Survivin基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在cos7中的表達(dá)

1、Survivin基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在cos-7中的表達(dá) 作者：李紅李明紅楊樺鐔旭民 【摘要】 目的克隆人survivin基因并在真核細(xì)胞中表達(dá)。方法 以人喉癌組織中提取總RNA為模版，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈RT-PCR法獲得survivin cDNA。將該基因克隆到pcDNA3.0載體中,構(gòu)建真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.0/survivin，將測(cè)序正確的survivin基因通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染cos-7，Western blot檢測(cè)survivin蛋白在cos-7中表達(dá)。結(jié)果 DNA測(cè)序證明獲得了survivin基因，其序列與GeneBank中報(bào)道序列完全一致。Western blot檢

2、測(cè)survivin蛋白獲得高效表達(dá)，其相對(duì)分子質(zhì)量為16.5kD。結(jié)論 Survivin基因的克隆和表達(dá)均獲得了成功，為進(jìn)一步探討survivin基因在喉癌診治中應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】 survivin基因人喉癌組織基因表達(dá)Construction of Survivin Eukaryotic Expression Vector and Its Expression in cos-7 Abstract: Purpose To clone and express human survivin gene with eukaryotic vector. Methods Total mRNA w

3、as extracted from human laryngeal cancer tissue, and then the full-length survivin cDNA was obtained by RT-PCR. The surivin gene was cloned into pcDNA3.0 vector and the pcDNA3.0/survivin vector was constructed and transfected into cos-7 cells. The survivin protein was analyzed by western blot. Resul

4、ts The cDNA of survivin was sequenced and consistent with the sequence reported in Genebank with blast。 Western blot analysis demonstrated that the survivin protein was expressed and the relatived molecular mass was about 16.5kD. Conclusions survivin gene has been cloned and expressed successfully a

5、nd can be used for further study the applications of survivin on diagnosis and therapy in the laryngeal cancer. Key words: survivin gene; eukaryotic expression; vector construction Survivin是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAP)家族的成員，其功能主要通過(guò)抑制Caspase-3和Caspase-7的活性而阻斷細(xì)胞凋亡過(guò)程。該蛋白選擇性地表達(dá)于胚胎發(fā)育

6、組織和人類大多數(shù)腫瘤組織，而正常成人終末組織中不表達(dá)，其獨(dú)特的分布特點(diǎn)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的重要作用已受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注。為了進(jìn)一步探討該基因在人喉癌組織中的表達(dá)及其在喉癌診斷及預(yù)后判斷中的作用，我們構(gòu)建了survivin基因的真核表達(dá)載體并將其轉(zhuǎn)染cos-7細(xì)胞以觀察該基因在其中的表達(dá)情況，為下一步喉癌的診斷和治療提供新的理論依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 材 料 人新鮮喉癌組織、pcDNA3.0質(zhì)粒和猴成纖維細(xì)胞cos-7細(xì)胞系及DH5菌株均為本科保存。限制性內(nèi)切酶及胰蛋白酶購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司；T4DNA連接酶、DNA純化試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Promega公司，用于組織

7、總RNA提取的Tripure Isolation Reagent提取試劑盒購(gòu)于Gibco公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine Reagent 2000和G418購(gòu)于Gibco公司，survivin兔抗人多克隆抗體購(gòu)自于Santa cruz公司。 1.2 方 法 1.2.1 PCR引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Gene Bank中survivin序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物， P1(survivin基因上游引物，5GCCGGTACCATGGGTGCCCCGACG； 3P2(survivin基因下游引物，5GCCCTCGAGTCAATCCATGGCAGC 3。在上游和下游引物5端分別加入了BamH和Xho酶切位點(diǎn)，以便

8、于克隆。引物由上海博亞生物有限公司合成。 1.2.2 目的基因survivin片段的獲得 取手術(shù)切除的人新鮮喉癌組織，機(jī)械搗碎后，消化收集、洗滌、沉淀，以Tripure Isolation Reagent 總RNA試劑提取總RNA(詳見(jiàn)試劑操作說(shuō)明)，按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作，以反轉(zhuǎn)錄體系經(jīng)RT-PCR制備survivin cDNA，反應(yīng)如下:取總RNA 1，oliga dT 2l，混勻后70 10min，冰浴2min后加5倍逆轉(zhuǎn)錄緩沖液5l，10mmol/L dNTP 2l，RNA酶抑制劑2l，逆轉(zhuǎn)錄酶(MLV RT)40，混勻后42水浴60min，冰浴2min，70加熱10min后模板制備完畢。以

9、所制備survivin cDNA為模板進(jìn)行35個(gè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下:模板cDNA 8l，10倍緩沖液10l，25mmol/L MgCl2 10l，上、下游引物(10/)4l，TagDNA聚合酶2l，10mmol/L dNTP2l，加2補(bǔ)足至總體積100l。反應(yīng)條件為:94 5min，52 2min，72 2min后94 1min，52 1min，72 2min，35個(gè)循環(huán)，最后72繼續(xù)延伸10min。取5l PCR產(chǎn)物，在含0.5mg/溴化乙錠(EB)的瓊脂糖凝膠(15/)中電泳分析，紫外觀測(cè)儀觀察結(jié)果。 1.2.3 Survivin基因的克隆及真核載體pcDNA3.0/surviv

10、in的構(gòu)建 回收純化的產(chǎn)物經(jīng)BamH/Xho雙酶切并回收,取10l回收片段，加經(jīng)BamH/Xho雙酶切的pcDNA3.0質(zhì)粒2l，加T4DNA連接酶1l、10×buffer 2l、雙蒸水5l，4過(guò)夜進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，命名為pcDNA3.0/survivin。取連接產(chǎn)物10l轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5 100l，與培養(yǎng)液混勻,倒入含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，用涂菌棒均勻涂平，置37孵箱過(guò)夜。用牙簽隨機(jī)挑取單個(gè)菌落，置搖菌管中，37恒溫振蕩器搖菌16。移菌液至離心管中，離心棄上清,按試劑盒說(shuō)明書(shū)介紹進(jìn)行質(zhì)粒的抽提和純化。同時(shí)取1ml菌種送上海生工測(cè)序。抽提純化的重組質(zhì)粒4l，加10&

11、#215;buffer 1l，BamH和Xho各0.5l，雙蒸水4l，置37恒溫箱進(jìn)行酶切1，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。 1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立 cos-7細(xì)胞在含100ml/新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至70%左右，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下將重組質(zhì)粒pcDNA3.0/survivin進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體方法參照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。418(濃度為500/ml)篩選。 1.2.5 Western blot印跡 分別取3×107個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.0(+)及重組質(zhì)粒pcDNA3.0/survivin的cos-7細(xì)胞，裂解后加入3×加樣緩沖液混勻，沸水中煮10min，

12、離心，經(jīng)15%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，在轉(zhuǎn)移槽中將蛋白從凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上(電壓14，冷室內(nèi)過(guò)夜)，麗春紅染液預(yù)染并標(biāo)記蛋白分子量。TBST緩沖液洗膜、封閉過(guò)夜。加TBST緩沖液稀釋的兔抗人survivin多克隆抗體(1200)作為一抗，37孵育15，加堿性磷酸酶標(biāo)記IgG(1400)作為二抗，孵育、洗膜后，將膜浸入10ml堿性磷酸酶底物緩沖液與33四唑氮藍(lán)(NBT)和66(BCIP)制成的顯色液，室溫閉光顯色20min，蒸餾水終止反應(yīng)。 2 結(jié) 果 2.1 Survivin基因的獲得與鑒定 以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR電泳結(jié)果顯示一條約

13、為425大小的特異性條帶。此DNA帶與survivin基因的大小相符合(425)，圖中未見(jiàn)有其他非特異擴(kuò)增帶出現(xiàn)(圖1)。將該DNA帶回收后，DNA測(cè)序結(jié)果表明，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR獲得的DNA片段為survivin基因，其DNA序列與GeneBank中報(bào)道的survivin基因序列吻合。 2.2 Survivin基因的克隆及真核表達(dá)載體pcDNA3.0/survivin的酶切結(jié)果 Survivin基因插入表達(dá)載體后，提取獲得的重組質(zhì)粒pcDNA3.0/ survivin，以雙酶切鑒定，鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中有一425bp的條帶為轉(zhuǎn)染基因survivin產(chǎn)物。 2.3 Survivin蛋白表達(dá) 將正確的重

14、組菌在37活化過(guò)夜，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后做SDS-PAGE分析，從電泳圖可以看出在表達(dá)蛋白理論相對(duì)分子質(zhì)量(16.5×103)對(duì)應(yīng)處出現(xiàn)了一條新的表達(dá)帶。 3 討 論 近年來(lái)已陸續(xù)有文獻(xiàn)報(bào)道survivin蛋白在頭頸部腫瘤組織中的表達(dá)13 ，本文通過(guò)分子生物學(xué)方法克隆擴(kuò)增喉癌組織中survivin基因，構(gòu)建真核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染cos-7細(xì)胞，為下一步研究survivin基因并探索腫瘤的生物治療奠定基礎(chǔ)。 Survivin是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新的凋亡抑制因子，屬于凋亡抑制蛋白家族的新成員，是迄今發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的一種凋亡抑制蛋白4，主要通過(guò)抑制Caspase-3和Caspase-7的活性而阻斷細(xì)

15、胞凋亡過(guò)程，而且能在細(xì)胞有絲分裂前期通過(guò)與紡錘體微管發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞逃避細(xì)胞周期2/期檢測(cè)點(diǎn)的監(jiān)控，抵抗因DNA損傷和突變自身誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞異常分裂增殖。Survivin主要表達(dá)于胚胎和發(fā)育的胎兒組織，同時(shí)高表達(dá)于多種腫瘤組織和轉(zhuǎn)化細(xì)胞，在成人各種正常器官中檢測(cè)不到。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌、前列腺癌、乳腺癌、子宮頸癌、口腔鱗癌、鼻咽癌和造血系統(tǒng)腫瘤中survivin均過(guò)度表達(dá)5，6。由于survivin僅特異性地表達(dá)于腫瘤組織，在正常成人組織幾乎不表達(dá)，使得應(yīng)用survivin特異性抗體作免疫治療、決定基因突變以及反義survivin基因治療具有良好的靶向性、特

16、異性及安全性，具有成為喉癌治療的潛在新靶點(diǎn)7，8。 我們以人喉癌組織總RNA為模板，擴(kuò)增survivin基因，插入原核表達(dá)載體，成功地表達(dá)了survivin蛋白。不僅證實(shí)了survivin在喉癌組織中有表達(dá)，而且為進(jìn)一步研究其在喉癌及其他惡性腫瘤的診斷、靶向性治療及預(yù)后判斷中的應(yīng)用意義奠定了基礎(chǔ)。 但有關(guān)survivin促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的許多環(huán)節(jié)還不清楚。隨著對(duì)survivin研究的進(jìn)一步深入，survivin在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制必將進(jìn)一步闡明，而survivin的靶向腫瘤療法及針對(duì)性開(kāi)發(fā)新的抗腫瘤藥物對(duì)腫瘤的治療將具有深遠(yuǎn)的意義。【參考文獻(xiàn)】 1 Salz W, Eisenberg

17、 D, Plescia J. A survivin gene signature predicts aggressive tumor behaviorJ. Cancer Res, 2005, 65(9): 3531-3534.2 Zhu J, Xu RJ, Wu ZH, et al. Expression of survivin gene and its relationship with expression of p15, p16 proteins in laryngeal squamous cell carcinomasJ. Zhonghua Er Bi Yan Hou Ke Za Zh

18、i, 2004, 9(6):356-359.3 Badran A, Yoshida A, Ishikawa K, et al. Identification of a novel splice variant of the human anti-apoptopsis gene survivinJ. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 314(3):902-907.4 Pisarev V, Yu B, Salup R. Full-length dominant-negative survivin for cancer immunotherapyJ. Clin Cabcer Res, 2003, 9(17): 6523