分子神經(jīng)生物學(xué)作業(yè)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上分子神經(jīng)生物學(xué)研究方法的名稱，原理和應(yīng)用此方法所達(dá)到的目的21世紀(jì)是生物學(xué)世紀(jì)，生命科學(xué)已成為科學(xué)的前沿，而分子生物學(xué)技術(shù)又是生命科學(xué)中公認(rèn)的一門帶頭學(xué)科。現(xiàn)在，分子生物學(xué)理論和技術(shù)已在生命科學(xué)、醫(yī)藥學(xué)和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，大大推進(jìn)了學(xué)科的發(fā)展。為了進(jìn)一步促進(jìn)分子生物學(xué)技術(shù)在神經(jīng)科學(xué)研究中的應(yīng)用，我們要學(xué)會用研究分子神經(jīng)生物學(xué)的理念和方法。一 1.RNA分析技術(shù)2 熒光定量PCR技術(shù)與應(yīng)用3 外源基因在原核、真核系統(tǒng)中的表達(dá)4 蛋白質(zhì)分析技術(shù)5 基因芯片技術(shù)與應(yīng)用6 細(xì)胞凋亡的檢測與分析7 激光共聚焦顯微鏡的原理和應(yīng)用8 基因診斷與治療9 干細(xì)胞誘導(dǎo)與分化1

2、.RNA分析技術(shù)關(guān)于基因功能研.是一種有效(快捷和成本相對低廉的方法大鼠成纖維細(xì)胞和小鼠細(xì)胞!分別抑制了哺乳動物的!個(gè)不同類型基因!均獲得成功!并重新界定了部分必需基因和非必需基因#現(xiàn)在人們把該技術(shù)與基因芯片等高通量基因篩選技術(shù)相結(jié)合，在基因組水平上篩選成百甚至上千基因!在基因組學(xué)功能研究中發(fā)揮著越來越大的作用!其應(yīng)用前景不亞于QF9 技術(shù)例如!人們選取果蠅基因組中的基因分別作為模板!用包含UO啟動子的序列作為通用引物!通過QF9 進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄形成對胚胎進(jìn)行微注射并進(jìn)行抗體和免疫組織化學(xué)分析!從而在基因組中篩選出果蠅心源性基因。不但應(yīng)用研究了哺乳動物細(xì)胞中某些關(guān)鍵基因的作用!還探索了在基因組水

3、平上的篩選方法他們從人類基因文庫中選出靶基因。每個(gè)基因設(shè)計(jì)兩個(gè)靶序列，應(yīng)用 表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生表達(dá)盒并構(gòu)建 表達(dá)框文庫通過它來高通量篩選:WMG信號途徑中已知的及未知的特有基因從而為疾病治療提供有用信2. 熒光定量PCR技術(shù)與應(yīng)用概述熒光定量PCR是( realtime fluores-cence quantitative PCR，RTFQ PCR) 是1996 年由美國Applied Biosystems 公司推出的一種新定量試驗(yàn)技術(shù)，它是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的可以對產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測樣品模板的初始濃度。 原理PCR擴(kuò)增

4、時(shí)在加入一對引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；剛開始時(shí), 探針結(jié)合在DNA任意一條單鏈上;PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5端3端外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步應(yīng)用領(lǐng)域TL988型儀應(yīng)用領(lǐng)域 臨床疾病診斷：各型肝炎、艾滋病、禽流感、結(jié)核、性病等傳染病診斷和療效評價(jià)；地中海貧血、血友病、性別發(fā)育異常、智力低下綜合癥、胎兒畸形等優(yōu)生優(yōu)育檢

5、測；腫瘤標(biāo)志物及瘤基因檢測實(shí)現(xiàn)腫瘤病診斷；遺傳基因檢測實(shí)現(xiàn)遺傳病診斷。 動物疾病檢測：禽流感、新城疫、口蹄疫、豬瘟、沙門菌、大腸埃希菌、胸膜肺炎放線桿菌、寄生蟲病等、。 食品安全：食源微生物、食品過敏源、轉(zhuǎn)基因、乳品企業(yè)阪崎腸桿菌等檢測。 科學(xué)研究：醫(yī)學(xué)、農(nóng)牧、生物相關(guān)分子生物學(xué)定量研究。 應(yīng)用行業(yè)：各級各類醫(yī)療機(jī)構(gòu)、大學(xué)及研究所、CDC、檢驗(yàn)檢疫局、獸醫(yī)站、食品企業(yè)及乳品廠等。 3 外源基因在原核、真核系統(tǒng)中的表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子能特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞,促進(jìn)其增殖,加速新生血管形成,增加血管通透性。VEGF已成功用于治療肢體及冠狀動脈缺血,對腦缺血性損傷的治療還處于初步研究階段,有研究發(fā)

6、現(xiàn)VEGF除具促血管發(fā)生外,尚有直接的神經(jīng)保護(hù)和促神經(jīng)發(fā)生等作用。但腦內(nèi)直接注射VEGF因子,需反復(fù)給藥、價(jià)格昂貴、且易造成顱內(nèi)感染。直接應(yīng)用攜帶VEGF基因的質(zhì)粒存在表達(dá)不足,而腺病毒又存在安全隱患等問題。本實(shí)驗(yàn)以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白作基因轉(zhuǎn)移報(bào)告物和移植示蹤物,構(gòu)建EGFP-VEGF融合蛋白的真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞,隨后觀測VEGF在該干細(xì)胞中的表達(dá)變化,為進(jìn)一步研究VEGF修飾的NSCs治療缺血性腦損傷奠定基礎(chǔ)4 蛋白質(zhì)分析技術(shù)：技術(shù)和技術(shù)是最近發(fā)展起來的高技術(shù) ,二者的出現(xiàn)使同時(shí)分析的大量的表達(dá)和基因產(chǎn)物及其相互作用網(wǎng)絡(luò)成為可能。它們在神經(jīng)科學(xué)中的應(yīng)用為了解腦功能提供了前

7、所未有的機(jī)會。一個(gè)典型的基因芯片實(shí)驗(yàn)包括 :芯片的準(zhǔn)備或購買、靶和的準(zhǔn)備或、標(biāo)記探針與靶DNA的雜交、芯片掃描和影象的分析。蛋白質(zhì)組技術(shù)較為復(fù)雜 ,包括蛋白質(zhì)分離、鑒定和信息分析三方面的內(nèi)容。其中 ,分離技術(shù)多種多樣。若分離技術(shù)以二維為基礎(chǔ) ,則該實(shí)驗(yàn)通常由以下步驟 :蛋白質(zhì)樣品的準(zhǔn)備、電泳分離、染膠、分離蛋白點(diǎn)的切除、蛋白質(zhì)的酶解 (常用 )、 (鑒定 )和數(shù)據(jù)的信息處理。本文綜述這兩項(xiàng)技術(shù)的內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)步驟 ,然后著重?cái)⑹鏊鼈冊谏窠?jīng)科學(xué)中的應(yīng)用 ,討論其優(yōu)缺點(diǎn)和面臨的挑戰(zhàn) ,展望其發(fā)展前景5 基因芯片技術(shù)與應(yīng)用基因芯片 技術(shù) ,是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針 ,有規(guī)律地排列固

8、定于玻片或者尼龍膜等支持物上 ,然后與待測的標(biāo)記樣品的基因進(jìn)行雜交 ,再通過激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進(jìn)行掃描 ,并配以計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對每一探針上的熒光信號作出檢測和比較 ,從而迅速得出所要信息的一種分子生物學(xué)技術(shù)。上世紀(jì) 90年代初 ,Bains等將短的片段固定到DNA支持物上 ,借助雜交方式進(jìn)行序列的測定。Pease等 (1994 )創(chuàng)造了光導(dǎo)原位合成 高密、微化的寡核苷酸陣列的制作技術(shù) ,為DNA芯片技術(shù)的產(chǎn)生奠定了分子技術(shù)基礎(chǔ)。后來出現(xiàn)的探針固相原位合成技術(shù)與照相平板印刷技術(shù)結(jié)合 ,使合成并固定高密度的數(shù)以萬計(jì)的探針分子成為可能 ;并借助激光共聚焦顯微掃描技術(shù)對雜交信號進(jìn)行實(shí)時(shí)、靈敏、

9、準(zhǔn)確的檢測和分析 ,促使基因芯片技術(shù)由實(shí)驗(yàn)室走向工業(yè)化6 細(xì)胞凋亡的檢測與分析細(xì)胞凋亡是一個(gè)主動的由基因決定的自動結(jié)束生命的過程,對于多細(xì)胞生物個(gè)體發(fā)育的正常進(jìn)行,自穩(wěn)平衡的保持以及抵御外界各種因素的干擾都起著非常關(guān)鍵的作用。細(xì)胞凋亡具有鮮明的形態(tài)學(xué)和生化特征,如細(xì)胞萎縮、染色質(zhì)固縮、凋亡小體形成、細(xì)胞表面形成泡狀或芽狀突起。細(xì)胞凋亡最主要的生化特征是DNA發(fā)生核小體間的斷裂,產(chǎn)生含有不同數(shù)量核小體單位的片段,在進(jìn)行凝膠電泳時(shí),產(chǎn)生特征性的梯形條帶(DNAladder)。其大小為160220bp的整數(shù)倍1。與上述形態(tài)學(xué)及生化特征相對應(yīng),細(xì)胞凋亡常用的檢測方法有細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察法2、瓊脂糖凝膠電泳

10、法1、DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法3、彗星電泳法和流式細(xì)胞分析法4,5。高效毛細(xì)管電泳(CE或HPCE)相對傳統(tǒng)瓊脂糖凝膠電泳具有高效、高速、樣品用量少、易實(shí)現(xiàn)儀器自動化等優(yōu)點(diǎn),已常規(guī)地應(yīng)用于核酸、蛋白質(zhì)、藥物、糖類以及各種其它小分子、離子等的分析7 激光共聚焦顯微鏡的原理和應(yīng)用1定量熒光測定：對活細(xì)胞進(jìn)行定量測定，具有很好的重復(fù)性，分析神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的某些物理及生物化學(xué)特性；監(jiān)測抗原表達(dá)，細(xì)胞結(jié)合和殺傷等特征。在多發(fā)性硬化病人大腦活檢標(biāo)本上觀察病變組織的微血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性地表達(dá)。 2細(xì)胞內(nèi)離子的測定：使用多種熒光探針，對神經(jīng)細(xì)胞的Ca2+、PH及其它各種細(xì)胞內(nèi)離子進(jìn)行定量和動態(tài)分析。 .

11、3 神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察：激光掃描共聚焦顯微鏡使用模擬熒光處理，可將系列光學(xué)切片的數(shù)據(jù)合成三維圖像，并可從任意角度觀察。如Joshi等觀察了細(xì)胞突觸的骨架的三維圖像。三維重建圖像可使神經(jīng)細(xì)胞及細(xì)胞器的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)更加生動逼真。8 基因診斷與治療1995年以前,脊髓性肌萎縮癥(spinal museularat娜by,sMA)的診斷主要依靠病史、臨床表現(xiàn)、肌電圖及肌肉活檢組織化學(xué)染色等。但SMA的臨床變異性大,肌電圖在兒童患者不易配合檢查,肌肉活檢為有創(chuàng)性檢查,令家長難以接受,且需冰凍切片組化染色的條件,更難以在臨床上廣泛開展,即使可以推行,肌電圖和肌肉活檢亦均缺乏特異性,因此本病極易誤診。1995年,玩fevre等克隆到sMA的基因,并發(fā)現(xiàn)98.7%(226/229)的患者存在運(yùn)動神經(jīng)元存活基因l(survival motor neuron以邵nex,sMNI)缺失或中斷,這使得檢測SMNI基因缺失進(jìn)行本病的基因診斷成為可能。發(fā)展至今,基因診斷已成為SMA的主要確診方法,在國內(nèi)外廣泛推行,用于基因診斷的號外顯子缺失,則僅見120娜和招坤兩個(gè)條帶,由技術(shù)和方法也在不斷改進(jìn)與提高9 干細(xì)胞誘導(dǎo)與分化在脊髓受損、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化和脊骨肌萎縮等多種情況下，人體內(nèi)會出現(xiàn)運(yùn)動神經(jīng)細(xì)胞缺失現(xiàn)象。該研究展示了利用多能干細(xì)胞分化的運(yùn)動神經(jīng)細(xì)胞和其祖細(xì)胞