蒸物的燒瓶中，與普通蒸餾方法相同，直接加熱燒瓶，進(jìn)行蒸餾，這是一種簡(jiǎn)化了的水蒸氣蒸餾方法；當(dāng)蒸餾時(shí)間較短，不需耗用大量水蒸氣時(shí)，可采用這種方法。（1）水蒸汽發(fā)生器A是金屬制品，也可用圓底燒瓶代替。器內(nèi)盛水約一半（1/2-2/3）。長(zhǎng)玻璃管B 為安全管（0.

6、5-1m），管的下端幾乎插到發(fā)生器的底部（距底部1cm）。當(dāng)容器內(nèi)氣壓太大時(shí)，水可沿著玻璃管上升以調(diào)節(jié)內(nèi)壓。如果蒸餾系統(tǒng)發(fā)生阻塞，水便會(huì)從玻璃管的上口噴出，此時(shí)應(yīng)檢查圓底燒瓶?jī)?nèi)的蒸氣導(dǎo)管下口是否被堵塞。（2）長(zhǎng)頸圓底燒瓶D是蒸餾器（加入樣品體積不超過(guò)1/3），用鐵夾在頸下部夾緊，并和桌面成450角，以免飛濺起的液體被蒸氣帶進(jìn)冷凝管中。瓶口配雙孔軟木塞，一孔插入水蒸汽導(dǎo)管C（彎成約125°角與T形管相連），其末端應(yīng)彎曲，使之垂直正對(duì)瓶底中央并接近瓶底，以便水蒸汽和被蒸餾物質(zhì)充分接觸并起攪動(dòng)作用。此管的外徑一般不小于7mm，以保證水蒸汽暢通。另一孔插入水蒸汽導(dǎo)出管E（為30°角

7、），此管應(yīng)略為粗一些，其外徑約為10mm，以便蒸氣能暢通地進(jìn)入冷凝管中。若管E的直徑太小，蒸氣的導(dǎo)出將受到一定的阻礙，這會(huì)增加燒瓶D 的壓力，導(dǎo)管E在彎曲處前的一段應(yīng)盡可能短些，在彎曲處后一段則允許長(zhǎng)些，因它可起部分的冷凝作用。由于許多反應(yīng)是在三口瓶中進(jìn)行的，直接用該三口瓶作為水蒸氣蒸餾的蒸餾瓶就可避免轉(zhuǎn)移的麻煩和產(chǎn)物的損失。（3）長(zhǎng)的直型冷凝管F可以使蒸氣充分冷卻。由于水的蒸發(fā)熱較大，所以冷卻水的流速也宜稍大一些。（3）T 形管發(fā)生器A的支管和水蒸汽導(dǎo)入管C 之間用一個(gè)T 形管相連接，在T 形管的支管上套一段短橡皮管，用螺旋夾旋緊，打開(kāi)螺旋夾，可以及時(shí)放掉蒸氣冷凝形成的水滴。在操作中，如果發(fā)

8、生不正?，F(xiàn)象，應(yīng)立刻打開(kāi)T 形管的夾子，使之與大氣相通。2、其它連接方法 A水蒸氣發(fā)生器；B液面計(jì)；C安全管；DT形管；E彈簧夾；F蒸餾瓶；G導(dǎo)氣管；HY形管；I蒸餾頭；J直形冷凝管；K尾接管；L接收瓶3、操作儀器安裝好后，把要蒸餾的物質(zhì)倒入燒瓶D 中，其量約為燒瓶容量的1/3，操作前，水蒸汽蒸餾裝置應(yīng)經(jīng)過(guò)檢查，必須嚴(yán)密不漏氣。開(kāi)始蒸餾時(shí)，先把T 形管上的夾子打開(kāi)，用直接加熱法將發(fā)生器內(nèi)的水加熱至沸。當(dāng)有大量的水蒸汽從T 形管的支管流出時(shí)再旋緊夾子，讓水蒸汽通入燒瓶中，這時(shí)可以看到瓶中的混合物翻滾不息，不久就會(huì)在冷凝管中出現(xiàn)蒸氣冷凝為乳濁液，流入接受器。調(diào)節(jié)火焰，使瓶?jī)?nèi)混合物不致飛濺得太厲害，

9、并控制餾出液的速度約為23 滴/s。為了使水蒸汽不致在燒瓶?jī)?nèi)過(guò)多的冷凝，（如被蒸餾的物料較多，溫度又較低），可先在圓底燒瓶下放一石棉網(wǎng)，用小火加熱。在操作時(shí)，要隨時(shí)注意安全管中的水柱是否發(fā)生不正常的上升現(xiàn)象以及燒瓶中的液體是否發(fā)生倒吸現(xiàn)象。一旦發(fā)生這種現(xiàn)象應(yīng)立刻打開(kāi)T 形管上的夾子，移去火源，找出發(fā)生故障的原因，才可繼續(xù)蒸餾。當(dāng)餾出液澄清透明不再含有有機(jī)物質(zhì)的油滴時(shí)，一般即可停止蒸餾。此時(shí)應(yīng)首先打開(kāi)T形管的夾子，然后移去火源，否則D中的液體會(huì)倒吸到A中。蒸餾期間，應(yīng)及時(shí)排出T形管中冷凝水。四、儀器藥品1、儀器設(shè)備水蒸餾發(fā)生器，長(zhǎng)頸圓底燒瓶，蒸餾裝置（減壓），直形冷凝管，接引管，長(zhǎng)玻璃管，T 形

10、管，橡皮管（附螺旋夾），三角燒瓶，分液漏斗、研缽等。2、試劑蒸餾樣品（八角茴香或橙皮），二氯甲烷，無(wú)水亞硫酸鈉。五、實(shí)驗(yàn)步驟1、設(shè)備安裝 參照實(shí)驗(yàn)原理部分。2、樣品準(zhǔn)備（1）10g干果（固體物質(zhì)）于研缽中粉碎，倒入蒸餾瓶，加入蒸餾水30mL。（2）2-3個(gè)橙子皮，剪碎，加入到蒸餾燒瓶，并加入水約30mL。3、水蒸汽蒸餾先把T形管上的夾子打開(kāi)，加熱水蒸汽發(fā)生器使水迅速沸騰，當(dāng)有水蒸汽從T形管的支管沖出時(shí)，再夾上止水夾，讓水蒸汽通入燒瓶中，與此同時(shí)，接通冷卻水，用100 mL 三角燒瓶收集餾分。蒸餾期間，應(yīng)及時(shí)排出T形管中冷凝水。當(dāng)餾分澄清透明不再有油狀物時(shí)，即可停止蒸餾，先打開(kāi)止水夾，然后停止加

11、熱，把餾分倒入分液漏斗中，靜置分層，將水層棄去。（以下為選做部分）4、收集餾出夜60-70mL，于分液漏斗中每次用10mL二氯甲烷萃取3次，合并。倒入錐形瓶中，加入適量無(wú)水亞硫酸鈉干燥30min以上，除去部分水分。5、干燥完畢的樣品，于50mL蒸餾燒瓶水浴加熱蒸餾（二氯甲烷沸點(diǎn)40.4），待快完畢后，改用水泵減壓蒸餾。除去殘留的二氯甲烷，留下橙黃色油狀液體（橙皮產(chǎn)物）。六、思考題1、與普通蒸餾相比，水蒸汽蒸餾有何特點(diǎn)？在什么情況下采用水蒸汽蒸餾的方法進(jìn)行分離提??？ 答：與普通蒸餾相比，水蒸汽蒸餾多了一個(gè)水蒸汽發(fā)生裝置，蒸餾部分不再保持垂直，而是傾斜3045°。其余部分一樣。使用水蒸汽

12、蒸餾提純的有機(jī)物應(yīng)具備下列條件：不溶或難溶于水；與水長(zhǎng)時(shí)間煮沸不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；在1000C左右時(shí)，待提純物應(yīng)具有一定的蒸汽壓。2、安全管為什么不能抵至水蒸汽發(fā)生器的底部？ 答：安全管是用來(lái)調(diào)節(jié)水蒸汽發(fā)生器內(nèi)部的壓力，內(nèi)部壓力過(guò)大，水就會(huì)從安全管的上口噴出。如果抵至發(fā)生器的底部，則安全管失去調(diào)節(jié)壓力的作用。3、蒸餾過(guò)程中若發(fā)現(xiàn)水從安全管頂端噴出或發(fā)生倒吸現(xiàn)象，應(yīng)如何處理？ 答：應(yīng)迅速打開(kāi)螺絲夾，讓體系與大氣相通。進(jìn)而再進(jìn)一步檢查導(dǎo)致壓力過(guò)大的原因，排除故障后，繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)二人參中人參皂苷的提取分離及鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步掌握三萜類(lèi)化合物的理化性質(zhì)及提取、分離和檢識(shí)方法。2、學(xué)習(xí)和掌

13、握簡(jiǎn)單回流提取法、兩相溶劑萃取法、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、大孔樹(shù)脂柱色譜等基本實(shí)驗(yàn)操作技能。二、基本原理人參為五加科植物人參(Panax ginseng C.A.Mey. )的干燥根，是傳統(tǒng)名貴中藥，始載于我國(guó)第一部本草專(zhuān)著神農(nóng)本草經(jīng)。其栽培者稱為“園參”，野生者稱為“山參”。人參具有大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺、生津、安神之功能，用于體虛欲脫、肢冷脈微、脾虛食少、肺虛喘咳、津傷口渴、內(nèi)熱消渴、久病虛羸、驚悸失眠、陽(yáng)痿宮冷、心力衰竭、心源性休克等的治療。人參的化學(xué)成分很復(fù)雜，有皂苷、揮發(fā)油、糖類(lèi)及維生素等。經(jīng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和藥理研究證明，人參皂苷為人參的主要有效成分，它具有人參的主要生理活性。人參的根、莖、葉、

14、花及果實(shí)中均含有多種人參皂苷(ginsenosides)。到目前為止，文獻(xiàn)報(bào)道從人參根及其它部位已分離確定化學(xué)結(jié)構(gòu)的人參皂苷有人參皂苷-Ro、-Ra1、-Ra2 、-Rb1、-Rb2、-Rb3、-Rc、-Rd、-Re、-Rf、-Rg1、-Rg2、-Rg3、-Rh1、-Rh2及-Rh3 等50余種人參皂苷。根據(jù)皂苷元的結(jié)構(gòu)可分為A、B、C三種類(lèi)型：人參二醇型-A型，人參三醇型-B型，齊墩果酸型-C型。A型和B型皂苷均屬四環(huán)三萜皂苷，其皂苷元為達(dá)馬烷型四環(huán)三萜，A型皂甙元稱為20(S)-原人參二醇20（S）-protopanaxadiol。B型皂甙元稱為20(S)-原人參三醇20（S）-proto

15、panaxatriol。C型皂苷則是齊墩果烷型五環(huán)三萜的衍生物，其皂苷元是齊墩果酸(oleanolic acid)。人參的主要成分為人參皂苷，總皂苷含量約4，人參皂苷大多數(shù)是白色無(wú)定形粉末或無(wú)色結(jié)晶，味微甘苦，具有吸濕性。人參皂苷易溶于水，甲醇、乙醇，可溶于正丁醇、乙酸、乙酸乙酯，不溶于乙醚、苯等親脂性有機(jī)溶劑。水溶液經(jīng)振搖后可產(chǎn)生大量的泡沫。人參總皂苷無(wú)溶血作用，分離后，B型和c型人參皂苷有顯著的溶血作用，而A型人參皂苷有抗溶血作用。 人參中除含有皂苷外，還含有脂溶性成分如揮發(fā)油，脂肪、甾體化合物及大量的糖類(lèi)等，這些類(lèi)成分對(duì)人參皂苷的分離和精制有干擾，所以必須除去，方可得到純度較高的皂苷。本

16、實(shí)驗(yàn)以人參根為原料提取分離人參總皂苷，利用人參總皂苷易溶于甲醇，不溶于乙醚性質(zhì)采用溶劑法進(jìn)行初步提取去雜；然后根據(jù)皂苷在含水丁醇中有較好的溶解度的性質(zhì)采用萃取法進(jìn)行分離；再用沉淀法或大孔吸附樹(shù)脂法進(jìn)行進(jìn)一步分離精制；對(duì)提出的總皂苷采用檢測(cè)三萜類(lèi)化合物通性的理化檢識(shí)方法泡沫試驗(yàn)及顯色反應(yīng)進(jìn)行初步定性檢識(shí)；最后根據(jù)人參總皂苷中各單體皂苷分子結(jié)構(gòu)中糖基個(gè)數(shù)和羥基數(shù)不同而極性大小不同的性質(zhì)，通過(guò)薄層色譜法對(duì)人參總皂苷進(jìn)一步分離和專(zhuān)屬定性檢識(shí)。三、儀器藥品1、儀器索氏提取器，加熱裝置，減壓蒸餾裝置，分液漏斗，60目篩，濾紙，燒杯，試管，D101型大孔樹(shù)脂柱（包括泵及軟管），水浴鍋，硅膠-CMC薄層板，超

17、聲波儀，展層缸，紫外燈。2、試劑 人參根，甲醇，乙醚，丙酮，三氯化銻氯仿飽和溶液（1精餾氯仿：用蒸餾水洗滌市售氯仿23次，加一些煅燒過(guò)的碳酸鈉或無(wú)水硫酸鈉進(jìn)行干燥，并在暗色燒瓶中蒸餾。2三氯化銻氯仿飽和溶液：用少量精餾氯仿反復(fù)洗滌三氯化銻，直到氯仿不再顯色為止。再將三氯化銻放在干燥器中，用硫酸干燥。用干燥的三氯化銻和精餾氯仿配制飽和溶液），正丁醇，濃硫酸，冰醋酸，醋酸酐，20五氯化銻的氯仿溶液(或不含乙醇和水的三氯化銻飽和的氯仿溶液)，乙酸乙酯，乙醇，人參皂苷Rb1、Re、Rg1對(duì)照品。四、 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、人參總皂苷的提取分離任選一種方案方案(1)人參根粗粉（60目10g）用濾紙筒包好，置索氏提

18、取器中， 加甲醇加熱回流提取至三氯化銻氯仿飽和溶液反應(yīng)呈陰性， 提取液減壓回收甲醇浸膏 用10倍量蒸餾水溶解 水溶液用乙醚在分液漏斗中，振搖脫脂4次 乙醚液（脂類(lèi)） 水層用水飽和的正丁醇萃取6次，合并正丁醇液減壓回收正丁醇，蒸干 殘留物（總皂苷粗品）方案(2)人參根粗粉（60目10g）用濾紙筒包好，置索氏提取器中， 加10倍量乙醚回流脫脂至無(wú)色， 乙醚液（脂類(lèi)） 殘?jiān)蛹状技訜峄亓魈崛≈寥然R氯仿飽和溶液反應(yīng)呈陰性甲醇提取液 減壓回收甲醇浸膏 用10倍量蒸餾水溶解 水溶液用水飽和的正丁醇萃取6次，合并正丁醇液減壓回收正丁醇，蒸干 殘留物（總皂苷粗品）2、人參總皂苷的分離精制將人參總皂苷粗品分

19、為兩份方法（1）沉淀法1份總皂苷粗品甲醇溶解，傾入約10倍量丙酮，不斷攪拌，析出 黃白色沉淀 母液過(guò)濾 回收溶劑，用少量甲醇溶解，再傾入約10倍量丙酮總皂苷 黃白色沉淀 過(guò)濾總皂苷 合并，減壓60下真空干燥，稱重計(jì)算收率 精制總皂苷方法（2）大孔樹(shù)脂柱色譜法大孔樹(shù)脂色譜是近年來(lái)用于分離和富集天然化合物的一種常用方法，應(yīng)用大孔樹(shù)脂分離皂苷，主要用于皂苷的富集和初步分離。將含有皂苷的水溶液通過(guò)大孔樹(shù)脂柱吸附后，先用水洗脫除去糖和其他水溶性雜質(zhì)，然后改用不同濃度的甲醇或乙醇進(jìn)行梯度洗脫。極性大的皂苷可被低濃度的甲醇或乙醇洗脫下來(lái)，極性小的皂苷則被高濃度的甲醇或乙醇洗脫下來(lái)。1份總皂苷粗品 用少量水溶

20、解，加樣于處理好的D101型大孔樹(shù)脂柱上，吸附1小時(shí)后，用3倍柱體積蒸餾水洗脫除雜質(zhì) 繼用60%乙醇洗脫至三氯化銻氯仿飽和溶液反應(yīng)呈陰性 洗脫液 減壓回收溶劑 殘留物 減壓60下真空干燥，稱重計(jì)算收率精制總皂苷3、人參皂苷的鑒定（一）理化檢識(shí)1、泡沫試驗(yàn)取人參根粗粉1g，加水浸泡（1：10）1小時(shí)或置80水浴上溫浸30分鐘，過(guò)濾得濾液供以下試驗(yàn)。取供試液2ml于試管中，緊塞試管口后猛力振搖，試管內(nèi)液體則產(chǎn)生大量的持久性的似蜂窩狀泡沫（示有皂苷）。注：含蛋白質(zhì)和粘液質(zhì)的水溶液雖也能產(chǎn)生泡沫，但不持久，放置很快消失。2、顯色反應(yīng)（1）醋酐濃硫酸反應(yīng)（Liebermann-Burchard反應(yīng)）取樣

21、品適量，加冰醋酸0.5mL使溶解，續(xù)加醋酐0.5mL攪勻，再于溶液的邊沿滴加1滴濃硫酸，觀察并記錄現(xiàn)象。（2）三氯甲烷濃硫酸反應(yīng)（Salkowski反應(yīng)）取樣品適量，加三氯甲烷1mL使溶解，沿試管壁加等量的濃硫酸，分別置可見(jiàn)光及紫外燈下，觀察并記錄現(xiàn)象。（3）五氯化銻反應(yīng)（Kahlenberg reaction） 取樣品適量，加五氯化銻的氯仿溶液反應(yīng)呈紫色。或?qū)悠返穆确禄虼既芤狐c(diǎn)于濾紙上，噴20五氯化銻的氯仿溶液(或不含乙醇和水的三氯化銻飽和的氯仿溶液)，干燥后6070加熱，顯色，觀察并記錄現(xiàn)象。(二)色譜檢識(shí)1、薄層色譜吸附劑：硅膠-CMC薄層板樣品溶液：稱取由沉淀法及大孔吸附樹(shù)脂法制得的

22、精制總皂苷各一份，加甲醇制成1mL含2mg的樣品溶液。對(duì)照品溶液：稱取人參皂苷Rb1、Re、Rg1對(duì)照品，加甲醇制成1mL含2mg的對(duì)照品混合溶液。對(duì)照藥材溶液：取人參對(duì)照藥材粉末1 g，加氯仿40mL，置水浴上回流1小時(shí)，棄去氯仿液，藥渣揮干殘存溶劑，加水0.5mL拌勻濕潤(rùn)后，加水飽和的正丁醇10mL，超聲處理30分鐘，吸取上清液，加氨試液三倍量，搖勻，放置分層，取上層液蒸干加甲醇溶解，使成1mL，作為對(duì)照藥材溶液。展開(kāi)劑：A. 氯仿-甲醇-水(65：35：10)10以下放置后的下層溶液;B. 氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(15：40：22：10) 10以下放置后的下層溶液;顯色劑：10%硫酸乙

23、醇溶液 顯色方式：10%硫酸乙醇溶液噴霧后，105加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。分別置日光及紫外燈(365nm)下檢視.五、實(shí)驗(yàn)說(shuō)明及注意事項(xiàng)1、萃取操作時(shí)，注意振搖不能過(guò)度劇烈，以防產(chǎn)生乳化現(xiàn)象。2、在使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器進(jìn)行甲醇提取液減壓濃縮時(shí)，因含皂苷易產(chǎn)生大量泡沫發(fā)生倒吸現(xiàn)象。故應(yīng)注意觀察隨時(shí)調(diào)整水浴溫度及旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器轉(zhuǎn)速，避免事故的發(fā)生。3、在連續(xù)回流提取過(guò)程中，水浴溫度不宜過(guò)高，應(yīng)與溶劑沸點(diǎn)相適應(yīng)。此外可加快冷凝水的流速，以增加冷凝效果。4、回收乙醚的蒸餾操作，不必另?yè)Q蒸餾裝置。只將索氏提取器中的濾紙筒取出，再照原樣裝好，繼續(xù)加熱回收燒瓶中的溶劑，待溶劑液面增加至高虹吸管頂部彎曲處1cm處，暫?；厥?/p>

24、，取下提取器，將其中乙醚移置另外容器中，如此反復(fù)操作，即可完成回收乙醚的操作。5、在連續(xù)提取過(guò)程中，欲檢查有效成分是否提取完全，可取提取器中提取液數(shù)滴，滴于白瓷皿中，揮散溶劑，觀察有無(wú)殘留物，或滴于濾紙片上，然后進(jìn)行醋酐濃硫酸反應(yīng)或三氯化銻氯仿飽和溶液反應(yīng)。若反應(yīng)呈陰性，示已提盡。6、大孔樹(shù)脂在使用前應(yīng)按說(shuō)明書(shū)處理好，加乙醇浸泡24 h后，再用乙醇洗脫至流出液與3倍水混合后不呈混濁，繼續(xù)用蒸餾水洗至無(wú)醇為止備用。六、思考題1、三萜皂苷可用哪些反應(yīng)進(jìn)行鑒定？如何與甾體皂苷區(qū)別？2、試設(shè)計(jì)一種從人參莖葉為原料提取分離人參總皂苷的工藝流程，并說(shuō)明提取、分離原理。3、使用乙醚作提取溶劑時(shí)，操作中應(yīng)注意

25、哪些事項(xiàng)？實(shí)驗(yàn)三、-胡蘿卜素和番茄紅素的提取分離與測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握從胡蘿卜或番茄中提取分離-胡蘿卜素和番茄紅素的原理與方法。2、鞏固用柱色譜和薄層色譜分離、檢測(cè)有機(jī)化合物的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。3、學(xué)會(huì)用分光光度法測(cè)定-胡蘿卜素和番茄紅素的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理-胡蘿卜素和番茄紅素分子中的碳骨架是由8個(gè)異戊二烯單位連接而成的，它們是四萜類(lèi)化合物。它們的分子中都有一個(gè)較長(zhǎng)的-共軛體系，能吸收不同波長(zhǎng)的可見(jiàn)光，因而，它們都呈現(xiàn)一定的顏色，-胡蘿卜素是黃色物質(zhì)，番茄紅素是紅色物質(zhì)，所以，又把它們叫做多烯色素。胡蘿卜素是最早發(fā)現(xiàn)的一個(gè)多烯色素。后來(lái)，又發(fā)現(xiàn)了許多在結(jié)構(gòu)上與胡蘿卜素類(lèi)似的色素，于是就把這類(lèi)物質(zhì)叫

26、做胡蘿卜色素類(lèi)化合物，或者叫做類(lèi)胡蘿卜素。這類(lèi)化合物大都難溶于水，易溶于弱極性或非極性的有機(jī)溶劑，因此又把這類(lèi)物質(zhì)叫做脂溶性色素。胡蘿卜素廣泛存在于植物的葉、花、果實(shí)中，尤以胡蘿卜中含量最高。胡蘿卜素有、三種異構(gòu)體，在生物體中以-異構(gòu)體含量最多，生理活性最強(qiáng)。在動(dòng)物體內(nèi)，胡蘿卜素在酶的作用下可轉(zhuǎn)化為維生素A，因此，胡蘿卜素又被叫做維生素A原。胡蘿卜素在人和高等動(dòng)物體內(nèi)具有重要的生理功能，是人和高等動(dòng)物生存不可缺少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。番茄紅素是胡蘿卜素的開(kāi)鏈異物體。番茄紅素在成熟的紅色植物果實(shí)如番茄、西瓜、胡蘿卜、草莓、柑桔等中含量最高，其中含量最多的是番茄。由于番茄紅素不具有維生素A原活性，因此長(zhǎng)期以

27、來(lái)不被人們所重視。但近年來(lái)研究表明，番茄紅素是一種優(yōu)越的天然色素和生物抗氧化劑，它可以預(yù)防前列腺癌、乳腺癌和消化道（結(jié)腸、直腸與胃）癌的發(fā)生，在預(yù)防心血管疾病、動(dòng)脈硬化等各種與衰老有關(guān)的疾病及增強(qiáng)機(jī)體免疫力方面具有重要作用。正因?yàn)槿绱?，近年?lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)番茄紅素的研究方興未艾，不僅有大量的研究文章公開(kāi)發(fā)表，而且還有一些相關(guān)產(chǎn)品面市。番茄紅素作為新型保健食品、食品添加劑、化妝品和藥品具有廣闊的市場(chǎng)前景。-胡蘿卜素和番茄紅素的分子式均為C40H56，分子量為536.85，-胡蘿卜素的熔點(diǎn)184，番茄紅素的熔點(diǎn)174。-胡蘿卜素和番茄紅素是不飽和碳?xì)浠衔?，難溶于甲醇、乙醇，可溶于乙醚、石油醚、正已烷、

28、丙酮，易溶于氯仿、二硫化碳、苯等有機(jī)溶劑。根據(jù)-胡蘿卜素和番茄紅素的上述性質(zhì)，故可利用石油醚、乙酸乙酯等弱極性溶劑將它們從植物材料中浸提出來(lái)。然后，根據(jù)它們對(duì)吸附劑吸附能力的差異，用柱色譜進(jìn)行分離，用薄層色譜檢測(cè)分離效果。并根據(jù)它們?cè)诳梢?jiàn)光區(qū)有強(qiáng)烈吸收的性質(zhì)，用紫外可見(jiàn)分光光度法進(jìn)行測(cè)定，-胡蘿卜素的最大吸收峰為451nm，番茄紅素的最大吸收峰為472nm。三、儀器與試劑1、儀器 三角瓶（50ml）、分液漏斗（150ml）、蒸餾瓶（50ml）、普通蒸餾裝置（或減壓蒸餾裝置）、色譜柱、硅膠薄層板、量筒、燒杯、試管、分光光度計(jì)、層析缸。2、試劑番茄（或番茄醬）或胡蘿卜、食鹽、丙酮、乙酸乙

29、酯、石油醚（6090）、乙醇、無(wú)水硫酸鎂、氧化鋁（層析用，100200目）、硅膠（層析用，200300目）、無(wú)水硫酸鈉、石油醚（6090）：乙醇（2：1）（V/V）、石油醚：丙酮（3：2）（V/V）。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與步驟1、類(lèi)胡蘿卜素的提取方法一：（1）稱取20g新鮮番茄果肉，搗碎，置于50mL三角瓶中，再加入5g食鹽，用玻棒攪拌，使食鹽與番茄果肉充分混合均勻，設(shè)置一定時(shí)間，便會(huì)看到果肉組織中水分大量滲出。脫水時(shí)間持續(xù)1530min。隨后將脫除下來(lái)的水分濾入150mL分液漏斗中。（2）向經(jīng)過(guò)食鹽脫水的番茄果肉加入10mL丙酮，用玻棒攪拌，并靜置510min。然后將丙酮提取液也濾入分液漏斗中。（3

30、）向經(jīng)過(guò)丙酮處理的番茄果肉加入10mL乙酸乙酯浸提5min。浸提過(guò)程中應(yīng)不時(shí)振搖三角瓶，使番茄果肉與溶劑充分接觸；若室溫過(guò)低，可將三角瓶置于溫水浴中溫?zé)幔珣?yīng)注意不能使浸提溶劑明顯揮發(fā)損失。5min后將提取液也濾入分液漏斗中，并用玻棒輕壓殘?jiān)M量使溶劑流盡。再用乙酸乙酯重復(fù)提取2次，每次10mL，合并提取液至分液漏斗中。（4）充分振搖分液漏斗中的混合溶液，靜置，完全分層后，分去水層，有機(jī)層（酯層）再用蒸餾水洗2次，每次810mL，棄去水層。酯層自分液漏斗上口倒入干燥的小三角瓶中，加入適量無(wú)水硫酸鎂（或無(wú)水硫酸鈉）干燥15min（注意：應(yīng)避光）。（5）干燥后的酯層濾入50mL干燥的蒸餾瓶中，水浴

31、加熱，小心蒸餾（最好減壓蒸餾）濃縮至12mL。所得濃縮液即為類(lèi)胡蘿卜素樣品。方法二：稱取20g新鮮番茄果肉，搗碎，置于50mL三角瓶中，用15mL石油醚（6090）與乙醇的混合溶劑（2：1，V/V）浸提5min。然后將提取液濾入150mL分液漏斗中。再用石油醚乙醇混合溶劑重復(fù)提取2次，每次15mL。合并提取液至分液漏斗中。以下步驟同方法一（4）、（5）。2、類(lèi)胡蘿卜素的柱色譜分離方法一：選一支1.5×20cm色譜柱，用適量層析用氧化鋁（100200目）作吸附劑干法裝柱，高度約1020cm，要求緊密勻?qū)?。分離方式為梯度洗脫，第一步用石油醚（6090）洗脫。先沿色譜柱管壁滴加58mL石油

32、醚至柱體（各方向要均勻），待溶劑液面降至氧化鋁柱面頂端時(shí)，用滴管迅速地小心滴加510滴樣品至柱子中，待樣品液面即將在柱面上消失時(shí)，沿管壁小心滴加石油醚3-5滴，沖洗粘在管壁上的有色物質(zhì)。如此重復(fù)操作3-4次，直至管壁沖冼干凈為止。隨后，在管內(nèi)加入盡可能多的石油醚進(jìn)行洗脫，第一步收集到的洗脫液為黃色。待洗脫液清亮無(wú)色后用石油醚：丙酮=3：2（V/V）的混合液洗脫，第二步收集到的洗脫液為紅色。最后用丙酮將前兩步不能洗脫的剩余組分洗脫下來(lái)。分別收集三步洗脫液，用作薄層色譜檢測(cè)及分光光度法測(cè)定。方法二：操作步驟與方法一基本相同，只是分離方式不一樣。本方法用石油醚作流動(dòng)相進(jìn)行一步洗脫，分別接收不同顏色的

33、洗脫液，作后續(xù)步驟實(shí)驗(yàn)用。并將本方法的分離效果與方法一進(jìn)行比較。3、類(lèi)胡蘿卜素的薄層色譜檢測(cè)對(duì)前面得到的類(lèi)胡蘿卜素樣品以及柱色譜分離得到的樣品分別進(jìn)行薄層分析，以檢查柱色譜分離效果。薄層層析板預(yù)先用硅膠G制備并活化（110，1小時(shí)），展開(kāi)劑為石油醚（60-90）：丙酮=3：2（V/V）。薄層分離后觀察斑點(diǎn)位置，計(jì)算各斑點(diǎn)的Rf值，并明確各斑點(diǎn)歸屬。在本實(shí)驗(yàn)條件下，薄層檢測(cè)結(jié)果為：-胡蘿卜素，黃色，Rf值為0.89；番茄紅素，深紅色，Rf值為0.84。4、類(lèi)胡蘿卜素的分光光度法測(cè)定取柱色譜分離后得到的樣品，用石油醚適當(dāng)稀釋至儀器測(cè)量范圍，然后用721型分光光度計(jì)分別在420520nm范圍測(cè)定它們

34、的光密度E，并做出E-曲線（每隔10nm測(cè)定一次光密度）。指出各自最大吸收峰max，并與標(biāo)準(zhǔn)吸收對(duì)照鑒定。注釋?zhuān)盒迈r番茄果肉組織中含有大量水分，類(lèi)胡蘿卜素處在含水量很高的細(xì)胞環(huán)境中，有機(jī)溶劑不易滲透進(jìn)去，因此，為了提高提取效率，減少提取溶劑用量，應(yīng)首先用食鹽對(duì)番茄果肉進(jìn)行脫水處理。經(jīng)食鹽一次脫水處理后，番茄果肉里仍然含有一定量水分，致使所用提取溶劑還是無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)很好地將類(lèi)胡蘿卜素溶出，故選用弱極性溶劑丙酮對(duì)之進(jìn)一步脫水，同時(shí)也會(huì)溶出部分類(lèi)胡蘿卜素。為了最大限度地減少類(lèi)胡蘿卜素的損失，故應(yīng)將前步脫除下來(lái)的水分及這一步的丙酮浸提液都濾入分液漏斗中合并處理。經(jīng)丙酮處理后的番茄果肉便可直接加有機(jī)溶

35、劑浸提。如果用番茄醬或胡蘿卜做原料提取類(lèi)胡蘿卜素，食鹽脫水及丙酮進(jìn)一步脫水處理這些步驟便可省去。濃縮提取液時(shí)應(yīng)當(dāng)用水浴加熱蒸餾瓶，最好用減壓蒸餾，而且不可蒸得太快、太干，以免類(lèi)胡蘿卜素受熱分解破壞。如用乙酸乙酯提取胡蘿卜素，提取液濃縮至12ml后，應(yīng)停止蒸餾，拆卸儀器，將蒸餾瓶敞口，讓剩余的乙酸乙酯揮發(fā)至干，然后再加適量石油醚溶解，所得溶液即為類(lèi)胡蘿卜素樣品，用于下一步實(shí)驗(yàn)。切不可將經(jīng)過(guò)濃縮的乙酸乙酯提取液直接用于柱色譜分離。在提取及柱色譜分離兩步中，本實(shí)驗(yàn)分別提供了兩種方法。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，可將全班學(xué)生分為兩批，分別按不同方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，再讓學(xué)生通過(guò)比較得出應(yīng)有的結(jié)論。五、思考題1、根

36、據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，試提出一個(gè)從植物材料中提取、分離、鑒定植物色素的一般流程。2、柱色譜分離類(lèi)胡蘿卜素實(shí)驗(yàn)中，黃色物質(zhì)、紅色物質(zhì)各是什么色素？試就實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象作出解釋。3、在類(lèi)胡蘿卜素的薄層色譜檢測(cè)中，你究竟觀察到了幾個(gè)斑點(diǎn)？它們的Rf值各是多少？如實(shí)記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，并對(duì)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象做出解釋。此外介紹紙層析法和柱色譜法一、紙層析法1.原理以丙酮和石油醚提取食物中的胡蘿卜素及其他植物色素，以石油醚為展開(kāi)劑進(jìn)行紙層析，胡蘿卜素極性最小，移動(dòng)速度最快，從而與其他色素分離，剪下含胡蘿卜素的區(qū)帶，洗脫后于450nm波長(zhǎng)下定量測(cè)定。2.適用范圍參照GB12389-90。本方法適用于植物性食物和含有植物性食物的混合食物中胡

37、蘿卜素的測(cè)定，其最小檢出限為0.11g。3.儀器和設(shè)備（1） 實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備。（2） 玻璃層析缸。（3） 分光光度計(jì)。（4） 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：具150mL球形瓶。（5） 恒溫水浴鍋。（6） 皂化回餾裝置。（7） 點(diǎn)樣器或微量注射器。（8） 濾紙。4.試劑除特殊說(shuō)明外，實(shí)驗(yàn)用試劑為分析純，水為蒸餾水。4.1 石油醚（沸程3060）：同時(shí)是展開(kāi)劑。4.2 無(wú)水硫酸鈉：分析純。4.3 5%硫酸鈉溶液。4.4 1+1氫氧化鉀溶液：取50g氫氧化鉀溶于50ml水。4.5 無(wú)水乙醇：需脫醛處理。（1） 檢驗(yàn)乙醇是否含醛：銀氨液：加濃氨水于5%硝酸銀液中，直至氧化銀沉淀溶解，加入2.5mol/L氫氧化鈉溶液數(shù)滴

38、，如發(fā)生沉淀，再加濃氨水使之溶解。銀鏡反應(yīng)：加2ml銀氨液于試管內(nèi)，加入幾滴乙醇搖勻，加入少許2.5mol/L氫氧化鈉溶液加熱。如乙醇中無(wú)醛，則沒(méi)有銀沉淀，否則有銀鏡反應(yīng)。（2）脫醛方法：取2g硝酸銀溶于少量水中，取4g氫氧化鈉溶于溫乙醇中，將兩者傾入1L乙醇中，搖勻，靜置一、兩天，將上層清液傾入蒸餾瓶中，蒸餾，棄去初蒸的50ml。（注：蒸餾速度控制在1滴/秒。）4.6 -胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)貯備液：取5mg-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品，溶于10ml三氯甲烷中，濃度約為500g/ml，準(zhǔn)確測(cè)其濃度。（1） 標(biāo)定： 取標(biāo)準(zhǔn)溶液10.0l， 加正己烷3.00ml，混勻。測(cè)其吸光度值，比色杯厚度為1cm，以正己烷為空白

39、，入射光波長(zhǎng)450nm，平行測(cè)定三份，取均值。（2） 計(jì)算公式： X1=A×1×3.01（1）E10000.01式中： X1-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mg/ml；A -吸光值；E-胡蘿卜素在正己烷溶液中，入射光波長(zhǎng)450nm，比色杯厚度1cm，溶液濃度為1ppm的吸光系數(shù)，為0.2638；1將ppm換算成mg/ml；10003.01測(cè)定過(guò)程中稀釋倍數(shù)的換算。0.01（注：配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，應(yīng)注意標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)構(gòu)是胡蘿卜素還是胡蘿卜素酯。通常標(biāo)準(zhǔn)品不能完全溶解于有機(jī)溶劑中，尤其是胡蘿卜素酯，所以必要時(shí)應(yīng)先將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行皂化，再用有機(jī)溶劑提取，用蒸餾水洗滌至中性后，濃縮定容。再進(jìn)行標(biāo)定。

40、由于胡蘿卜素很容易分解破壞，所以每次使用前標(biāo)準(zhǔn)品均需標(biāo)定，且測(cè)定樣品時(shí)需帶標(biāo)準(zhǔn)品同步操作。）4.7 -胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)工作液：將已標(biāo)定的標(biāo)準(zhǔn)液用石油醚準(zhǔn)確稀釋?zhuān)姑亢辽芤合喈?dāng)50g，避光保存于冰箱中。5.操作步驟5.1樣品的采集和處理（1） 糧食：樣品用水洗三次，置60烤箱中拷干，磨粉，儲(chǔ)于塑料瓶中，放一小包樟腦精，蓋緊瓶塞保存，備用。（2） 蔬菜與其他植物性食物：取可食部用水沖洗三次后，用紗布吸去水滴，切碎，用勻漿器制成勻漿，貯于塑料瓶中，冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?.2測(cè)定步驟（以下步驟需在避光條件下進(jìn)行）（1）樣品提?。喝∵m量樣品，相當(dāng)于原樣15g（含胡蘿卜素約2080g）勻漿，糧食樣品視其胡蘿卜素

41、含量而定，置100ml帶塞錐形瓶中，加入丙酮20ml，石油醚5ml，振搖1min，靜置5min，將提取液轉(zhuǎn)入盛有100ml5%硫酸鈉溶液的分液漏斗中，再于錐形瓶中加入10ml丙酮-石油醚混合液，振搖1min，靜置5min，將提取液并入分液漏斗中。如此提取23次，直至提取液無(wú)色為止。 植物油和高脂肪樣品：需先皂化，取適量樣品（<10g），加脫醛乙醇30ml，再加10ml1:1氫氧化鉀溶液，回流加熱30min，然后用冰水使之迅速冷卻，皂化后樣品用石油醚提取，直至提取液無(wú)色為止。（注：原國(guó)標(biāo)方法中，不是所有的樣品均進(jìn)行皂化處理。但是許多植物性樣品由于細(xì)胞壁較厚，在勻漿或研磨過(guò)程中不易完全破壞，

42、使胡蘿卜素?zé)o法完全釋放。并且盡管植物性樣品中脂肪含量較少，但仍含有一定脂質(zhì)成分，如果不進(jìn)行皂化，會(huì)出現(xiàn)提取不完全和提取時(shí)出現(xiàn)乳化現(xiàn)象；濃縮時(shí)殘留脂質(zhì)，使定容體積不準(zhǔn)確；紙層析展開(kāi)不完全，造成測(cè)定結(jié)果偏移。所以建議除酒類(lèi)、飲料外所有樣品均進(jìn)行皂化處理。）（2）洗滌：將提取液靜置分層，棄去下層水溶液，反復(fù)用5%硫酸鈉溶液振搖洗滌，每次約15ml，直至下層水溶液清亮為止。將皂化后樣品提取液用水洗滌至中性。將提取液通過(guò)盛有10g無(wú)水硫酸鈉的小漏斗，漏入球形瓶，用少量石油醚分?jǐn)?shù)次洗凈分液漏斗和無(wú)水硫酸鈉層內(nèi)的色素，洗滌液并入球形瓶?jī)?nèi)。（注：經(jīng)過(guò)無(wú)水硫酸鈉輔助過(guò)濾，提取液中應(yīng)不含水分。）（3）濃縮與定容：

43、將上述球形瓶?jī)?nèi)的提取液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)，水浴溫度為60，蒸發(fā)至約1ml時(shí)，取下球形瓶，用氮?dú)獯蹈?，立即加?.00ml石油醚定容，備層析用。（4）紙層析（濾紙先在飽和水蒸氣的空氣中吸收水分后(一般吸收約70)，其一部分生成水合纖維素配位化合物，固定在濾紙上作固定相）點(diǎn)樣：在18cm×30cm濾紙下端距底邊4cm處做一基線，在基線上取A、B、C、D四點(diǎn)，吸取0.1000.400ml濃縮液（6.3）在AB和CD間迅速點(diǎn)樣。（注意：保持濾紙干燥，點(diǎn)樣應(yīng)該快速細(xì)致，在基線上形成細(xì)窄直線）展開(kāi)：待紙上所點(diǎn)樣液自然揮發(fā)干后，將濾紙卷成圓筒狀，置于預(yù)先用石油醚飽和的層析缸中，進(jìn)行上行展開(kāi)。（

44、注：層析缸應(yīng)事先用石油醚飽和，并且防止水分進(jìn)入。）洗脫：待胡蘿卜素與其他色素完全分開(kāi)后，取出濾紙，自然揮發(fā)干石油醚，將位于展開(kāi)劑前沿的胡蘿卜素層析帶剪下，立即放入盛有5ml石油醚的具塞試管中，用力振搖，使胡蘿卜素完全溶入試劑中。（5）比色測(cè)定：用1cm比色杯，以石油醚調(diào)零點(diǎn)，于450nm波長(zhǎng)下，測(cè)吸光度值，以其值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出胡蘿卜素的含量，供計(jì)算時(shí)使用。（6）標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制：取胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)使用液（濃度為50g/ml）1.00、2.00、3.00、4.00、6.00、8.00ml，分別置于100ml具塞錐形瓶中，按樣品測(cè)定步驟進(jìn)行提取、洗滌、紙層析等操作，點(diǎn)樣體積為0.100ml，標(biāo)準(zhǔn)曲線

45、各點(diǎn)胡蘿卜素含量依次為2.50、5.00、7.50、10.00、15.00、20.00g。為測(cè)定低含量樣品，可在0至2.50g間加做幾點(diǎn)，以胡蘿卜素含量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。6.計(jì)算X2=c×V2×100×1（2）V1m1000式中： X2-樣品中胡蘿卜素的含量，以胡蘿卜素計(jì)，mg.100g；c -在標(biāo)準(zhǔn)曲線上所查得的胡蘿卜素含量，g；V1-點(diǎn)樣體積，ml；V2-樣品石油醚提取液濃縮后的定容體積，ml；m -樣品質(zhì)量，g。7.注意事項(xiàng)同一實(shí)驗(yàn)室平行測(cè)定或重復(fù)測(cè)定結(jié)果的相對(duì)偏差絕對(duì)值10%。二、柱色譜法1. 原理和適用范圍同紙層析法，只是將紙層析換

46、成中性氧化鋁柱層析。2.試劑（1） 中性氧化鋁：80100目。用前180烘干4小時(shí)至恒重。（2） 其余試劑同紙層析法。3.儀器及設(shè)備（1）色譜柱：為1.0cm×25cm的玻璃柱，底端收縮變細(xì)，并有一活塞，用于調(diào)控液體流速；距底端上1cm處有一篩板，孔徑為1630m。用前需干燥。（2） 其余設(shè)備同紙層析法。4.操作步驟4.1樣品采集和處理同紙層析法。4.2測(cè)定步驟（1） 樣品提取、洗滌等步驟同紙層析法。（2） 將洗滌后提取液濃縮并定容至10ml。（3）柱色譜：將已干燥的中性氧化鋁浸泡于石油醚中，以濕法填充色譜柱至高度為15cm，其上端加2cm無(wú)水Na2SO4，使石油醚自由流下，保證其水

47、平高于Na2SO4平面0.5cm。（注意色譜柱填充時(shí)應(yīng)避免水分，不要有氣泡進(jìn)入。）將樣品提取液加入色譜柱上，自由流下，待提取液流至柱面時(shí)，分次加入石油醚2ml，洗滌柱壁，再加入石油醚洗脫，收集流出液至黃色帶全部流出。流出液經(jīng)60水浴減壓蒸餾后，N2吹干，定容。（4） 比色法測(cè)定同紙層析法。5.注意事項(xiàng)（1）柱色譜法的優(yōu)點(diǎn)是在測(cè)定胡蘿卜素的同時(shí)可測(cè)定其他類(lèi)胡蘿卜素和色素。類(lèi)胡蘿卜素、色素和胡蘿卜素的極性不同，胡蘿卜素極性最小先被極性小的石油醚洗脫，增加洗脫液極性（如加入乙醚、丙酮）可先后將極性稍大的類(lèi)胡蘿卜素（如葉黃素、葉紅素）、葉綠色洗脫。（2）紙層析法和柱色譜法均不能區(qū)分-、-和-胡蘿卜素，

48、雖然標(biāo)準(zhǔn)品為-胡蘿卜素，但實(shí)際結(jié)果為總胡蘿卜素。不過(guò)天然食品中大部分為-胡蘿卜素，對(duì)結(jié)果影響不大。兩種方法測(cè)定結(jié)果相當(dāng)。（3）HPLC的原理、適用范圍、樣品前處理及操作同紙層析法，濃縮定容后的樣品液不經(jīng)過(guò)紙層析，而進(jìn)入HPLC的C18柱，經(jīng)流動(dòng)相洗脫后，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。HPLC可分離-、-胡蘿卜素并可同時(shí)測(cè)定多種脂溶性維生素，是目前國(guó)內(nèi)外常用的測(cè)定方法。中草藥化學(xué)成分檢出試劑配制法 "=yaeEp ?1OS%RBF *<Qn)Az X*%KR4 $FO(wf ?LvZEiJ 一、生物堿沉淀試劑： bh uA, nW7L 1碘化鉍鉀（Dragendorff）試劑：取次硝酸鉍

49、3g溶于30%硝酸（比重1.18）17ml中，在攪拌下慢慢加碘化鉀濃水溶液（27克碘化鉀溶于20ml水），靜置一夜，取上層清液，加蒸餾水稀釋至100ml。 YnE/bmx&9 e-k;V7b 附：改良的碘化鉍鉀試劑： w(.k6:e v0= Hy m 甲液：0.85g次硝酸鉍溶于10ml冰醋酸，加水40ml。 oh#6>| hL 1qS 乙液：8g碘化鉀溶于20ml水中。 vPSH GG%j+Ed 溶液甲和乙等量混合，于棕色瓶中可以保存較長(zhǎng)時(shí)間，可作沉淀試劑用，如作層析顯色劑用，則取上述混合液1ml與醋酸2ml，混合即得。 -4;QB? UiaY0 .D 目前市場(chǎng)上碘化鉍鉀試劑可

50、直接供配制：7.3g碘化鉍鉀，冰醋酸10ml，加蒸餾水60ml。 BNu zlR :6N:4 2碘化汞鉀（Mayer）試劑：氯化汞1.36g和碘化鉀5g各溶于20ml水中，混合后加水稀釋至100ml。 Bb8lklQ mi%d()%< 3碘一碘化鉀（Wagner）：試劑：1g碘化鉀液于50ml，加熱，加2ml醋酸，再用水稀釋至100ml。 Hc5 gN YDCs d5 4硅鎢酸試劑：5g硅鎢酸溶于100ml水中，加鹽酸少量至pH2左右。 Wi hQj rsOon2| 5苦味酸試劑：1g苦味酸溶于100ml水中。 y3czDjV T_y 'cvh 6鞣酸試劑：鞣酸1g加乙醇1 ml

51、溶解后再加水至10ml。 fPZBm&C 'O YL(j_e 7堿酸鈰硫酸試劑：0.1g硫酸鈰混懸于4ml水中，加入1g三氯醋酸，加熱至沸，逐滴加入濃硫酸至澄清。 Ga+b>C #xm<|s 二、苷類(lèi)檢出試劑： EYcvD!1g zf5sw.4 （一）糖的檢出試劑： $xUKppn J37 35 1堿性酒石酸銅（Fehiling）試劑：本口分甲液與乙液，應(yīng)用時(shí)取等量混合。 !o-y= C!Y|k.p 甲液：結(jié)晶硫酸酮6.23g，加水至100ml。 )j',e $m Rs|W; 乙液：酒石酸鉀鈉34.6g，及氫氧化鈉10g，加水至100ml。 ,B5Ptf#

52、&oWWc$ 2-萘酚（Molisch）試劑。 $P866F rPaD#GA7 甲液：-萘酚1g，加75%乙醇至10ml。 YRG+I GX eG"iJ%I 乙液：濃硫酸 d;m Q=k 1 pvI(hjMYPk 3氨性硝酸銀試劑：硝酸銀1g，加水20ml溶解，注意滴加適量的氨水，隨加隨攪拌，至開(kāi)始產(chǎn)生的沉淀將近全溶為止，過(guò)濾。 N!SGX+ Wq<>a;m 4-去氧糖顯色試劑 r;|Bc$P 2muhJ （1）三氯化鐵冰醋酸（Keller-Kiliani）試劑 eb9qg.9Z K<ygcWE 甲液：1%三氯化鐵溶液0.5ml，加冰醋酸至100ml。 ;4

53、 ?%k ) LaN4%;X1- 乙液：濃硫酸。 U?$v 1| Vg:P6s （2）占噸氫醇冰醋酸（Xanthydrol）試劑：10mg占噸氫醇溶于100ml冰醋酸（含1%的鹽酸中） ec=4LV* zN2sipJS8 （二）酚類(lèi) ulj+D?H q8kt_&Ij 1三氯化鐵試劑：5%三氯化鐵的水溶液或醇溶液。 gvcT_' qZ1fQN1yG 2三氯化鐵一鐵氰化鉀試劑： mYb|cS3p$ )3G?5 OTS 甲液：2%三氯化鐵水溶液 b%)a5H( 8=2)I. 乙液：1%鐵氰化鉀水溶液 ?L. n:wu CX1'B0=r 應(yīng)用時(shí)甲液、乙液等體積混合或分別滴加。

54、V'6%G:?0a 7vHU49DV 3、4一氨基氨替比林一氨氰化鉀（Emerscn）試劑： TnKe"TA|9 =XWi+') 甲液：2%4-氨基安替比林乙醇液 ( E0be. RQh4RUm 乙液：3%鐵氰化鉀水溶液，（或用0.9%4-氨基安替比林和5.4%鐵氰化鉀水溶液）。 UqNO JC j"8GB 4重氮化試劑：本試劑系由對(duì)硝基苯胺和亞硝酸鈉在強(qiáng)酸下經(jīng)重氮化作用而成，由于重氮鹽不穩(wěn)定很易分解，所本試劑應(yīng)臨用時(shí)配制。 pM' k=d =WRPGM*9 甲液：對(duì)硝基苯胺0.35g，溶于濃鹽酸5ml，加水至50ml。 cl;%4$9 E0Uj&g

55、t;9+ 乙液：亞硝酸鈉5g，加水至50ml jMZ>l.v :g=n&x 應(yīng)用時(shí)取甲、乙液等量在冰水浴中混合后，方可使用。 +YdfrF Ow&4F; 5Gibb試劑： RV7l=G9tq EanGDLz8 甲液：0.5%2，6-二氯苯醌-4氯亞胺的乙醇溶液。 vJ p yp_: RE 乙液：硼酸一氯化鉀一氫氧化鉀緩沖液（pH9.4）。 KR%DpQ&' -dZ7;n5&_ 注試劑配制法中：1.水是指蒸餾水；2.不指出溶劑的即為水溶液；3.醇指95%；4.試劑配制后應(yīng)澄清，如不澄清可過(guò)濾。 (.K|l 9v8JaI3 （三）內(nèi)酯、香豆素類(lèi) >7p?*&7; I_oJx 1異羥肟酸鐵試劑 KL-$B*i !MOVvO 甲液：新鮮配制的1N羥胺鹽酸鹽（M=69.5）的甲醇液。 D PjTR RtwlPz<S 乙液：1.1N氫氧化鉀（M=56.1）的甲醇液 M,7A|?O 1VxMx 丙液：三氯化鐵溶于1%鹽酸中的濃度為1%的溶液。 09eH .'k2%ILp 應(yīng)用時(shí)甲、乙、丙三液體按次序滴加，或甲、乙兩液混合滴加后再加丙液。 $hZb<Xz r&"D#)sy 24-氨基安替比林一鐵氰化鉀試劑（見(jiàn)二一（二）-3）。 MB06=N ?rOVey 3重氮化試劑：（見(jiàn)二