抗菌肽生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)及其產(chǎn)業(yè)化改

1、抗菌肽生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)及其產(chǎn)業(yè)化吳松剛 施巧琴 鄭 毅 黃建忠（福建師范大學(xué)工業(yè)微生物發(fā)酵技術(shù)國家工程研究中心 福州 350108）趙燕玉 蔡玉鳳 孫 艷 黃欽耿 （福建省麥丹生物集團(tuán)有限公司福州研究院 福州 350107）1.0 技術(shù)背景抗菌肽具有多種功效，可替代對人類健康有危害的抗生素和抗菌類藥物在飼料中添加，是理想的無毒、無殘留、高效廣譜、抗菌，促生長的綠色飼料添加劑，被認(rèn)為是抗生素的理想替代品。目前我國采用高效抗菌肽生產(chǎn)菌株，使用優(yōu)化發(fā)酵工藝，配合低溫干燥技術(shù)，生產(chǎn)具有高效價的抗菌肽產(chǎn)品。隨著社會的發(fā)展和人們的生活水平提高，更多的人越來越關(guān)心食物的安全和健康問題，無污染、無殘留和無公害的安

2、全綠色食品已逐步成為人們一種新的消費(fèi)追求。飼料添加劑是生產(chǎn)飼料的源頭之一，其質(zhì)量直接影響飼料的質(zhì)量，而飼料的質(zhì)量又直接影響到畜禽的質(zhì)量，所以要生產(chǎn)出綠色安全的畜禽產(chǎn)品，就必須嚴(yán)把飼料添加劑的質(zhì)量和安全關(guān)。目前，所有的常規(guī)抗生素都出現(xiàn)了相應(yīng)的抗藥性致病株系，致病菌的抗藥性問題已經(jīng)日益嚴(yán)重地威脅著人們的健康。隨著抗生素的大量廣泛用于飼料中和人們對食品和環(huán)境質(zhì)量的要求越來越高，人們對抗生素的副作用認(rèn)識日益加深，抗生素在飼料業(yè)中的應(yīng)用，已面臨著淘汰或禁用的局面。從2006年4月1日開始，歐盟已禁止在飼料中添加抗生素類飼料添加劑。許多國家對抗生素、化學(xué)合成藥品的使用、淘汰、畜產(chǎn)品中的藥物殘留作了非常嚴(yán)格

3、的限定，并致力于開發(fā)和推廣無害的綠色飼料添加劑，以生產(chǎn)出安全可靠的食品“綠色畜產(chǎn)品”，來滿足人們的需求。人們正從天然物質(zhì)中尋找理想的無毒、無殘留、高效廣譜、抗菌促生長的綠色飼料添加劑，并應(yīng)用于養(yǎng)殖生產(chǎn)。我國也已經(jīng)開始限制抗生素在飼料中的添加和用量，應(yīng)用無毒無公害的新型抗菌劑代替抗生素作飼料添加劑，已成為當(dāng)前國內(nèi)外飼料學(xué)科的一項重要內(nèi)容。隨著我國進(jìn)入WTO，抗生素作飼料添加劑必將嚴(yán)重影響畜產(chǎn)品在國際市場的競爭力，借助生物高科技的最新成果，研發(fā)對環(huán)境友好型的、綠色環(huán)保的多肽類生物添加劑及抗生素替代劑，徹底扭轉(zhuǎn)和杜絕濫用抗菌素和激素類添加物的問題，是提高人類健康水平、促進(jìn)生產(chǎn)和生活質(zhì)量需要迫切解決的

4、課題。抗菌肽( Antibacterial peptide) 又叫抗微生物肽(Antimicrobial peptide) 、抗生素肽(Antibiotics peptide) ?？咕氖巧锛?xì)胞特定基因編碼產(chǎn)生的一類小分子多肽, 其生成和釋放是機(jī)體炎癥反應(yīng)的組成部分, 是宿主防御病原微生物入侵的重要分子屏障。抗菌肽具有分子量低、水溶性好、熱穩(wěn)定、強(qiáng)堿性和廣譜抗菌等特點, 愈來愈受到重視, 研究已深入到分子結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制等多個方面。抗菌肽最初是Boman 從天蠶的免疫血淋巴中純化, 而后又在哺乳動物、鳥類、植物以及細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)。時至今日, 發(fā)現(xiàn)的抗菌肽大約有800 多種。微生物來源的抗菌肽是抗菌

5、肽家族中的重要一員, 它能特異性殺死競爭菌而對宿主本身無害,包括環(huán)形肽、糖肽和脂肽, 如短桿菌肽、桿菌肽、多黏菌素和乳酸鏈球菌肽等。如Lantibiotic 是革蘭陽性菌產(chǎn)生的抗菌肽, 乳鏈菌肽nisin 是其中研究最為清楚的lantibiotic 類抗菌肽。一些由真菌產(chǎn)生的抗菌肽, 如哌珀霉素類( peptaibol) 抗菌肽, 主要由木霉屬土壤真菌產(chǎn)生。隨著人類對抗菌肽研究的進(jìn)一步深入, 近年,不斷從微生物中發(fā)現(xiàn)和提取具有抗菌活性的肽類物質(zhì)。我國抗菌肽生產(chǎn)菌株普遍采用枯草芽孢桿菌，其產(chǎn)生的是一種混合多肽, 由于結(jié)構(gòu)上很相似,各個成分極難分開。已報道的桿菌肽組分有A, A' ,B,

6、C, D, E, F, F1, F2, F3, G 等。A 組分是其中生物活性最高也是最重要的組分, 通常稱之為桿菌肽Gramicidina, 分子式為C66H103N17O16S, 其結(jié)構(gòu)是由12個氨基酸組成的多肽。具有環(huán)狀結(jié)構(gòu), 分子中含有D-和L-氨基酸。對各種蛋白質(zhì)水解酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和無花果蛋白酶等具有很大的抗性, 也不受蛋白酶抑制劑的影響。與其它抗生素比較, 這是一個優(yōu)點。如果把桿菌肽制成鋅鹽或亞甲基水楊酸鹽, 就比天然產(chǎn)品要穩(wěn)定得多。桿菌肽對多種革蘭氏陽性病原菌, 如葡萄球菌、溶血性鏈球菌、微型球菌、藤黃八疊菌、非溶血性鏈球菌、魏氏梭菌、放線菌以及部分革蘭氏陰性

7、菌均有較強(qiáng)抑制作用。桿菌肽的作用機(jī)理是由于能抑制細(xì)胞壁所合成的脫磷化過程, 影響磷脂載體的轉(zhuǎn)運(yùn)及向細(xì)胞壁支架輸送粘肽, 從而抑制細(xì)胞壁的合成; 另一方面是與敏感菌的細(xì)胞膜結(jié)合損傷細(xì)胞膜使細(xì)胞膜的通透性增加導(dǎo)致內(nèi)粘質(zhì)外流; 其次是干擾敏感菌細(xì)胞內(nèi)原漿蛋白的合成?？咕耐ㄟ^摧毀細(xì)菌的細(xì)胞膜起殺滅作用近年來, 桿菌肽制劑在動物飼料添加劑上的應(yīng)用取得了巨大的成功, 桿菌肽鋅( Bac-itracin Zine)被美國首先批準(zhǔn)作飼料添加劑使用以來, 已為各國批準(zhǔn)使用。因其抑菌促生性能良好,比較安全可靠, 成為發(fā)展最快、應(yīng)用最廣的新型飼料添加劑。我國已于1990 年批準(zhǔn)生產(chǎn)與使用國內(nèi)產(chǎn)品。2.0 抗菌肽生

8、產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)2.1 高效價抗菌肽菌株的篩選在從昆蟲及試樣中分離出產(chǎn)抗菌肽的細(xì)菌菌株共156株,經(jīng)鑒別其中:短桿菌48株、芽孢桿菌66株及乳酸鏈球菌42株,在初篩過程中，發(fā)酵效價在5000 µ/ml以上者有36株，其中：短桿菌8株、芽孢桿菌22株及乳酸鏈球菌6株,經(jīng)復(fù)篩有15株發(fā)酵效價在5000µ/ml以上，均為枯草芽孢桿菌，以T-1045為最高達(dá)10453.3µ/ml，其次為T-1278，T-2856及T-3033均達(dá)9926.6 µ/ml。表1 高效價抗菌肽菌株的篩選結(jié)果之一菌號ODpH效價（µ/ml）菌落形態(tài)T-10080.215 5.54

9、6915.9較大0.216 5.49 0.214 5.53 T-10430.244 5.50 6916.90.226 5.49 0.223 5.52 T-10450.215 5.63 10453.30.213 5.62 0.213 5.62 T-12110.219 5.43 8952.80.227 5.53 0.207 5.54 T-12780.241 5.48 9926.60.216 5.55 0.226 5.51 T-12980.234 5.54 7668.2中等0.240 5.53 0.244 5.52 T-13440.235 5.52 5073.60.258 5.53 0.252 5.

10、52 T-15760.264 5.54 7668.20.239 5.56 0.236 5.52 表2 高效價抗菌肽菌株的篩選結(jié)果之二T-15880.243 5.44 7556.4較小0.233 5.51 0.240 5.50 T-15920.245 5.51 7668.20.252 5.50 0.246 5.51 T-18790.238 5.49 7668.20.226 5.60 0.235 5.49 T-19660.257 5.52 7668.20.236 5.56 0.272 5.49 T-28560.247 5.55 9926.60.245 5.62 0.238 5.66 T-29360

11、.266 5.49 8952.80.262 5.47 0.244 5.47 T-30330.242 5.44 9926.60.255 5.44 0.249 5.44 2.2 T-1045菌株種子及發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化2.2.1 T-1045菌株種子培養(yǎng)基配方四因素七水平均勻法設(shè)計方案表3 種子培養(yǎng)基配方四因素七水平均勻法設(shè)計方案（%）因子蔗糖糖蜜玉米漿粉硫酸銨N12.004.202.200.50N22.603.802.000.65N31.804.000.900.70N41.404.801.500.60N52.203.001.300.55N62.404.401.100.45N71.603.401.70

12、0.402.2.2 T-1045菌株種子培養(yǎng)基配方四因素七水平均勻法實驗結(jié)果表4 四因素七水平均勻法實驗結(jié)果之一項 目N116h20h24hODpHODpHODpH0.3066.280.3197.340.2907.94N20.2886.220.3356.380.3067.91N30.3436.020.2885.810.3237.05N40.2546.050.2887.280.2927.60N50.2585.990.3286.910.3567.29N60.2766.120.2936.030.3517.08N70.2716.110.2727.620.2717.53表5 四因素七水平均勻法實驗結(jié)果之

13、二配方配方編號培養(yǎng)時間培養(yǎng)基成份蔗糖糖蜜玉米漿粉硫酸銨種子配方N-316h 1.804.000.900.70N-161.404.762.20.70N-220h 2.603.802.000.65N-202.604.802.20.70N-520h和24h 2.203.001.300.55N-2424h2.584.000.90.51發(fā)酵配方（一）25h3.505.30 0.84 0.60 注：N16、N20、N24分別為16h、20h、24h理論擬合結(jié)果表6 四因素七水平均勻法實驗結(jié)果之三種子培養(yǎng)時間配方編號OD*50pHOD*100pH效價(µ/ml)16h種齡N-30.2865.810

14、.194 6.01 83330.204 5.94 0.198 5.87 N-160.3067.160.186 6.13 85760.186 6.14 0.191 6.11 20h種齡N-20.3247.560.212 5.93 84760.182 5.90 0.212 5.94 N-50.2957.150.210 6.32 93040.204 6.37 0.207 6.44 N-200.3626.560.176 5.96 116670.201 5.89 0.202 5.92 24h種齡N-50.326.720.185 6.33 91060.175 6.41 0.171 6.32 N-240.3

15、496.190.204 5.97 93670.208 5.94 0.2215.93 上述結(jié)果表明:種子N-20配方，發(fā)酵20h，效價最高達(dá)11667µ/ml。2.2.3 T-1045菌株種子及發(fā)酵培養(yǎng)基綜合優(yōu)化結(jié)果2.2.3.1 T-1045菌株種子培養(yǎng)基綜合優(yōu)化結(jié)果表7 T-1045菌株種子培養(yǎng)基綜合優(yōu)化結(jié)果配方PHOD生物量效價(µ/ml)1016.990.28338.0%173001025.450.11514.0%147301036.820.21717.4%150061047.780.24820.6%10767原配方6.420.12710.0%118682.2.3.2

16、 T-1045菌株發(fā)酵培養(yǎng)基綜合優(yōu)化結(jié)果表8 T-1045菌株發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果配方編號PHOD生物量效價(µ/ml)2016.70 0.24316%242802025.47 0.20811%256702036.40 0.29616%23450原配方7.15 0.31414%119662.2.3.3 T-1045菌株發(fā)酵培養(yǎng)基綜合優(yōu)化結(jié)果表9 T-1045菌株發(fā)酵培養(yǎng)基綜合優(yōu)化結(jié)果配方編號PHOD生物量效價(µ/ml)平均效價(µ/ml)3017.35 0.43722%27670276237.40 0.44222%275763026.38 0.16511%2480

17、6248096.34 0.17411%248113037.31 0.39223%21495214317.28 0.39427%213673047.11 0.42926%973097037.11 0.38926%9675原配方6.02 0.20712%11795117896.06 0.20312%118056.11 0.20212%11766上述結(jié)果表明:種子培養(yǎng)基以編號101最高,達(dá)17300µ/ml,發(fā)酵培養(yǎng)基以編號202最高,達(dá)25670 µ/ml,綜合優(yōu)化培養(yǎng)基以編號301最高,達(dá)27623 µ/ml，比原配方11789µ/ml，提高了134.3%

18、，效果極為顯著，實現(xiàn)了預(yù)定的技術(shù)指標(biāo)。2.2.4 T-1045菌株發(fā)酵配方優(yōu)化及產(chǎn)品載體比較表10 T-1045菌株發(fā)酵配方優(yōu)化及產(chǎn)品載體比較之一配方編號種子培養(yǎng)時間種子培養(yǎng)結(jié)果發(fā)酵培養(yǎng)時間發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)果OD值PH值OD值PH值效價（(µ/ml)40124h0.1876.3848h0.2907.492096040224h0.1976.7530h0.1946.731835740320h0.1246.4425h0.2155.1321505 表11 T-1045菌株發(fā)酵配方優(yōu)化及產(chǎn)品載體比較之二配方編號載體濕樣干樣水分（%）效價（µ/g）水分（%）效價（µ/g）401膨化

19、玉米44.58851313.7316625麩皮49.9662319.2518944402膨化玉米49.36630813.6014590麩皮52.4033359.9616625403膨化玉米41.83887111.9518944麩皮49.1165227.0319752上述結(jié)果表明:2.2.4.1 T-1045菌株發(fā)酵配方優(yōu)化以編號403配方為最佳，發(fā)酵效價達(dá)21505µ/ml。2.2.4.2 抗菌肽產(chǎn)品載體比較了膨化玉米和麩皮，這兩者均可作為載體，但麩皮效價稍高。2.3 抗菌肽產(chǎn)品穩(wěn)定性試驗 為了考核抗菌肽產(chǎn)品的穩(wěn)定性，進(jìn)行了24個月在室溫條件下的效價變化，具體見表25和圖1。表12

20、抗菌肽產(chǎn)品在室溫條件下的效價變化 年-月月平均溫度（）效價（µ/g）2010-1025.3225002010-1121.9220002010-1219.0210002011-0112.9200002011-0214.3195002011-0317.2193002011-0423.5190002011-0525.4188002011-0631.7185002011-0732.6181002011-0832.5176002011-0929.7175002011-1025.5170002011-1122.5165002011-1216.2161002012-0113.3157002012-

21、0213.0150002012-0316.6143002012-0422.4140002012-0526.0120002012-0629.6110402012-0733.4105402012-0832.0101402012-0929.610040圖1. 抗菌肽產(chǎn)品在室溫條件下的效價變化上述結(jié)果表明:抗菌肽產(chǎn)品在室溫條件下，經(jīng)2年時間起始效價由22500µ/g下降到10040µ/g，下降率僅為55.4%。而1年的下降率僅22.2%，說明該產(chǎn)品具有相當(dāng)好的穩(wěn)定性，此項試驗仍在繼續(xù)進(jìn)行中。3.0 抗菌肽應(yīng)用效果3.1 抗菌肽對仔豬喂養(yǎng)試驗及其效果3.1.1 試驗分組：采用單因子濃

22、度梯度法設(shè)計，試驗設(shè)2組：對照組、0.3%生物抗菌肽組。每個組設(shè)4個重復(fù)，每個重復(fù)12頭仔豬下表。試驗分組序號項目對照組試驗組1生物抗菌肽添加水平00.3%2仔豬頭數(shù)（頭）48483.1.2 試驗材料：試驗選用28日齡斷奶、遺傳背景相同、體重相近的仔豬隨機(jī)分組。3.1.3 抗菌肽產(chǎn)品效價：8320µ/g3.1.4 試驗日糧：按試驗豬場正常使用日糧，生物抗菌肽按試驗分組中的添加水平添加，直接加到配合飼料中制?；虬枇巷曃?。3.1.5 試驗時間：2012年1月5日起到2月4日結(jié)束，共30天。3.1.6 試驗情況：按豬場正常飼養(yǎng)管理程序進(jìn)行，試驗期間自由采食、飲水，正試期間記錄每天的飼料消耗量、腹瀉情況，試驗開始和試驗結(jié)束禁飼(自由飲水) 24h 后空腹稱重。經(jīng)過30天的飼養(yǎng)試驗，仔豬未出現(xiàn)疫情，沒有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。仔豬腹瀉方面，對照組偶爾有小豬腹瀉，但情況不嚴(yán)重，康復(fù)較快，而試驗組未腹瀉現(xiàn)象極少。從皮毛質(zhì)量方面看，試驗組明顯好于對照組。試驗具體數(shù)據(jù)如表1：表13 抗菌肽對仔豬養(yǎng)殖試驗效果序號項目對照組試驗組1生物制劑添加水平00.3%2仔豬頭數(shù)（頭）48483初始總重（kg）4364384初始均重（kg/頭）9.109.135總耗料量（kg）98611026日均采食量（kg/頭.天）0.6850.7657試