復(fù)方鱉甲軟肝方防治特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化的MMPs表達(dá)

1、復(fù)方鱉甲軟肝方防治特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化的MMPs表達(dá) 作者：段斐，耿德海，張梅，戎瑞雪，王蓓，唐志遠(yuǎn)【摘要】 目的研究復(fù)方鱉甲軟肝方對(duì)特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化防治的MMPs表達(dá)，探討其機(jī)理和療效。方法選SD雄性大鼠180只。隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、陽性藥物對(duì)照組及復(fù)方鱉甲軟肝方高、中、低劑量組，共6組，每組30只。各組分別于7，14，28 d隨機(jī)抽取10只大鼠，麻醉后取肺組織，MMP-2采用原位雜交及RT-PCR的方法測(cè)定。MMP-1和MMP-9采用免疫組化的方法。結(jié)果復(fù)方鱉甲軟肝方組在早期抑制MMP-9在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)上調(diào)，在中晚期抑制MMP-1在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)上調(diào)，說明兩者均有抑制纖維合成的作用。MMP

2、-2的原位雜交和RT-PCR結(jié)果一致，在模型組過度表達(dá)，在藥物組表達(dá)被抑制，表明藥物對(duì)IPF的形成有抑制作用，以中、小劑量組為好。結(jié)論復(fù)方鱉甲軟肝方在早期抑制MMP-9在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)上調(diào)，在中晚期抑制MMP-1在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)上調(diào)，達(dá)到抗纖維化作用；復(fù)方鱉甲軟肝方通過抑制MMP-2表達(dá)發(fā)揮抗纖維化的作用。 【關(guān)鍵詞】 復(fù)方鱉甲軟肝方； 肺間質(zhì)纖維化； 基質(zhì)金屬蛋白酶家族Abstract:ObjectiveTo study the effect of compound prescription witch turtle shell (CPTS) on the expression of MMPS in

3、 rats with IPF (Idiopathic pulmonary interstitial fibrosis) caused by Bleomycin A5.Methods180 male SD rats were randomly divided into six groups:sham operation group, model group, positive medicine groups, high-dosage group, medium-dosage group and low-medium group. After they were given the medicin

4、e, ten rats in each group each time were killed respectively on the 7th day, 14th day and 28th day. MMP-2 was detected by in situ hybridization and RT-PCR, MMP-9 by immunohistochemical method. ResultsCPTS could inhibit expression of MMP-9 in early phase and MMP-1 in middle and late phases. Result of

5、 hybridization in situ of MMP-2 was similar to that of RT-PCR. The effects of medium dose groups and low dose were better. ConclusionCPTS can inhibit the expression of MMP-9 in early phase and MMP-1 in middle and late phases. CPTS has a protective effect on IPF by inhibiting the expression of MMP-9.

6、Key words:Compound Prescription witch turtle shell; IPF; MMPs 細(xì)胞外基質(zhì)（extra cellular matrix , ECM）蛋白與其它類型的蛋白一樣，有合成過程也有降解過程。ECM蛋白翻譯以后的修飾加工過程，以及蛋白質(zhì)的降解過程，都是由酶來催化的，這些蛋白酶類屬于鋅內(nèi)肽酶，因而稱之為基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metal proteinases,MMPs ）。MMPs 來源于多種類型的細(xì)胞，其在ECM（extra cellular matrix ）破壞和降解過程中具有十分重要的作用。本文主要對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶在特發(fā)性肺間質(zhì)纖維

7、化表達(dá)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。1 器材1.1 藥物1.1.1 防治藥物復(fù)方鱉甲軟肝方（內(nèi)蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司生產(chǎn)的復(fù)方中藥干粉，600 g/瓶，批號(hào)：20020501）。高劑量1.4 g·kg-1·d-1、中劑量0.7 g·kg-1·d-1、低劑量藥物為0.35 g·kg-1·d-1。相當(dāng)于臨床日用量（0.1 g·kg-1）的14倍，7倍，3.5倍。1.1.2 陽性對(duì)照藥醋酸強(qiáng)的松0.56 mg(100 g-1·d-1）廣東華南制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)011201。1.1.3 造模藥物注射用鹽酸博萊霉素（bleomycin

8、，BLM-A5），日本化藥株式會(huì)社制造，批號(hào)X12100。1.2 動(dòng)物SD大鼠180只，雄性，體重200220 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物級(jí)別：SPF/VAF，許可證編號(hào)：SCXK2002-0003。飼養(yǎng)于同級(jí)動(dòng)物房，自由飲水。購入后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組。隨機(jī)分為6組:假手術(shù)組、模型組、陽性藥物對(duì)照組及復(fù)方鱉甲軟肝方（以下表格中簡稱鱉甲方組）高、中、低劑量組。每組30只。各組均于7，14，28 d隨機(jī)抽取10只大鼠采血，同時(shí)取肺制成光、電鏡標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥劑量見表1。表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥劑量（略） 陽性藥物組及復(fù)方鱉甲軟肝方高、中、低劑量組藥物均配制成1

9、.5 ml溶液灌注;n=301.3 試劑Trizol Reagent購自Invitrogen公司,M-MLV Reverse Transcriptase ，RT-PCR試劑盒，Trizol液購自Promega公司,Taq DNA聚合酶購自TaKaRa公司,瓊脂糖購自中國科學(xué)院生物物理所生化廠，DNA Marker，DEPC，溴酚藍(lán)，溴化乙錠，購自北京鼎國生物技術(shù)公司。SP-9002，ZLI-9017DAB，SC-7480 Mouse anti-MMP-1， SC-6840 Goat anti-MMP-9購自北京中杉試劑公司分裝Sigma產(chǎn)品。1.4 PCR引物PCR引物(由北京奧科生物技術(shù)有限

10、公司合成),MMP-2 上游：5' TCGTCCATCCATTGAAGC 3'；下游：5' CCCTCGTTATTTGGTGTT 3'；擴(kuò)增長度426 bp。-actin 上游：5'GAACCCTAAGGCCAACCGT 3'；下游：5'TGCCGATAGTGATGACCTGAC 3'， 擴(kuò)增長度325 bp。1.5 儀器BIO-RAD Model 250/2.5電泳儀，美國BIO-RAD公司產(chǎn)品。CHB-100恒溫金屬浴，杭州大和熱磁電子公司產(chǎn)品。PCR擴(kuò)增儀，PTC-100型，美國BIO-RAD公司產(chǎn)品。Sigma-2K15臺(tái)

11、式高速離心機(jī)，美國Sigma公司產(chǎn)品。紫外分光光度儀，199-1100 nm，美國BIO-RAD公司產(chǎn)品。Imagemaster VDS凝膠成像分析儀，美國BIO-RAD公司產(chǎn)品。A1104電子天平，上海分析天平廠產(chǎn)品。低溫冰箱，MDFU5410(-70°C)，成都，泰盟科技有限公司產(chǎn)品。冰凍切片機(jī)，LEICA CM1850型，德國Leica公司產(chǎn)品。2 方法2.1 動(dòng)物分組與模型制備用1.5%戊巴比妥鈉（0.1 ml·kg-1）腹腔注射麻醉后，將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，頸部剪去毛、常規(guī)碘酒與酒精消毒，切開頸正中皮膚，逐層分離，暴露氣管，用一次性1 ml注射器向氣管內(nèi)注入0

12、.3 ml博萊霉素生理鹽水溶液（5 ml·kg-1），然后立即將動(dòng)物直立并旋轉(zhuǎn)，使藥液在肺內(nèi)均勻分布。假手術(shù)組大鼠肺部注入等體積的生理鹽水。2.2 取材方法各種器械用DEPC水處理后高壓滅菌備用。大鼠麻醉后活體取材，開胸后迅速取出一側(cè)肺置于液氮中以備用于MMP-2的原位雜交和RT-PCR檢測(cè)。免疫組化及其余步驟同“2.1”項(xiàng)。2.3 基質(zhì)金屬蛋白酶基因片段的制備2.3.1 引物設(shè)計(jì)根據(jù)已報(bào)道的基質(zhì)金屬蛋白酶基因編碼序列NM 022564，利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物。2.3.2 大鼠肺組織總RNA的提取取液氮速凍的肺組織50 mg，移入盛有1 ml Trizol

13、勻漿器中，室溫下勻漿,使組織完全裂解,室溫下靜置5 min加入0.2 ml氯仿，蓋緊離心管，劇烈振蕩離心管15s4，12 000 r/min，離心10 min取上層水相置于一新的離心管，加入異丙醇0.5 ml·1 ml-1Trizol，輕輕混勻，室溫靜置10 min4，12 000 r/min，離心10 min；離心后RNA沉淀至管底，形成白色膠狀沉淀?xiàng)壣锨?，加?5%乙醇1 ml·1 ml-1Trizol混勻混合液，4，7 500 r/min，離心5 min棄上清，室溫干燥RNA 5 min取適量RNA 用DEPC處理過的水溶解，紫外分光光度計(jì)下測(cè)260,280 nm的吸

14、光度計(jì)算OD260/OD280的比值及RNA的濃度。260/280比值在1.82.0之間計(jì)算OD260/OD280的比值及RNA的濃度。260/280比值在1.82.0之間，可用于下一步實(shí)驗(yàn)，RNA濃度=OD260×稀釋倍數(shù)×40/1000其余的RNA置于70%乙醇中，存于-70冰箱中保存。2.4 RT-PCR2.4.1 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)取1 l總 RNA于一支Ep管中，加1 l（100 mol/L）的3'反向引物，定容到15 l，72處理5 min，置于冰浴中;在Ep管中按下表配置30 l反應(yīng)體系。見表2。表2 大鼠肺組織MMP-2 cDNA反應(yīng)體系的制備（略） 將上述

15、樣品加入0.2 ml Ep管中，混勻，42保溫1 h。2.4.2 PCR反應(yīng)在Ep管中按下表配置30 l反應(yīng)體系。見表3； PCR擴(kuò)增儀中擴(kuò)增:94預(yù)變性2 min94變性15 s42復(fù)性30 s72延伸90 s擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)72延伸加時(shí)5 min；瓊脂糖凝膠電泳觀察:取10 l樣品，加入2 l上述樣品緩沖液，混勻；瓊脂糖0.75，加入50 ml 1×TPE緩沖液于微波爐中，取中火，加入2 l EB混勻，灌膠；分別加入樣品、內(nèi)參對(duì)照物各12 l,在1×TPE緩沖液中60 V電泳1 h，紫外燈下觀察結(jié)果。表3 大鼠肺組織MMP-2 PCR反應(yīng)體系成分（略）2.5 基質(zhì)金屬蛋白

16、酶基因的獲得2.5.1 引物設(shè)計(jì)在GeneBank中查到了已報(bào)道的編碼大鼠肺組織基質(zhì)金屬蛋白酶的mRNA序列，NM 022564 1 644 bp，蛋白編碼序列113-1486（CDS）=1 373 bp，共457個(gè)氨基酸。擬擴(kuò)增全長編碼序列，利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物。 引物為：Primer I: 5' TCGTCCATCCATTGAAGC 3'，18mer;Primer : 5' CCCTCGTTATTTGGTGTT 3'，18mer。2.5.2 大鼠肺組織總RNA的提取本實(shí)驗(yàn)提取大鼠肺組織總RNA，使用RT-PCR技術(shù)，得到編碼目的

17、蛋白的核苷酸序列。用大鼠新鮮肺組織50 mg ,液氮速凍，并在液氮條件下勻漿。實(shí)驗(yàn)中使用TrIzol試劑提取大鼠胎盤組織總RNA，提取過程簡便，經(jīng)甲醛變性電泳檢驗(yàn),呈現(xiàn)28 S和18 S兩條帶，無“拖尾”，總RNA無降解(見圖1)，可用于RT-PCR擴(kuò)增。2.5.3 RT-PCR擴(kuò)增大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶基因片段以提取的總RNA為模板，用3'反向引物反轉(zhuǎn)錄第一條鏈。然后以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用引物primer I、進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物長度為1479bp,2%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，擴(kuò)增產(chǎn)物單一，分子大小準(zhǔn)確，結(jié)果見圖2。2.6 免疫組化（MMP-1 、MMP-9）2.6.1 取材步驟及切片處理同

18、“2.2”項(xiàng)。2.6.2 免疫組化操作步驟按照常規(guī)操作。結(jié)果判定：在用DAB顯色的免疫細(xì)胞化學(xué)切片上，陽性反應(yīng)按顏色深淺分為：棕黃色為強(qiáng)陽性；黃色為陽性；淺黃色為弱陽性；與間質(zhì)顏色一致者為陰性。2.7 原位雜交按照常規(guī)操作。3 結(jié)果3.1 RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果以-actin為內(nèi)參對(duì)照，對(duì)RT-PCR結(jié)果進(jìn)行分析，凝膠電泳經(jīng)FuJiFilm圖像處理，輸入Imagemaster VDS凝膠成像分析系統(tǒng)做密度掃描，進(jìn)行表達(dá)強(qiáng)度分析，以同時(shí)擴(kuò)增的-actin表達(dá)強(qiáng)度為基準(zhǔn)，按以下公式計(jì)算樣品MMP-2表達(dá)強(qiáng)度：表達(dá)強(qiáng)度 = 樣品MMP-2 A值/-actin A值。3.2 大鼠肺組織MMP-2總RNA

19、電泳結(jié)果利用Trizol法提取的肺組織RNA，瓊脂糖電泳能清晰見到28S和18S兩條核糖體RNA帶。電泳圖上RNA的OD260/OD280比值在1.820之間，說明總體純度較高，可以滿足RT-PCR擴(kuò)增。見圖1。3.3 大鼠肺組織MMP-2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果肺組織MMP-2的PCR產(chǎn)物均出現(xiàn)（預(yù)期長度426 bp），-actin內(nèi)參對(duì)照也特異性擴(kuò)增（預(yù)期長度325 bp）。說明模型組MMP-2的含量明顯高于假手術(shù)組，復(fù)方鱉甲軟肝方高、中、低劑量MMP-2含量下降。陽性藥物組介于藥物組和模型組之間。見圖2。3.4 MMP-9和MMP-1免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果 MMP-9假手術(shù)組除7d肺泡腔內(nèi)炎癥

20、細(xì)胞有陽性的表達(dá)外，14，28 d均無表達(dá)。模型組肺泡間隔間質(zhì)細(xì)胞，巨嗜細(xì)胞，脫落到肺泡腔的炎性細(xì)胞均強(qiáng)陽性表達(dá)。陽性藥物組3個(gè)階段均以型細(xì)胞和肺泡腔內(nèi)的炎癥細(xì)胞陽性表達(dá)為主，有部分間質(zhì)細(xì)胞呈陽性。復(fù)方鱉甲軟肝方高、中、低劑量組3個(gè)階段均僅在肺泡腔炎性細(xì)胞和型細(xì)胞呈陽性或弱陽性表達(dá)，其余各種細(xì)胞均無表達(dá)。 MMP-1假手術(shù)組7，14，28 d在肺泡炎癥細(xì)胞弱陽性表達(dá)，模型組肺泡間質(zhì)細(xì)胞強(qiáng)陽性表達(dá)，肺泡腔炎癥細(xì)胞呈弱陽性表達(dá)。復(fù)方鱉甲軟肝方高、中、低劑量組各組肺泡間質(zhì)細(xì)胞7，28 d均陽性表達(dá)。3.5 MMP-2原位雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果28 d取材結(jié)果顯示，MMP-2在假手術(shù)組呈陰性不表達(dá)；在模型組細(xì)支

21、氣管上皮細(xì)胞和部分肺泡隔巨噬細(xì)胞強(qiáng)陽性表達(dá)。型細(xì)胞陽性表達(dá)。復(fù)方鱉甲軟肝方高、中、低劑量組僅在部分肺泡隔巨嗜細(xì)胞呈陽性或弱陽性表達(dá)。陽性藥物組表達(dá)似復(fù)方鱉甲軟肝方高劑量組。4 討論 在特發(fā)性肺纖維化形成的發(fā)病機(jī)制中，MMPs家族和特發(fā)性肺纖維化的形成有關(guān)1。明膠酶是MMPs家族的成員之一，包括明膠酶A（MMP-2）和明膠酶B（MMP-9）兩種類型。兩者結(jié)構(gòu)相似，底物特性相似，但基因表達(dá)調(diào)控卻有許多不同1。MMP-2基因轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)，容易引起肺基膜結(jié)構(gòu)的損傷，引起特發(fā)性肺纖維化的啟動(dòng)機(jī)制12。肺組織內(nèi)MMP-2的過度表達(dá)，可能是特發(fā)性肺纖維化啟動(dòng)的重要原因3。在RT-PCR實(shí)驗(yàn)電泳圖中，可以清晰地

22、看到復(fù)方鱉甲軟肝方高、中、低劑量組對(duì)MMP-2的表達(dá)有抑制作用。激素對(duì)MMP-2的表達(dá)也有抑制作用，只是效果不如復(fù)方鱉甲軟肝方各劑量組。明膠酶主要來源于巨噬細(xì)胞和炎癥細(xì)胞，28 d時(shí)，肺泡炎癥已經(jīng)基本消退，但其表達(dá)仍然呈現(xiàn)陽性，說明在該階段MMP-2其來源可能與文獻(xiàn)報(bào)道的成纖維細(xì)胞通過使MMP-2基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，來產(chǎn)生更多的MMP-2，導(dǎo)致肺基膜結(jié)構(gòu)的損傷，參與特發(fā)性肺纖維化啟動(dòng)的過程有關(guān)，尚需更多的實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步證實(shí)成纖維細(xì)胞在其中所起的作用。 文獻(xiàn)報(bào)道，MMP-2主要分布于再生的肺泡上皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞4。其活性形式在肺泡上皮細(xì)胞的和肺泡結(jié)構(gòu)的重建中起很重要的作用。肺泡上皮不單是致纖維化因

23、素的損傷對(duì)象，其損傷后活躍增生的肺泡型上皮細(xì)胞可以通過釋放MT1-MMP，催化MMP-2，從而引起和（或）加重肺基膜的損傷。這些結(jié)果在實(shí)驗(yàn)中通過原位雜交和RT-PCR都得到證實(shí)。 免疫組化MMP-1和MMP-9的檢測(cè)證實(shí)，在組織早期損傷階段MMPs表現(xiàn)分泌增加，活性增強(qiáng)，溶解、破壞基膜及ECM的作用1，5。MMP-2、MMP-3、MMP-9增強(qiáng)活化后，進(jìn)一步破壞基膜及ECM，而且參與TGF的釋放，進(jìn)而異常的基質(zhì)重塑6。MMP-9在7 d時(shí)主要在肺泡腔巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中表達(dá)，在14 d時(shí)隨著肺泡腔巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的減少，活性也隨之下調(diào)。28 d時(shí)由于肺泡腔炎癥細(xì)胞的減少，僅在部分細(xì)支氣管

24、上皮及部分間質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)陽性表達(dá)。同文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果比較一致。 MMPs活性的調(diào)節(jié)是一個(gè)多水平、多環(huán)節(jié)的復(fù)雜過程7，因此始終是研究的熱點(diǎn)和關(guān)注的焦點(diǎn)，其中MMP-2被認(rèn)為是特發(fā)性肺纖維化病理過程起重要作用的因素之一8。通過MMP-2的RT-PCR的電泳圖和原位雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說明復(fù)方鱉甲軟肝方高、中、低劑量組在防治IPF中所起到的抗纖維化作用9，說明中藥在抗纖維化方面還有很多內(nèi)容需要我們進(jìn)一步探討。深入研究MMPs對(duì)IPF調(diào)控機(jī)制和中藥對(duì)其的影響，將有助于揭示特發(fā)性肺纖維化發(fā)生發(fā)展的病理過程，并為臨床防治特發(fā)性肺纖維化提供新的思路?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1吳浩，許杰，盧韶華，等.肺纖維化大鼠種基質(zhì)金屬蛋白酶-

25、2的表達(dá)J.中華病理學(xué)雜志，2001，6：452.2Betsuyaku T, Fukuda Y, Parks WC, et al. Gelatinase B is required for alveolar bronchiolization after intratracheal bleomycinJ.Am J Path 2000，157(2):525.3向菲，辛建保，汪世翰，等.己酮可可堿對(duì)肺纖維化大鼠MMP-2和TIMP-1表達(dá)的影響J.中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2004，13（4）：440.4Ries C，Petrides PE. Cytokine regulation of matrix metalloproteinase activity and its regulat