一種AsiaⅠ型口蹄疫重組表位蛋白的表達及免疫活性

1、一種Asia 型口蹄疫重組表位蛋白的表達及免疫活性作者：曹昭 衛(wèi)紅飛 張培因 張永勝 徐海飛 胡小平 萬敏 于永利 王麗穎 王華【摘要】 目的 構建一種能預防Asia 型口蹄疫病毒（FMDV）的感染表位重組蛋白疫苗，并對其免疫學活性進行研究。方法 以Asia 型FMDV VP1上的B細胞表位和T細胞表位氨基酸序列為抗原位點，設計了包含上述位點的、具有最佳空間構象的重組蛋白，命名為“CZ1”。通過PCR及基因克隆等方法構建了其表達質粒，在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導表達。通過鎳親和層析和G25凝膠過濾層析純化及復性，獲得具有免疫學活性的重組蛋白CZ1。免疫豚鼠獲得含針對Asia型FMDV中和

2、抗體的血清，通過細胞中和試驗及乳鼠中和試驗，檢測豚鼠血清中抗FMDV的保護性中和抗體滴度。結果 該基因工程重組蛋白能夠在動物體內(nèi)誘導產(chǎn)生抗Asia型FDMV具有保護性的中和性抗體。結論 該基因工程重組蛋白有望開發(fā)成預防Asia型FDMV感染的新型疫苗。 【關鍵詞】 基因工程疫苗；FDMV；重組蛋白；活性檢測口蹄疫（FMD）是由FMD病毒（FMDV）引起的一種人和動物共患的急性發(fā)熱性高度接觸性的傳染病1。傳統(tǒng)FMD疫苗為弱毒疫苗或滅活疫苗，雖具有良好的免疫原性，但由于存在著滅活不徹底以及防護不當，而致病毒擴散傳播的危險，這些不安全因素促使人們尋求新型的疫苗。有研究證明，T和B細胞抗原原位串聯(lián)連接

3、構建而成的基因工程疫苗能引起有效的機體免疫應答，有利于具有保護性的中和抗體的產(chǎn)生2。本研究以Asia 型FMDV VP1上的B和T細胞表位氨基酸序列為抗原位點，采用計算機軟件篩選出最佳的表位組合形式，擬利用基因工程方法構建、表達包含上述位點的氨基酸序列的重組蛋白，以探索一種新型的Asia型FMDV基因工程疫苗。1 材料與方法1.1 菌種、質粒、引物、試劑、動物及FMD滅活疫苗JM109菌種、BL21(DE3)菌種、質粒pMD18T和pET28a(+)均由本室保存。引物均由上海生工生物工程技術有限公司合成。Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、dNTP、T4連接酶均購自TAKARA公司。IPTG購

4、自Promega。其他試劑均為國產(chǎn)分析純或試劑純。層析介質NiSepharose 4B、G25 Superdex 購自Healthcare GE。牛AsiaFMD滅活疫苗購自內(nèi)蒙古生物藥品廠。豚鼠購自長春高新技術開發(fā)區(qū)醫(yī)學動物實驗研究中心。1.2 重組質粒pET28aCZ1的構建及鑒定結合文獻報道，選取Asia 型VP1上的B和T細胞表位的氨基酸序列，結合計算機空間構象模擬篩選出多個T、B細胞表位串聯(lián)形式的重組蛋白。用PCR法構建表位的基因序列，將其與pMD18T連接后，構建串聯(lián)的重復序列；采用EcoR和Hind 雙酶切后，將基因片段亞克隆至經(jīng)同樣雙酶切的pET28a（+）質粒上，構建成含目的

5、基因片段的pET28aCZ1重組質粒；送上海生工生物工程技術有限公司進行測序。1.3 CZ1重組蛋白疫苗的表達將重組質粒pET28aCZ1轉化至E.coli BL21(DE3)表達菌中，經(jīng)LB平板篩選后，挑取單克隆接種至LB培養(yǎng)液，于37、220 r/min振蕩培養(yǎng)，當菌液A600=0.6時，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，37、220 r/min振蕩誘導、培養(yǎng)3 h，離心收集細菌。取誘導前后樣品進行SDSPAGE鑒定。1.4 CZ1蛋白的純化取10 g濕菌與裂菌液（含8 mol/L尿素）按15(M/V)重懸后，4、攪拌4 h。10 000 r/min離心15 min，取上清加載至

6、預先平衡的NiSepharose 4B層析柱中。用含4 mol/L尿素的洗滌液洗滌至A280到基線后，洗滌液中尿素濃度降至3 mol/L，洗滌1 h后，尿素濃度降至1 mol/L洗滌3 h后，洗脫CZ1蛋白；收集目的蛋白后，加載到預先平衡的G25 Superdex層析柱中，收集CZ1蛋白。將每步驟留取的樣品進行SDSPAGE鑒定。1.5 豚鼠免疫取3只體重為300 g左右豚鼠，股內(nèi)側肌肉注射CZ1蛋白質（200 g/只），同時設立PBS對照和Asia型FMDV滅活疫苗陽性對照。免疫后第21天采集血清。1.6 中和試驗96孔板細胞培養(yǎng)板中加50 l/孔的細胞維持液，再加入50 l/孔倍比稀釋的免

7、疫后21 d的豚鼠血清，最后加入50 l/孔200 TCID50稀釋的病毒，CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h后，加入BHK21細胞，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，萘黑藍染色，Karber法計算血清中和抗體滴度。取滅活補體的免疫21 d后的豚鼠血清分別按132、164、1128、1256稀釋，病毒用維持液稀釋至200 TCID50/100 l，將病毒稀釋液和各稀釋度的血清等量混合后，37 水浴1 h，乳鼠背部注射，100 l/只，每份血清的每個稀釋度注射4只二日齡乳鼠，觀察并記錄注射后68 h每組乳鼠的存活情況，并以Karber法計算保護性中和抗體的滴度。1.7 統(tǒng)計學處理應用SPSS11.0軟件進行兩

8、組間方差檢驗。2 結 果2.1 重組蛋白質空間結構的預測通過DNA star軟件及Expasy網(wǎng)站，對表位的多種構建方式進行蛋白質的二及三級結構預測，篩選出一種能模擬天然構象的表位組合形式，其空間結構預測結果見圖1，其RGD序列（如箭頭所示）充分暴露在細胞表面，可能有利于中和性抗體的產(chǎn)生。后續(xù)實驗按照這種表位組合形式構建并表達目的蛋白，并命名為“CZ1”。2.2 pET28aCZ1重組質粒的構建通過PCR法合成目的基因經(jīng)TA連接后，將其亞克隆至原核表達載pET28a，獲得重組質粒pET28aCZ1。pET28aCZ1 經(jīng)EcoR I和Hind 雙酶切后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，與預期相符（預

9、期為945 bp），見圖2。DNA測序結果與預期相符。2.3 CZ1蛋白的表達及純化將重組質粒pET28aCZ1轉化至大腸桿菌BL21(DE3)表達菌后，接種至LB培養(yǎng)基中，待細菌生長至A600=0.6時，加入IPTG繼續(xù)誘導培養(yǎng)3 h。SDSPAGE分析顯示，目的蛋白質分子量約為42 kD，與預測結果相符，表達產(chǎn)量約占菌體總蛋白的50%左右。經(jīng)誘導后的菌體，以8 mol/L 尿素裂解包涵體，上清經(jīng)鎳親和層析和G25凝膠過濾層析純化，得到純度達到90% 的重組蛋白CZ1。見圖3。2.4 FMDV細胞中和試驗觀察在牛Asia 型FMDV活病毒的攻擊下，CZ1蛋白免疫的豚鼠血清能否中和該病毒對BH

10、K21細胞的感染。若該血清中含有針對牛Asia型FDMV的中和抗體，則可中和FMDV對BHK21細胞的感染而使其存活。結果顯示，免疫后第21天的3份豚鼠血清中和抗體滴度的幾何均數(shù)為286，滅活病毒組為320，與PBS組（3）比較差異顯著(P<0.01)。表明CZ1蛋白可以激活豚鼠體液免疫反應，產(chǎn)生了針對Asia 型FMDV的中和抗體。2.5 中和試驗觀察在活的Asia 型FMDV的攻擊下，CZ1蛋白免疫的豚鼠血清能否保護乳鼠抵抗該病毒的攻擊。將PBS組和CZ1蛋白免疫的各3份豚鼠血清分別按132、164、1128、1256稀釋，分別與FMDV孵育1 h后，注射4只乳鼠。如豚鼠血清

11、中含有針對Asia型FMDV的中和抗體，則乳鼠存活。結果顯示，CZ1重組蛋白免疫的3份豚鼠血清中，針對Asia I型FMDV的中和抗體滴度分別為190、1256和190，幾何均數(shù)為1127，與PBS組比較差異顯著(P<0.01)（表1）。表明CZ1蛋白可以激活豚鼠體液免疫反應，產(chǎn)生針對Asia 型FMDV的中和抗體，能夠保護乳鼠抵抗同型活病毒攻擊。表1 CZ1蛋白免疫的豚鼠血清中抗FMDV中和抗體滴定水平(略)3 討 論 FMDV共有 A、O、C、Asia 1、SAT 1、SAT 2、SAT 3等7個血清型，血清型之間沒有交叉免疫3；在我國，F(xiàn)MD疫情主要以O型、A型、Asia三

12、個血清型為主。2005 年初，我國江蘇、山東等省相繼暴發(fā)了Asia型FMD，感染動物以牛為主，波及我國大多數(shù)省區(qū)4?；蚬こ桃呙缬捎诎踩行?、價廉、易于大規(guī)模生產(chǎn)等，成為新型疫苗研究的熱點。 在本研究中，根據(jù)蛋白質的一級結構決定三級結構從而決定蛋白質功能的原理，通過計算機模擬空間構象的方法篩選最適的基因序列，這種方法大大節(jié)省了時間、節(jié)約了成本。在設計時，考慮我國及周邊國家Asia型 FMDV 流行株VP1 基因的抗原位點，以 FMDV VP1 的B和T細胞表位串聯(lián)的方式，成功地構建了由6個表位組成的重組蛋白。選用大腸埃希氏菌作為表達系統(tǒng)，并考慮了大腸桿菌密碼子的偏愛性，對部分基因序列進行了同義

13、突變，以便提高多表位基因在大腸桿菌中的表達效率5，6，極大提高了重組蛋白CZ1的表達量，約占菌體總蛋白的50%。雖然pET表達系統(tǒng)所表達的蛋白產(chǎn)物帶有6個His標簽，易于純化，但大腸埃希氏菌表達系統(tǒng)表達的蛋白缺少諸如糖基化和磷酸化之類的翻譯后修飾作用，常形成包涵體，不利于表達產(chǎn)物的純化回收，且對獲得有生物學活性的表達產(chǎn)物造成極大的困難。重組蛋白CZ1為包涵體表達，本室采用了在NiSepharose層析純化的同時，通過逐步降低洗滌緩沖液中的尿素濃度，使重組蛋白CZ1復性，實現(xiàn)了重組蛋白質純化和復性同時進行，極大簡化了工藝。 本試驗結果表明，該重組蛋白疫苗能夠誘導豚鼠產(chǎn)生具有針對Asia 型FMD

14、V的保護性中和抗體，可以中和該病毒對BHK21細胞的感染，且能夠保護乳鼠抵抗同型活病毒的攻擊，原因可能是由于重組蛋白CZ1能形成類似于天然FMDV VP1蛋白的三維構象。以上結果表明，該重組蛋白具有保護牛抵抗Asia 型 FMDV 的潛能，有可能開被發(fā)成為Asia 型FMD基因工程疫苗。 致謝：感謝內(nèi)蒙古金宇生物公司實驗中心協(xié)助完成細胞中和試驗和乳鼠保護試驗。【參考文獻】 1 姚玉紅.口蹄疫流行現(xiàn)狀及防制措施J.中國公共衛(wèi)生，2007;23(6)：7667.2 冉 波，邵明玉，張培因，等.O型口蹄疫病毒VP1表位重組蛋白疫苗的構建、表達和純化J.免疫學雜志，2006;22(3)：2658.3

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