蛋白質組學答案終稿

1、1， 基因組：一個細胞或病毒所包含的全部基因。2， 蛋白質組(Proteome)的概念最先由Marc Wilkins提出。定義：蛋白質組是由一個細胞，一個組織或一個機體的基因組所表達的全部相應的蛋白質。是一個整體概念。 3， 蛋白質組學：是一門以全面的蛋白質性質研究(如表達水平、轉錄修飾、相互作用等)為基礎，在蛋白質水平對疾病機理、細胞模式、功能聯(lián)系等方面進行探索的科學，包括表達蛋白質組學，細胞譜蛋白質組學以3， 等電聚焦：分離兩性分子，特別是分離蛋白質的一種技術。根據(jù)在一個電場的影響下這些兩性分子在ph梯度上的分布情況進行分離等電聚焦技術：在一個pH梯度和外加電場下，蛋白質有移向pH梯度中使

2、其凈電荷為零的點的傾向。（帶正電荷移向陰極，帶負電荷移向陽極）。IEF可以基于極微小的電荷差異而分離蛋白，具有高分辨率。4， 負染就是用重金屬鹽（如磷鎢酸、醋酸雙氧鈾）對鋪展在載網(wǎng)上的樣品進行染色；吸去染料，樣品干燥后，樣品凹陷處鋪了一薄層重金屬鹽，而凸的出地方則沒有染料沉積，從而出現(xiàn)負染效果（圖2-15），分辨力可達1.5nm左右5， 質譜（又叫質譜法）是一種與光譜并列的譜學方法，通常意義上是指廣泛應用于各個學科領域中通過制備、分離、檢測氣相離子來鑒定化合物的一種專門技術。質譜分析是一種測量離子荷質比（電荷-質量比）的分析方法，其基本原理是使試樣中各組分在離子源中發(fā)生電離，生成不同荷質比的帶

3、正電荷的離子，經(jīng)加速電場的作用，形成離子束，進入質量分析器。在質量分析器中，再利用電場和磁場使發(fā)生相反的速度色散，將它們分別聚焦而得到質譜圖，從而確定其質量。n 7，分子離子峰：子受電子束轟擊后失去一個電子而生成的離子M+成為分子離子。在質譜圖中，由M+所形成的峰稱為分子離子峰。7.碎片離子峰 當電子轟擊的能量超過分子離子電離所需要的能量（5070eV）時，可能使分子離子的化學鍵進一步斷裂，產生質量數(shù)較低的碎片，稱為碎片離子。在質譜圖上出現(xiàn)相應的峰，稱為碎片離子峰。碎片離子峰在質譜圖上位于分子離子峰的左側。研究最大豐度的離子斷裂過程，能提供被分析化合物的結構信息。8.軟電離技術 在質譜分析中，

4、離子源是將分子離解成離子或解離成碎片，在這里分子失去電子，生成帶正電荷的分子離子。分子離子可進一步裂解，生成質量更小的碎片離子。由于離子化所需要的能量隨分子不同差異很大，因此，對于不同的分子應選擇不同的離解方法。通常稱能給樣品較大能量的電離方法為硬電離方法，而給樣品較小能量的電離方法為軟電離方法，后一種方法適用于易破裂或易電離的樣品。9.源內衰變技術（insource-decay，ISD）源內衰變發(fā)生在離子源區(qū)域內，時間為激光撞擊之后幾百納秒之內，是離子的“即可片段化”。這些片段離子通過衰減離子取出，能在線性飛行時間質譜中被發(fā)現(xiàn)，許多蛋白質和大的肽常在MOLDI-TOF-MS的離子源區(qū)域內變成

5、肽離子片段。主要產生含N端的b型和含C端的y型片段離子，通過分析這些片段離子譜可鑒定蛋白質。10.肽質量指紋圖譜 是指蛋白質被酶切位點專一的蛋白酶水解后得到的肽片段質量圖譜。由于每種蛋白質的氨基酸序列都不同，蛋白質被酶水解后，產生的肽片段序列也各不相同，其肽混合物質量數(shù)據(jù)也具特征性，這種特征就像指紋一樣，所以稱為指紋譜。肽質量指紋圖譜可用于蛋白質的鑒定，用實驗測得的PMF與蛋白數(shù)據(jù)庫中的蛋白質理論PMF比對，就可以鑒定該蛋白質肽序列標簽是由一個多肽的部分氨基酸序列和該肽的質量以及該肽未測序部分的質量等組成。11.生物質譜就是運用現(xiàn)代質譜儀器解決生物學問題，如蛋白質測序，生物大分子分子量檢測，磷

6、酸化位點檢測等生物質譜：主要用于小分子物質研究的質譜技術。它們具有高靈敏度和高質量檢測范圍。12. 基質輔助激光解吸電離（matrix assisted laser desorption ionization, MALDI）在波長為7751250 nm 的真空紫外光輻射下產生光致電離和解吸作用，從而獲得分子離子和含有結構信息的碎片，同時引入基質減少過分碎裂?；|輔助激光解吸電離技術適于結構復雜、不易汽化的大分子。一般采用固體基質，基質與樣品比為10000：1。根據(jù)分析物不同而使用不同的基質和波長電噴霧電離（Electrospray Ionizsation,ESI ） 利用強靜電場從溶液直接產生

7、氣態(tài)離子化分子的一種方法采用強靜電場（35kV），以噴霧形式使液體樣品形成高度荷電的霧狀小液滴，小液滴經(jīng)過反復的溶劑揮發(fā)-液滴分裂后，產生單個帶多電荷的離子，即在電離過程中，產生多種質子化離子。13. 蛋白質芯片是一種高通量的蛋白功能分析技術，可用于蛋白質表達譜分析，研究蛋白質與蛋白質的相互作用，甚至DNA蛋白質、RNA蛋白質的相互作用，篩選藥物作用的蛋白靶點等。15.亞細胞蛋白質組學內涵 針對細胞內不同區(qū)域結構功能單位的蛋白質組學研究。細胞內成分根據(jù)空間結構、分布及功能不同，分成不同細胞器或細胞區(qū)域，如細胞膜、胞漿、線粒體、溶酶體、過氧化物酶體、內質網(wǎng)、高爾基體和細胞核等。另外，細胞器內一些

8、功能單位多是大分子結構體或多蛋白復合體，如核基質、剪接體、紡錘體、核孔結構以及核糖體等。16.2D雙向電泳（two-dimensional electrophoresis）是等電聚焦電泳和SDS-PAGE的組合，即先進行等電聚焦電泳（按照pI分離），然后再進行SDS-PAGE（按照分子大?。?jīng)染色得到的電泳圖是個二維分布的蛋白質圖。二，簡答題 1. 質譜儀結構由7部分組成：進樣系統(tǒng)、離子源室、質量分析器、檢測器、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、真空系統(tǒng)和供電系統(tǒng)。其中離子源室、質量分析器、檢測器必須處于高真空狀態(tài)，離子源要求10-410-5Pa, 質量分析器要求10-6Pa，以降低背景以及減少離子間或離子與分

9、子的碰撞。進樣系統(tǒng)：把樣品從室內常壓轉移到離子源。離子源室：把品分子轉換成樣品離子。（品離子是帶有電荷的樣品分子。最簡單的形成樣品離子的方法就是從中行分子里移除一個電子，這樣就形成了正離子。樣品分子必須變成樣品離子才能被質譜所分析。）   在質量分析器里，電場或者磁場，或者兩者都有的分析器，被用來控制樣品離子的運動，這樣便可根據(jù)其質量不同而將其分離。雖然有很多不同的質量分析器，但是都執(zhí)行相同的功能：根據(jù)質量分離不同的離子。   檢測器可以感知已經(jīng)被分離的離子的到達，放大極其微小的離子的電流以便進一步的電子處理。雖有很不不同類型的檢測器，但作用都一樣，就是

10、檢測離子并將其轉換成較強的電信號。   記錄儀接受檢測器的信號，將其放大并記錄，這樣就得到了質譜圖。質譜要在真空系統(tǒng)運行。減少空氣中成分的干擾。常真空度的范圍是室內常壓的百萬分之一或者十億分之一。離子源，質量分析器和檢測器在真空系統(tǒng)里。2.質譜肽譜分析通過測定肽和蛋白質的分子質量，加上已知蛋白和DNA序列的信息，來試探性的確認給定組織或體液中存在的肽和蛋白質。質譜肽譜分析分4步：（1）從生物組織提取多肽和蛋白質并分餾提取液（2）測定提取液中各組分的分子質量（3）從肽或蛋白質的計算機庫中搜索被測的分子質量是否符合特定的肽或蛋白質的質量；（4）再確認分析，如部分N端或C端的測序

11、分析、氨基酸分析或串聯(lián)質譜分析，這些再確認分析的對象應是那些在（1）（3）步中仍不能十分確認的特定肽或蛋白質3.ESI特點是產生多電荷離子而不是碎片離子，使質量電荷比（m/z）降低到多數(shù)質量分析儀器都可以檢測的范圍，因而大大擴展了分子量的分析范圍，離子的真實分子質量也可以根據(jù)質荷比及電荷數(shù)算出。目前可檢測分子質量100 000Da以下的蛋白質，最高可達150 000Da。優(yōu)勢就是它可以方便地與多種分離技術聯(lián)合使用，如液一質聯(lián)用（LCMS）是將液相色譜與質譜聯(lián)合而達到檢測大分子物質的目MALDLI 特點1.MALDAI 源使用的激光是脈沖式，每一脈沖激光產生的離子都先經(jīng)過一加速電場而獲得動能，然

12、后再進入一個高真空無電場飛行管道，離子在此無電場飛行管道內以在加速電場獲得的速度勻速飛行。離子越小，飛行速度越快。每一脈沖激光產生一批離子得到一張質譜圖，一般使用的是多次脈沖激光掃描質譜峰結果的累加。2.所產生的質譜圖多為單電荷離子，因而質譜圖中的譜峰與樣品各組分的質量數(shù)有一一對應關系。最適于分析多肽和蛋白質混合物，蛋白質序列分析，制作太指紋圖譜，測量化合物分子量等，在基因領域的研究也可以應用于DNA序列測定、DNA點突變、遺傳病診斷等。3.MALDAI 源的離子化程度非常高，是靈敏度最高的質譜儀，能對極微量的樣品（fmol-amol)進行分析的。4.基本原理是將分析物分散在基質分子（尼古丁酸

13、中及其同系物）并形成晶體，當用激光（337nm 氮激光）照射晶體時，基質分子吸收激光能量，又以熱的形式將能量釋放，樣品解吸附，同時基質晶體升華，基質和樣品分子氣化進入質譜儀的氣相?；|-樣品間發(fā)生電荷轉移使樣品分子電離。 5. 基本原理 主要利用物質在流動相與固定相之間的分配系數(shù)差異來實現(xiàn)分離。 6.1.雙向磷酸多肽圖譜 2.高分辨率凝膠電泳 3.固相金屬親和色譜4.反相高效液相色譜 5.毛細管電泳6.免疫沉淀7.化學修飾法 8.另外一種修飾手段，不僅可以用來研究磷酸化絲氨酸肽段和磷酸化蘇氨酸肽段，還可以研究磷酸化酪氨酸肽段。這方法的顯著特點是：通過碳化二乙胺的催化作用將胱氨酸加到磷酸基團上，

14、再通過巰基乙胺與碘乙酰樹脂柱的共價結合使磷酸化肽得以純化。但肽的N端首先用叔丁氧羰基保護；C端進行酰胺化保護，以免復雜反應產生。磷酸肽的洗脫是通過三氟乙酸切割氨基磷酸鍵完成的。碳化二乙胺方法在質譜分析前，需要多步化學反應和柱純化過程，所以可能會有大量的樣品丟失，而且這種方法只適用于磷酸肽的富集，目前還沒有應用于磷酸化蛋白質的富集 7.原理:質譜是很好的蛋白質鑒定工具，但不同的蛋白質或多肽在質譜中有不同的離子化效率，所以不能從質譜圖中對蛋白質進行定量分析。以穩(wěn)定同位素為內標，將物理化學性質相同、質量不同的同位素摻入兩種樣品，混合后不同狀態(tài)的相同蛋白質因質量差異在質譜圖中表現(xiàn)為一對峰，通過比較質譜

15、峰強弱，精確定位出蛋白質不同狀態(tài)下表達量的變化。這就是基于穩(wěn)定同位素標簽和液相色譜與串聯(lián)質譜聯(lián)用技術定量和鑒定蛋白質的理論依據(jù)。 8.線粒體的分離純化基本原則：先制備組織或細胞勻漿，然后進行差速離心，低速去除細胞核及細胞碎片；高速離心分離線粒體，有必要還可進行密度梯度離心。組織細胞的特異性及所要線粒體的實驗用途決定了方法的細節(jié)。這些細節(jié)包括：勻漿器的選擇、緩沖液的成分、許可混雜其他細胞器的程度等。通常用Ficoll、Percoll、碘化介質（OptiPrep, Nycodenz, metrizamide）和蔗糖來形成密度梯度進一步純化線粒體v 純度鑒定：分離線粒體時可能混雜其他細胞器，線粒體的

16、相對純度可以通過檢測線粒體或其他可能存在的細胞器的標志酶來確定。線粒體純度最好的方法之一是測定幾種標志酶的活性。一方面可檢測所分離的線粒體是否保留了其生物學功能，另方面檢測其他細胞器污染程度如微粒體、溶酶體等。線粒體組分還可以通過電子顯微鏡檢查。v 9.1. 富集低豐度蛋白質，完善全細胞蛋白質組2. 提供蛋白質的亞細胞定位信息3. 加深對亞細胞組分的結構功能理解4. 加深對細胞生理分子機制的理解5. 亞細胞蛋白質組的差異表達譜v 10.1. 細胞器的蛋白質組學研究2. 大分子結構體和多蛋白復合物的蛋白質組學研究3. 酵母的亞細胞蛋白質組學研究4.核蛋白質組的研究11， 蛋白質組學研究任務研究目

17、的􀂙分離蛋白，顯示差異，將表現(xiàn)型與功能聯(lián)系起來；􀂙尋找蛋白質之間的相互作用，動態(tài)地反映生物體所處的狀態(tài)。12，相互作用網(wǎng)絡的研究技術等樣品"樣品制備"樣品分離"蛋白質點提取鑒定"功能確定"生物信息學"圖像分析13，1）蛋白質組樣品制備基本原則􀂙盡可能提高樣品溶解度，抽提最大量的總蛋白，減少蛋白質的損失􀂙解除蛋白質之間以及與其它生物大分子的相互作用，使蛋白質完全處于變性狀態(tài)和還原狀態(tài)􀂙減少對蛋白質以及蛋白質組的人為修飾（假點）􀂙總

18、之：盡可能簡單，減少步驟v 14.一、樣品制備的前控制v 1. 染色方法的選擇v 采用雙向電泳等方法純化蛋白質，往往需要染色后才能準確獲得用于分析鑒定的樣品。染色方法與蛋白質分析的靈敏度高度相關，染色效果十分重要。v 2. 污染的控制(角蛋白)在蛋白質組學分析中，常見a-角蛋白的污染，主要來自實驗人員的皮膚屑和頭皮屑。也有b-角蛋白的污染，來自實驗人員穿著的毛衣。v 2）鹽分和去污劑v 在進行質譜分析前，應特別注意樣品中鹽分和去污劑等含量對質譜分析的影響。MALDI-MS分析技術可以耐受一定量的小分子雜質和鹽類物質，但樣品中含有表面活性劑或其他難溶鹽分，則很難產生好的結晶。v 二.樣品的制備v

19、 操作步驟及注意事項：v （1）切膠和脫色v 切膠前用ddH2O洗膠2次，每次15min.v 用干凈的刀片從膠上切取蛋白點，將膠塊切成1mm3大小，放入200ml Eppendorf管內。切膠時盡量不要超出蛋白點的范圍，膠塊的大小要適當。膠塊太小在以后的抽取步驟中可能被吸掉, 太大不利于脫色、酶切、抽取等步驟。v 1）考馬斯亮藍染色凝膠的脫色v 用50% 乙腈/25mM NH4HCO3 脫至背景無色（也有用50%甲醇）v 2）銀染凝膠的脫色v 30 mM 鐵氰化鉀與100mM 硫代硫酸鈉用前1：1混合。脫至無淡黃色溶液產生，吸去溶液，加ddH2O 沖洗。v 脫色后的膠塊用100%乙腈脫水后，真

20、空離心干燥2030min15，一、微量凱氏（Kjeldahl）定氮法含氮有機物與濃硫酸共熱,即分解產生氨（消化），氨又與硫酸作用，變成硫酸銨。經(jīng)強堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液被中和的程度可計算得樣品之氮含量。若以甘氨酸為例，其反應式如下：H2NCH2COOH+ 3H2SO4 ? 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)2NH3 + H2SO4 ? (NH4)2SO4 (2)(NH4)2SO4 + 2NaOH ? 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3)為了加速消化，可以加入CuSO4作催化劑，K2SO4以提高溶液的沸點。收集氨可用硼酸溶液，滴定則用強

21、酸。計算所得結果為樣品總氮量，如欲求得樣品中蛋白含量，應將總氮量減去非蛋白氮即得。如欲進一步求得樣品中蛋白質的含量，即用樣品中蛋白氮乘以6.25即得。二、雙縮脲法（Biuret法）蛋白質含有兩個以上的肽鍵，因此有雙縮脲反應。在堿性溶液中，蛋白質與Cu2+形成紫色絡合物，此紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質含量成正比，而與蛋白質的相對分子量及氨基酸成分無關，故可用來測定蛋白質含量。測定范圍為110ug蛋白質。,三Folin酚試劑法（Lowry法）這種蛋白質測定法是最靈敏的方法之一。過去此法是應用最廣泛的一種方法，由于其試劑配制較為困難，近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的

22、，只是加入了第二種試劑，即Folin酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質的靈敏度。四、紫外吸收法由于蛋白質分子中，酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質具有吸收紫外光的性質。吸收高峰在280nm處，其吸光度與蛋白質含量成正比，可用作定量測定。五、考馬斯亮蘭法（Bradford法）考馬斯亮藍G250是一種染料，在游離狀態(tài)下呈紅色，當它與蛋白質結合后變?yōu)榍嗌?。蛋白質含量在01000g范圍內，蛋白質一色素結合物在 595nm下的吸光度與蛋白質含量成正比，故可用比色法測定。16，二維凝膠電泳基本原理􀂙第一向是等電聚焦，根據(jù)蛋白質等電點(pI)不同的分離𙦨

23、9;第二向是SDS-PAGE，根據(jù)蛋白質分子量不同的分離。􀂙一般采用垂直電泳或水平電泳，兩者差別不大，均適于分子量10-150kd的蛋白質。17，二維凝膠電泳圖像分析主要步驟包括圖像掃描、斑點檢測、背景消減、斑點配比和數(shù)據(jù)庫構建。18，作用原理 聚丙烯酰胺凝膠為網(wǎng)狀結構，具有分子篩效應。它有兩種形式：非變性聚丙烯酰胺凝膠及SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）；非變性聚丙烯酰胺凝膠，在電泳的過程中，蛋白質能夠保持完整狀態(tài)，并依據(jù)蛋白質的分子量大小、蛋白質的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。SDS是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內和分子間的氫鍵，使分

24、子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級結構。而強還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側鏈和SDS結合成蛋白- SDS膠束，所帶的負電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結構差異。20SWISS-PROT是經(jīng)過注釋的蛋白質序列數(shù)據(jù)庫，由歐洲生物信息學研究所(EBI)維護。數(shù)據(jù)庫由蛋白質序列條目構成，每個條目包含蛋白質序列、引用文獻信息、分類學信息、注釋等，注釋中包括蛋白質的功能、轉錄后修飾、特殊位點和區(qū)域、二級結構、四級結構、與其它序列的相似性、序列殘缺與疾病的關系、序列變異體和沖

25、突等信息。SWISS-PROT中盡可能減少了冗余序列，并與其它30多個數(shù)據(jù)建立了交叉引用，其中包括核酸序列庫、蛋白質序列庫和蛋白質結構庫等。利用序列提取系統(tǒng)(SRS)可以方便地檢索SWISS-PROT和其它EBI的數(shù)據(jù)庫。SWISS-PROT只接受直接測序獲得的蛋白質序列，序列提交可以在其Web頁面上完成。 完整的GenBank數(shù)據(jù)庫包括序列文件，索引文件以及其它有關文件。索引文件是根據(jù)數(shù)據(jù)庫中作者、參考文獻等建立的，用于數(shù)據(jù)庫查詢。GenPept是由GenBank中的核酸序列翻譯而得到的蛋白質序列數(shù)據(jù)庫，其數(shù)據(jù)格式為FastA。GenBank中最常用的是序列文件。序列文件的基本單位

26、是序列條目，包括核苷酸堿基排列順序和注釋兩部分。三，論述題1，(1) 酵母雙雜交技術酵母雙雜交系統(tǒng)的建立是基于對真核生物調控轉錄起始過程的認識。細胞起始基因轉錄需要有反式轉錄激活因子的參與。反式轉錄激活因子，例如酵母轉錄因子GAL4在結構上是組件式的（modular），往往由兩個或兩個以上結構上可以分開，功能上相互獨立的結構域（domain）構成，其中有DNA結合功能域(DNA binding domain,DNA-BD)和轉錄激活結構域（activation domain，DNA-AD）。這兩個結構域將它們分開時仍分別具有功能，但不能激活轉錄，只有當被分開的兩者通過適當?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近

27、時，才能重新呈現(xiàn)完整的GAL4轉錄因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的下游啟動子，使啟動子下游基因得到轉錄。根據(jù)這個特性，將編碼DNA-BD的基因與已知蛋白質Bait protein的基因構建在同一個表達載體上，在酵母中表達兩者的融合蛋白BD-Bait protein。將編碼AD的基因和cDNA文庫的基因構建在AD-LIBRARY表達載體上。同時將上述兩種載體轉化改造后的酵母，這種改造后的酵母細胞的基因組中既不能產生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏這些營養(yǎng)的培養(yǎng)基上無法正常生長。當上述兩種載體

28、所表達的融合蛋白能夠相互作用時，功能重建的反式作用因子能夠激活酵母基因組中的報告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，從而通過功能互補和顯色反應篩選到陽性菌落。將陽性反應的酵母菌株中的AD-LIBRARY載體提取分離出來，從而對載體中插入的文庫基因進行測序和分析工作。酵母雙雜交的優(yōu)點§ 快速獲得相互作用蛋白的基因§ 只需單一步驟的質粒構建§ 在體內鑒定蛋白的相互作用§ 弱小的，暫時的相互作用也能鑒定§ 能在整個時間段積聚弱小的相互作用信號缺點§ 假陽性是酵母雙雜交系統(tǒng)的最大問題§ 假陽性通常由以下原因造成:1. prey蛋

29、白的非特異性結合2. 無需與誘餌蛋白結合就能誘導報告基因的轉錄（這是大多數(shù)假陽性的誘因）（2）噬菌體展示技術噬菌體展示技術是在深刻理解噬菌體遺傳學和生理學特性的基礎上產生的。 其原理是將蛋白質文庫整合到一個簡單的噬菌體顆粒中，利用目的蛋白質與特異配基的親和力，篩選和配基特異結合的蛋白質。噬菌體展示技術一般要經(jīng)過多輪的篩選，這樣就可以得到在文庫中含量很低的與配基特異作用的蛋白質。優(yōu)點v 1. 高度選擇性v 2. 可以構建大的噬菌體文庫（1091010），親和純化可在高濃度下進行（大于103噬菌體/ml）v 3. 通過改變洗脫步驟的嚴格性，來評價融合蛋白結合的特異性。v 缺點：1. 多價展示對于肽

30、段大小的限制2. 蛋白質能被細菌分泌3. 體外實驗，蛋白質在細菌內無法正確折疊4.融合蛋白會影響蛋白本身的活性 (3)蛋白質親和層析（Pull-down)在一定的條件下，某種蛋白質共價連接在基質如瓊脂糖上，用以結合抽提物中能與該蛋白結合的配體蛋白。先用低鹽溶液洗脫下未結合的蛋白質，再用高鹽溶液或SDS洗脫下結合在柱子上的蛋白質。蛋白質需要純化，通常簡單方法是構建融合蛋白，常用的谷胱甘肽S轉移酶（GST)，可用谷胱甘肽-瓊脂糖柱純化；Staphylococcus 蛋白A在IgG柱上純化；含His6-Tag的肽段在鎳柱上純化；麥芽糖結合蛋白可在含直鏈淀粉的柱子上純化。優(yōu)點:(1)靈敏度高，在高濃度

31、固定蛋白質條件下可檢測微弱的相互作用（結合常數(shù)：10-5mol/L, 生理上相關的最微弱的相互作用在10-3mol/L)(2) 可以同時檢測抽提物中所有的蛋白，它們結合機會均等(3) 通過構建突變體，可以檢測與特異性相互作用有關的蛋白質結構域或關鍵的氨基酸殘基(4) 檢測多亞基蛋白質間的相互作用假陽性：（1）電荷間的相互作用使蛋白質與檢測蛋白質結合，可以利用帶相同電荷的對照柱來消除（2）通過B蛋白，A蛋白與檢測蛋白間接結合（3）兩種蛋白質的細胞定位不同，但在認為條件下，卻能高特異性結合。(4)免疫共沉淀原理: 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性

32、作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。 其原理是：當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內存在的許多蛋白質蛋白質間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質x的抗體免疫沉淀x，那么與x在體內結合的蛋白質y也能沉淀下來。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質是否在體內結合；也可用于確定一種特定蛋白質的新的作用搭檔。優(yōu)點（1）檢測細胞裂解原液中所有蛋白質與檢測蛋白質的相互作用（2）抗原、抗體相互作用是在生理濃度下被檢測的，可排除過量表達帶來的假陽性。（3）可檢測到體內形成的天然復合體（4）天然蛋白質如果經(jīng)過翻譯后修飾，可以檢測到依賴于或不依賴于修飾

33、的蛋白質相互作用缺點：（1）有時免疫共沉淀的蛋白質并非直接相互作用（2）靈敏度不高：抗原濃度低(5)化學交聯(lián)法如果兩種或兩種以上蛋白彼此間存在特異性的親和性并在生物體內可以形成復合物，可以用該法研究這種相互作用，尤其是瞬時相互作用。使用一種交聯(lián)試劑，并且在交聯(lián)試劑的光激活部分帶有標記，將該試劑共價耦聯(lián)到一蛋白質上，耦聯(lián)物與抽提物一起溫育。若抽提物中的A 蛋白能與耦聯(lián)蛋白質發(fā)生相互作用，光激活后交聯(lián)劑的一部分就結合到A 蛋白上。加入還原劑，切割交聯(lián)試劑，使A 蛋白帶有交聯(lián)劑上有標記的部分，然后通過凝膠電泳等方法分析該蛋白。優(yōu)點：（1）能檢測微弱的相互作用（2）能檢測到動態(tài)過程不同發(fā)育階段與不同蛋

34、白質的瞬時相互作用（3）通過能穿膜的交聯(lián)劑。交聯(lián)可在體內進行缺點：沒有選擇性2，熒光雙向差異凝膠電泳 一般將能在可見光范圍內強烈吸收和輻射出熒光的染料稱為熒光染料。熒光染料實質上是顆粒很細的熒光染料的樹脂固體溶液，這些染料有特定的電子共軌體系。熒光雙向差異凝膠電泳是在雙向電泳的基礎上出現(xiàn)的技術，將待比較的蛋白質樣品經(jīng)不同的熒光染料標記后，等量混合進行雙向電泳。 因熒光染料靈敏度高，所需樣品量非常少，每次只需50ug.一張膠可同時分析3個樣品，省去了不同膠圖之間的匹配問題，節(jié)約時間，重復性提高。 還可以對大樣本量進行統(tǒng)計分析，需在每張膠中加入由所有樣品等量混合而成的內標，以確保各張膠之間對比的準

35、確性，以最大限度反映生物學改變而不是系統(tǒng)改變。由于所需的膠數(shù)減少，分析通量得到了提高。（2）細胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標簽技術（stable isotope labeling with amino acids in cell culture,SILAC）培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標簽技術，是通過細胞的正常生長代謝，把穩(wěn)定同位素標記的氨基酸引入到蛋白質組成中，質譜分析質量相差6u。這可以大大簡化質譜定量分析前人工處理的復雜度。目前，可用在培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標簽技術上的穩(wěn)定同位素主要包括：2H、13C、15N等。除了在定量比較蛋白質組研究方面發(fā)揮作用外，在生化代謝、信號通路以及蛋白質間相互作用動力學研究

36、等方面也有巨大的潛力。缺點：只能用在基于培養(yǎng)的細胞體系以及單細胞生物上。1.同位素標記親和標簽技術的原理 同位素標記親和標簽試劑由3部分組成：試劑與蛋白質反應的基團，這個基團特異結合肽鏈中半胱氨酸殘基的巰基；中間的連接子，可以結合穩(wěn)定的同位素；親和標簽-生物素，可以和卵白素結合，選擇分離同位素標記親和標簽標記的多肽。由8個氘原子與8個氫原子分別ICAT質量正好相差8u。（1）優(yōu)點 兼容任何生長條件下的組織中的蛋白質，比較兩種或更多種來源密切相關的蛋白質樣品，可以得到不同狀態(tài)下蛋白質表達量的變化比例。烷基化反應高度特異。只分離含有半胱氨酸的肽段，降低了體系的復雜性。因為分離是在肽段水平上進行的，

37、所以膜蛋白溶解性的問題得到解決，可以對膜蛋白進行鑒定和定量。因為同位素標記親和標簽技術建立在色譜分離的基礎上，任何促進蛋白質溶解的試劑均可使用。能夠直接鑒定和測量低豐度蛋白質。 （2）缺點 這一方法無法分析不含半胱氨酸的蛋白質；同位素標記親和標簽標記（-500u）在整個質譜分析過程中保留在每個肽上，會影響肽段的檢測和增加數(shù)據(jù)庫搜索算法的復雜性，對一些小的片段（小于7個氨基酸殘基）更是如此，而對其二級質譜碎片離子解析增加了難度；被標記的2個多肽質量相差8u、含有2個半胱氨酸的多肽質量相差16u時與氧化很難區(qū)分，對定量和鑒定都帶來困難；一般同位素標記親和標簽定量的誤差在20%以內，但如果樣品成分復雜，定量誤差會增大，并往往需要手工檢測結果；這種方法要獲得完整的信息，最重要的是標記必