復(fù)方丹參滴丸含藥血清誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞

1、復(fù)方丹參滴丸含藥血清誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞         11-01-13 09:59:00     編輯：studa20                     作者：武重陽(yáng) 孫蘭軍 趙英強(qiáng) 徐強(qiáng) 劉晉平【摘要】  目的 觀察復(fù)方丹參滴丸

2、含藥血清體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)分化為心肌樣細(xì)胞的能力。方法 采用全骨髓直接貼壁的方法分離培養(yǎng)大鼠MSCs，流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面標(biāo)記;采用復(fù)方丹參滴丸的含藥血清體外定向誘導(dǎo)第四代MSCs，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法、原位雜交組織化學(xué)法、透射電子顯微鏡鑒定心肌樣細(xì)胞。結(jié)果 大鼠MSCs細(xì)胞表面抗原CD90、CD106陽(yáng)性，CD34、CD45、CD31陰性。經(jīng)復(fù)方丹參滴丸含藥血清誘導(dǎo)向心肌樣細(xì)胞分化后，免疫細(xì)胞化學(xué)法顯示輔肌動(dòng)蛋白(Actinin)、結(jié)蛋白(desmin)強(qiáng)陽(yáng)性，原位雜交組織化學(xué)法顯示肌球蛋白重鏈(MHC)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)論 復(fù)方丹參滴丸含藥血清能促使MSCs分化為心肌樣細(xì)

3、胞，為中藥干預(yù)MSCs治療缺血性心臟病提供干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 【關(guān)鍵詞】  復(fù)方丹參滴丸;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;心肌樣細(xì)胞;分化;活血化瘀傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為心肌細(xì)胞不能再生，現(xiàn)在的治療手段和措施通常不能防止左心室重構(gòu)和心力衰竭的進(jìn)程。目前認(rèn)為干細(xì)胞可以重塑心肌細(xì)胞，有望可以替代壞死心肌組織。Tomita等1觀察了自體骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植對(duì)大動(dòng)物心肌再生的作用,結(jié)果提示移植細(xì)胞可形成島樣心肌細(xì)胞,促進(jìn)血管新生,防止左室重塑,提高局部及全心的收縮功能。通過(guò)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)心肌內(nèi)移植,組織病理學(xué)和免疫組化的方法顯示輸入的干細(xì)胞可以分化為心肌樣細(xì)胞,血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞2,而且能增加血管密度

4、?；钛鲱?lèi)中藥治療缺血性心臟病有肯定的療效，復(fù)方丹參滴丸具有抗心肌缺血、缺氧和擴(kuò)張冠脈作用,臨床主要用于治療冠心病心絞痛。本研究旨在探討活血化瘀中成藥復(fù)方丹參滴丸能否在體外干預(yù)大鼠MSCs分化為心肌樣細(xì)胞，并為詮釋活血化瘀類(lèi)中藥治療缺血性心臟病機(jī)制提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1 材料與方法1.1 試劑與器材1.1.1 試劑 DMEM低糖培養(yǎng)基，胎牛血清，0.25%胰蛋白酶(含0.01%EDTA)均為Gibco公司產(chǎn)品，小鼠抗大鼠熒光標(biāo)記抗體CD34PE(Santa Cruz)、CD106PE(Biolegend)，CD31FITC、D45FITC、CD90FITC(Serotec)，陰性對(duì)照：小鼠Ig

5、G1PE、小鼠IgG1FITC(Santa Cruz)。小鼠抗大鼠單克隆抗體sarcomeric 輔肌動(dòng)蛋白(Actinin)、結(jié)蛋白(desmin)，肌球蛋白重鏈原位雜交試劑盒(天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?。1.1.2 器材 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Forma)，H600透射電子顯微鏡(HITACHI)，流式細(xì)胞儀(Calibur，美國(guó)BectonDickinson公司)，6孔培養(yǎng)板，25 cm2、75 cm2塑料培養(yǎng)瓶(美國(guó)Corning公司)，倒置相差顯微鏡(Olympus)，Heraeus離心機(jī)(D37520，德國(guó)Osterode公司)。1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠，

6、雄性，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：scxk津20050001。1.2 方法1.2.1 骨髓MSCs的分離擴(kuò)增 100120 g雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死，75%酒精浸泡510 min，無(wú)菌條件下取大鼠股骨、脛骨，去除附著于骨表面的組織，去除股骨、脛骨的骨骺，用20 ml DMEM沖洗骨髓腔獲取骨髓細(xì)胞，收集于離心管內(nèi)，充分吹打制成細(xì)胞懸液，1 000 r/min，20離心10 min，收集細(xì)胞，用20 ml完全培養(yǎng)基(DMEM，20%FBS，青霉素G 100 U/ml、鏈霉素100 U/ml，谷氨酰胺0.2 mmol/L)重懸細(xì)胞，接種于75 cm2的塑料培養(yǎng)

7、瓶中，全程置于5% CO2，37，飽和濕度的孵箱中靜置培養(yǎng)。35 d首次換液，以后每隔34 d換液洗去未貼壁細(xì)胞，原代細(xì)胞鋪滿(mǎn)整個(gè)培養(yǎng)瓶底面的80%90%時(shí)，用0.25%胰酶(含1%EDTA)按13進(jìn)行消化傳代。1.2.2 MSCs的表面抗原檢測(cè) 取第四代骨髓MSCs，經(jīng)0.25%胰酶(含1%EDTA)消化，PBS洗滌23次，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記。1.2.3 復(fù)方丹參滴丸含藥血清制備 根據(jù)成人日服藥量折算成大鼠灌胃劑量，計(jì)算大鼠日灌胃劑量54.34 mg/kg。將大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組每日予復(fù)方丹參滴丸含藥血清灌胃，對(duì)照組予等體積蒸餾水灌胃，均連灌7 d。每日一次。最后1

8、d灌胃30 min后無(wú)菌條件下股動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心15 min，分離血清，56水浴滅活30 min，過(guò)濾除菌，-20短期保存?zhèn)溆茫苽浜幯搴涂瞻讓?duì)照血清。1.2.4 復(fù)方丹參滴丸含藥血清誘導(dǎo)MSCs 選生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P4細(xì)胞，每孔以2×104個(gè)細(xì)胞的濃度接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)至細(xì)胞90%融合后分別誘導(dǎo)，加入含藥血清，體積終濃度為20%,作用72 h后去除培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)，設(shè)西藥組：加入終濃度為5 mol/L的5氮胞苷,預(yù)誘導(dǎo)24 h后去除培養(yǎng)基;中西藥組：加入終濃度為5 mol/L的5Aza,預(yù)誘導(dǎo)24 h后去除培養(yǎng)基，再與含藥血清作用72 h去除培養(yǎng)基，

9、繼續(xù)培養(yǎng);空白組：加入空白對(duì)照血清，體積終濃度為20%，72 h后去處培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察721 d細(xì)胞形態(tài)變化，進(jìn)行免疫組化、電鏡檢測(cè)。1.2.5 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 誘導(dǎo)后的細(xì)胞，用4%多聚甲醛室溫固定2 h，洗滌后，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，分別滴加1抗Actinin、desmin，4過(guò)夜，加生物素化兔抗小鼠IgG1第二抗體，37 45 min，PBS 液沖洗3 次，DAB 顯色，自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染510 min。PBS洗滌藍(lán)化后，蒸餾水沖洗兩次后，37空干后，70%甘油封片。以不加一抗作為陰性對(duì)照。1.2.6 透射電鏡觀察 誘導(dǎo)后的細(xì)胞經(jīng)2.5%戊二醛固定，制成電鏡標(biāo)本，透射電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。1.2.7 原位雜交組織化學(xué) 將誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞，PBS 沖洗3次，4%多