酸奶微生物檢驗

1、酸奶衛(wèi)生標準 編號：GB 193022010一、 準備內容：1、無菌器材準備表：儀器名稱數(shù)量平板培養(yǎng)皿121ml移液管510ml移液管1玻璃棒1試管25燒杯3錐形瓶32、培養(yǎng)基、試劑準備表：名稱體積（ml）BPW225LST100BGLB100氯化鈉肉湯225B-P瓊脂平板50平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基150生理鹽水225、100備注：無菌生理鹽水氯化鈉 2. 5g 蒸餾水300ml平板計數(shù)瓊脂有現(xiàn)成的培養(yǎng)基，直接稱取即可，配制120ml月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯胰蛋白胨或胰酪胨 2.0g氯化鈉 0.5 g乳糖 0.5 g磷酸氫二鉀（K2HPO4） 0.275 g磷酸二氫鉀（KH2PO4） 0

2、.275g月桂基硫酸鈉 0.01 g蒸餾水 100 mL將各成分加入蒸餾水中，攪混均勻，靜置約10 min，煮沸溶解，調節(jié)pH，高壓滅菌121 ，15min?；途G乳糖膽鹽（BGLB）肉湯蛋白胨 1 g乳糖 1.0 g牛膽粉（oxgall或oxbile）溶液 20 mL0.1%煌綠水溶液 1.33 mL蒸餾水 80mLpH 7.2±0.1 制法將蛋白胨、乳糖溶于約50mL蒸餾水中，加入牛膽粉溶液20 mL（將2.0 g脫水牛膽粉溶于20 mL蒸餾水中，調節(jié)pH至7.07.5），用蒸餾水稀釋到975 mL，調節(jié)pH，再加入0.1%煌綠水溶液1.33 mL，用蒸餾水補足到1 00mL，用棉

3、花過濾后，分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10 mL。121 高壓滅菌15 min。7.5%氯化鈉肉湯蛋白胨 2.25g牛肉膏 1.125g氯化鈉 16.875 g蒸餾水 225mLpH 7.4將上述成分加熱溶解，調節(jié)pH，分裝，每瓶225 mL，121 高壓滅菌15 min。 BairdParker瓊脂平板胰蛋白胨 0.5g牛肉膏 0.25 g酵母膏 0.05g丙酮酸鈉 0.5g甘氨酸 0.6g氯化鋰（LiCl·6H2O） 0.25g瓊脂 1.0 g蒸餾水 47.5mLpH 7.0±0.2增菌劑的配法30%卵黃鹽水50 mL 與經(jīng)過除菌過濾的1%亞碲酸鉀溶液10 mL 混

4、合，保存于冰箱內。A.4.3 制法將各成分加到蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，調節(jié)pH。121 高壓滅菌15 min。臨用時加熱溶化瓊脂，冷至50 ，每95 mL 加入預熱至50 的卵黃亞碲酸鉀增菌劑5 mL 搖勻后傾注平板。培養(yǎng)基應是致密不透明的。使用前在冰箱儲存不得超過48 h。二、 指標表3 微生物限量項目采樣方案a及限量（若非制定，均以CFU/g或CFU/ml表示）檢測方法ncmM菌落總數(shù)5210000100000GB4789.2大腸菌群5210100GB4789.3MPN計數(shù)法沙門氏菌500/25g(ml)-GB4789.4金黃色葡萄球菌5110100GB4789.10定性檢驗霉菌90

5、GB4789.15A：樣品的分析及處理按GB4789.1和GB4789.18執(zhí)行。B：不適用于以發(fā)酵稀奶油為原料的產品。表4 乳酸菌數(shù)項 目 限量CFU/g(mL) 檢驗方法乳酸菌數(shù)a 1×106 GB 4789.35a 發(fā)酵后經(jīng)熱處理的產品對乳酸菌數(shù)不作要求。三、 樣品來源：四、 時間安排表菌落總數(shù)大腸桿菌霉菌和酵母菌金黃色葡萄球菌沙門氏菌乳酸菌第1天無菌器材準備配置PCA無菌器材準備配置LST無菌器材準備配置孟加拉紅無菌器材準備配置樣液無菌器材準備BPW無菌器材配置MRS平板第2天配置樣液制平板接種LST配置BGLB配置樣品液制平板劃線接種到BairdParker氏培養(yǎng)基和血平板

6、配置樣液制BS和XLD平板第3天培養(yǎng)（36）觀察LST產氣情況，有產氣的接種BGLB培養(yǎng)(28)革蘭氏染色鏡檢劃線接種到BS和XLD平板第4天菌落計數(shù)觀察BGLB菌落計數(shù)觀察XLD平板第5天報告查MPN表報告報告報告觀察BS平板五、 樣品配置及器材準備無菌器材樣品液培養(yǎng)皿試管移液管1ml*3/10ml*1;錐形瓶500ml*1/250ml*1;燒杯*1稀釋度配置菌落總數(shù)921 2 3 25g(ml)樣品+225ml7.5%的生理鹽水大腸菌數(shù)101 2 3 霉菌和酵母菌921 2 3 金黃色葡萄菌屬沙門氏菌乳酸菌六、 實驗內容（1） 菌落總數(shù)操作步驟1、樣品的稀釋1.1 液體樣品：稱取25 g樣

7、品置盛有225 mL生理鹽水的無菌錐形瓶，搖勻，制成1:10 的樣品勻液。1.3 用1 mL 無菌吸管吸取1:10 樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注于盛有9 mL 稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1 支無菌吸管反復吹打使其混合均勻，制成1:100 的樣品勻液。1.4 另取1 mL 無菌吸管，按上述操作程序，制備1:1000稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1 次1 mL 無菌吸管或吸頭。1.5 根據(jù)對樣品污染狀況的估計，選擇2 個3 個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進行10 倍遞增稀釋時，吸取1 mL 樣品勻液于無菌平皿內，及時將涼至46營

8、養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿20mL左右，并混合均勻，每個稀釋度做兩個平皿。同時，分別吸取1 mL 空白稀釋液加入兩個無菌平皿內作空白對照。1.6 及時將15 mL20 mL 冷卻至46 的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（可放置于46 ±1 恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿，并轉動平皿使其混合均勻。2、培養(yǎng)2.1待瓊脂凝固后，將平板翻轉，置于36 ±1 恒溫箱中培養(yǎng)48 h±2 h。3、菌落計數(shù)可用肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應的菌落數(shù)量。菌落計數(shù)以菌落形成單位（colony-forming units，CFU）表示。3.1 選取菌落數(shù)在30 CFU300 CFU

9、 之間、無蔓延菌落生長的平板計數(shù)菌落總數(shù)。低于30 CFU 的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300 CFU 的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數(shù)應采用兩個平板的平均數(shù)。3.2 其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘以2，代表一個平板菌落數(shù)。3.3 當平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計數(shù)。7 結果與報告4、菌落總數(shù)的計算方法4.1 若只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內，計算兩個平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數(shù)，作為

10、每g（mL）樣品中菌落總數(shù)結果。4.2 若有兩個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內時，按公式（1）計算：式中：N樣品中菌落數(shù)；C平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和；n1第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)；n2第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)；d稀釋因子（第一稀釋度）。4.3 若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300 CFU，則對稀釋度最高的平板進行計數(shù)，其他平板可記錄為多不可計，結果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計算。4.4 若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30 CFU，則應按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。4.5 若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，則以小于1 乘以最

11、低稀釋倍數(shù)計算。4.6 若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30 CFU300 CFU 之間，其中一部分小于30 CFU 或大于300CFU 時，則以最接近30 CFU 或300 CFU 的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。5、菌落總數(shù)的報告5.1 菌落數(shù)小于100 CFU 時，按“四舍五入”原則修約，以整數(shù)報告。5.2 菌落數(shù)大于或等于100 CFU 時，第3 位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2 位數(shù)字，后面用0 代替位數(shù)；也可用10 的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。5.3 若所有平板上為蔓延菌落而無法計數(shù)，則報告菌落蔓延。5.4 若空白對照上有菌落生長，則此次檢測結

12、果無效。5.5 稱重取樣以CFU/g 為單位報告，體積取樣以CFU/mL 為單位報告。（2） 大腸菌數(shù)操作步驟操作步驟2.1 樣品的稀釋2.1.1 固體和半固體樣品：稱取25 g 樣品,放入盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質杯內,8000 r/min10000 r/min 均質1 min2 min,或放入盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1 min2 min，制成1:10 的樣品勻液。2.1.2 液體樣品：以無菌吸管吸取25 mL 樣品置盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內預置適當數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成

13、1:10 的樣品勻液。2.1.3 樣品勻液的pH 值應在6.57.5 之間，必要時分別用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 調節(jié)。2.1.4 用1 mL 無菌吸管或微量移液器吸取1:10 樣品勻液1 mL，沿管壁緩緩注入9 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1 支1 mL 無菌吸管反復吹打，使其混合均勻，制成1:100 的樣品勻液。2.1.5 根據(jù)對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1 次，換用1 支1 mL 無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15 m

14、in。2.2 初發(fā)酵試驗每個樣品，選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過1 mL，則用雙料LST肉湯），36±1 培養(yǎng)24 h±2 h，觀察倒管內是否有氣泡產生，24 h±2 h產氣者進行復發(fā)酵試驗，如未產氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48 h±2 h，產氣者進行復發(fā)酵試驗。未產氣者為大腸菌群陰性。2.3 復發(fā)酵試驗用接種環(huán)從產氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）管中，36 ±1培養(yǎng)48 h±2 h，觀察產氣情況。

15、產氣者，計為大腸菌群陽性管。2.4 大腸菌群最可能數(shù)（MPN）的報告按6.3確證的大腸菌群LST陽性管數(shù)，檢索MPN表（見附錄B），報告每g（mL）樣品中大腸菌群的MPN值。（3） 霉菌和酵母菌操作步驟3.1 樣品的稀釋3.1.1 固體和半固體樣品：稱取25 g 樣品至盛有225 mL 滅菌蒸餾水的錐形瓶中，充分振搖，即為1:10稀釋液。或放入盛有225 mL 無菌蒸餾水的均質袋中，用拍擊式均質器拍打2min，制成1:10 的樣品勻液。3.1.2 液體樣品：以無菌吸管吸取25 mL 樣品至盛有225 mL 無菌蒸餾水的錐形瓶（可在瓶內預置適當數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10 的樣品

16、勻液。3.1.3 取1 mL 1:10 稀釋液注入含有9 mL 無菌水的試管中, 另換一支1 mL 無菌吸管反復吹吸,此液為1:100 稀釋液。3.1.4 按5.1.3 操作程序，制備10 倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1 次1 mL 無菌吸管。3.1.5 根據(jù)對樣品污染狀況的估計，選擇2 個3 個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進行10 倍遞增稀釋的同時，每個稀釋度分別吸取1 mL 樣品勻液于2 個無菌平皿內。同時分別取1 mL樣品稀釋液加入2 個無菌平皿作空白對照。 及時將15 mL20 mL 冷卻至46 的馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂或孟加拉紅培養(yǎng)基(可放置于46

17、7;1恒溫水浴箱中保溫)傾注平皿，并轉動平皿使其混合均勻。3.2 培養(yǎng)待瓊脂凝固后，將平板倒置，28±1培養(yǎng)5d，觀察并記錄。3.3 菌落計數(shù)肉眼觀察，必要時可用放大鏡，記錄各稀釋倍數(shù)和相應的霉菌和酵母數(shù)。以菌落形成單位（colonyforming units，CFU）表示。選取菌落數(shù)在10 CFU150 CFU 的平板，根據(jù)菌落形態(tài)分別計數(shù)霉菌和酵母數(shù)。霉菌蔓延生長覆蓋整個平板的可記錄為多不可計。菌落數(shù)應采用兩個平板的平均數(shù)。（4） 金黃色葡萄球菌操作步驟4.1 樣品的處理稱取25 g 樣品至盛有225 mL 7.5 %氯化鈉肉湯或10 %氯化鈉胰酪胨大豆肉湯的無菌均質杯內，800

18、0 r/min10000 r/min 均質1 min2 min，或放入盛有225 mL 7.5 %氯化鈉肉湯或10 %氯化鈉胰酪胨大豆肉湯的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1 min2 min。若樣品為液態(tài)，吸取25 mL 樣品至盛有225 mL 7.5 %氯化鈉肉湯或10 %氯化鈉胰酪胨大豆肉湯的無菌錐形瓶(瓶內可預置適當數(shù)量的無菌玻璃珠)中，振蕩混勻。4.2 增菌和分離培養(yǎng)4.2.1 將上述樣品勻液于36 ±1 培養(yǎng)18 h24 h。金黃色葡萄球菌在7.5%氯化鈉肉湯中呈混濁生長，污染嚴重時在10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯內呈混濁生長。4.2.2 將上述培養(yǎng)物，分別劃線接種到Bair

19、d-Parker 平板和血平板，血平板36 ±1 培養(yǎng)18 h24 h。Baird-Parker 平板36 ±1 培養(yǎng)18 h24 h 或45 h48 h。4.2.3 金黃色葡萄球菌在Baird-Parker 平板上，菌落直徑為2 mm3 mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落有似奶油至樹膠樣的硬度，偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落；但無混濁帶及透明圈。長期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落較大，圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色（有時為白色），菌落周圍可見完全透

20、明溶血圈。挑取上述菌落進行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗。4.3 鑒定4.3.1 染色鏡檢：金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，排列呈葡萄球狀，無芽胞，無莢膜，直徑約為0.5 m1 m。（5） 沙門氏菌 BSXLD(或HE、顯色培養(yǎng)基)挑取可疑菌落TSI,賴氨酸，NA，靛基質，尿素（pH7.2），KCNH2S+靛基質+尿素-KCN-賴氨酸+H2S-靛基質-尿素-KCN-賴氨酸+/-反應結果與左側描述不符生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)+H2S+靛基質-尿素-KCN-賴氨酸+甘露醇+、山梨醇+ONPG-沙門氏菌，血清學試驗非沙門氏菌報告42±1，18h24h36±1，18

21、h24h36±1，40h48h檢樣25g（ml）樣品+225mlBPW1ml+TTB10ml1ml+SC10ml36±1，8h18h36±1，18h24h（6） 乳酸菌6 操作步驟6.1 樣品制備6.1.1 樣品的全部制備過程均應遵循無菌操作程序。6.1.2 冷凍樣品可先使其在2 5 條件下解凍，時間不超過18 h，也可在溫度不超過45 的條件解凍，時間不超過15 min。6.1.3 固體和半固體食品：以無菌操作稱取25 g 樣品，置于裝有225 mL 生理鹽水的無菌均質杯內，于8000 r/min10000 r/min 均質1 min2 min，制成1:10 樣品勻液；或置于225 mL 生理鹽水的無菌均質袋中