提RNA逆轉(zhuǎn)錄qRTPCR步驟

1、【一、提RNA】一、實驗準(zhǔn)備：1、試劑：75%乙醇、Trizol、1.5mL 進(jìn)口EP管、氯仿、異丙醇、進(jìn)口槍頭(RNA專用)、2、配75%乙醇(DEPC水+無水乙醇)，放-20冰箱預(yù)冷；3、預(yù)冷離心機(jī)(1.5mL EP管用的)；4、清潔桌面，酒精噴過之后擦干，新手套、兩層口罩；二、操作步驟：01、棄上清（不回收，直接倒去）；02、1mL/孔 PBS洗兩遍（不回收，直接倒去，隨后用200L槍吸盡PBS）；03、每孔加500L Trizol，輕晃，隨后室溫放置2min左右；04、槍頭吹打，吸出放入1.5mL 進(jìn)口EP管；05、加入100L氯仿(即1/5體積的trizol)；06、4離心機(jī)，120

2、00g，15min；07、吸200L(可減少)上清放入新的1.5mL 進(jìn)口EP管中（注意：只能吸到上清）；08、加入等體積異丙醇，充分混勻，常溫放置10-30min(15min)；09、4離心機(jī)，12000g，10min；10、倒掉液體，加入1mL預(yù)冷的75%乙醇劇烈混勻；11、4離心機(jī)，7500g，5min；12、倒掉上清，加入1mL預(yù)冷的75%乙醇，混勻；13、4離心機(jī)，7500g，5min；14、倒掉上清，倒扣在餐巾紙上，5-10min，用針頭或者200微升槍頭去掉管壁上的水珠；15、每管中加入40L(40-60L)的DEPC水，吹打溶解；16、測濃度（先知樓21樓測RNA濃度，帶DEP

3、C水、滅菌的dd水、10微升槍和槍頭）；三、注意事項01、如果當(dāng)時不測RNA濃度，可暫時把RNA放在-20冰箱。但長時間(>24h)保存，需要放在-80冰箱；02、異丙醇作用是沉淀RNA，作用比乙醇好；03、04、05、06、07、08、09、【二、測RNA濃度】一、實驗準(zhǔn)備：01、先知樓21樓-2109教室，一個冰盒+DEPC水+10微升槍、滅菌dd H2O、10L槍頭(RNA專用)、本子+筆；二、操作步驟：01、登記；02、打開電腦=>打開“N”軟件=>點擊“Nucleic acid”=>選擇“OK”=>選擇“RNA”；03、滅菌dd H2O清洗2-3遍，擦干

4、；04、DEPC水 校零：即加DEPC水一滴，點擊“Blank”，擦干；05、測RNA：加樣品一滴，點擊“measure”，擦干，隨后加下一個樣品；06、記錄數(shù)據(jù)，包括RNA濃度（<1000ng/L）、260/280；07、滅菌dd H2O清洗2-3遍，擦干；08、-80冰箱保存；三、注意事項 230nm代表有機(jī)物水平(碳水化合物)，260nm代表RNA 水平，280nm代表蛋白水平，260/230表示有機(jī)物量，260/280代表RNA提取量；1.A260nm 是核酸最高吸收峰的吸收波長，最佳測量值的范圍為0.1-1.0。如果不在此范圍，稀釋或濃縮樣品，使之在此范圍內(nèi)；如果吸光度小于0.

5、05，檢查是否存在操作因素（如移液不準(zhǔn)確，樣品內(nèi)有懸浮物等）影響。DNA 樣品的A260 吸光度值是否>0.1。（請注意，這個值跟儀器無關(guān)，核酸的吸光度必需大于 0.1，其值才有效和可靠，因為樣品中的雜質(zhì)和顆粒這些不純物的干擾通常會對光有一定吸收，其值<0.1）；2.A280nm、A270nm是蛋白最高吸收峰的吸收波長，比值可進(jìn)行核酸樣品純度評估：純 DNA 的 A260/A280比值為1.8，純RNA為2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚類物質(zhì)的污染，需要純化樣品。比值=1.5 相當(dāng)于50蛋白質(zhì)/DNA溶液.酚的最大吸收峰在270nm。3. A230nm是碳水化合物最高

6、吸收峰的吸收波長，比值可進(jìn)行核酸樣品純度評估：純DNA 和 RNA的A260/A230比值為2.5。若比值小于2.0 標(biāo)明樣品被碳水化合物（糖類）、鹽類或有機(jī)溶劑污染，需要純化樣品。A230產(chǎn)生負(fù)值主要是由于在很低 DNA 濃度的溶液中的一些其他成分的干擾所導(dǎo)致的。在下一個測定中，需要降低樣品的稀釋度，A230的負(fù)值會被校正。 4. A320nm或A340nm 為檢測溶液樣品的濁度和其他干擾因子。該值應(yīng)該接近0.0。如果不是，標(biāo)明溶液中有懸浮物，需要純化樣品。純樣品的A320一般是0。 5. A260/A280和A260/A230 是核酸純度的指示值。純度好的DNA或RNA

7、，在pH7-8.5 下A260 / A280的比值應(yīng)該在2.0 或2.5。純凈的樣品比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物、鹽（胍鹽）等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。當(dāng)0.5BSA蛋白質(zhì)污染時，蛋白污染會導(dǎo)致260和280的數(shù)值都下降，其凈結(jié)果是260/280比值下降，但260/280的比值變化并不顯著，正如分子克隆3所說。但蛋白殘留會導(dǎo)致230的數(shù)值顯著上升，顯著影響260/230的比值。也就是說，如果RNA樣品的260/2801.7，260 /2300

8、.5，那么就應(yīng)該考慮污染原因不是胍鹽殘留，而是蛋白殘留.用分光光度計測量RNA時，用水而不是用TE 緩沖液稀釋RNA樣品會造成A260/A280比值下降。原因是低離子強(qiáng)度和低pH溶液會增加280 nm處的光吸收值。加氯仿離心后取上清的時候千萬不要貪多，那樣就很容易被蛋白污染，所以現(xiàn)在一般取400ul左右。 6.當(dāng)260/230<1時，只有兩種情況。一是胍鹽污染，二是蛋白污染?！救?、逆轉(zhuǎn)錄】一、實驗準(zhǔn)備：01、進(jìn)口10L槍頭(qRT-PCR專用)、冰盒一個、200L進(jìn)口 EP管；02、冰上融化1、2、4、2號試劑(提前半小時)；03、二、操作步驟：試劑盒：1. 2L 2. 0.5

9、L(最后加入) 3. 0.5L 4. 0.5L RNA 1000ng DEPC水-10L體系01、200L進(jìn)口管子：EP管加相應(yīng) DEPC水=>加1號試劑（2L）=>加3號試劑(0.5L)=>加4號試劑(0.5L)=>加2號試劑(0.5L)=>加RNA=>離心=>上機(jī)；02、上機(jī)：OPEN=>點擊“User”菜單下的“clx”，點擊“Accept”=>選擇“run”下面的到“exp001 rt”=>修改體系“10L”(默認(rèn)為25微升)=>點擊“Start”，進(jìn)入界面；03、37.0 15min=>85.0 5s=>4

10、.0 60min；04、4冰箱保存；三、注意事項01、加液盡量無氣泡，槍不要打到底；02、嚴(yán)格冰上操作，防止RNA降解；【qRT-PCR】一、實驗準(zhǔn)備：01、試劑：Roche的SyBr Green(rox)02、1.5mL EP管、0.2mL EP管、96孔板/八連冠；10L、20L、100L、200L、2.5L、1000L槍；03、冰盒一個、Rox化凍(避光)、引物化凍（GAPDH）、cDNA、DEPC水；二、操作步驟：01、 Rox 10L；+ dd H2O 6L；+ P1(F) 1 + P2(R) 1 + cDNA 2-20L體系02、計算：每個樣，X個抗體(至少包括GAPDH-內(nèi)參,還

11、有目的)，三個副孔。 即如果六個樣，2個抗體(GAPDH,PLK1)，三個副孔。6*1*3=1820(PLK1)，6*1*3=1820(GAPDH)；1234567891011126/PLK16/PLK16/PLK15/PLK15/PLK15/PLK16/GAP6/GAP6/GAP5/GAP5/GAP5/GAP4/PLK14/PLK14/PLK13/PLK13/PLK13/PLK12/PLK12/PLK12/PLK11/PLK11/PLK11/PLK14/GAP4/GAP4/GAP3/GAP3/GAP3/GAP2/GAP2/GAP2/GAP1/GAP1/GAP1/GAP PLK1 Rox：10

12、*20=200L DEPC水：6*20=120L F：1*20=20L R：1*20=20L GAPDH Rox：10*20=200L DEPC水：6*20=120L F：1*20=20L R：1*20=20L03、稀釋cDNA 10倍(18L DEPC水+2L)=>配置Mix(Rox+ DEPC水+F+R)=>加樣(一橫排先加18L mix(GAPDH)，隨后加入18L mix(PLK1)。 隨后六個孔加同一個cDNA；06、去除氣泡：加好樣后，觀察有無氣泡。如果有氣泡，彈開，隨后>2000rpm離心，時間不定(5s即可)；07、上機(jī)+設(shè)置程序： A、雙擊打開程序“ Ste

13、pOne Software v2.1 ”=>點擊“ OK ”=>點擊“Ignore & Continue Startup ”=>點擊“ Advanced Setup ”=>進(jìn)入“ Experment Properties界面 ”；B、Experment Properties界面： 將Expriment Name從Untitled 修改為“日期，如2015-12-17”，將User Name(Optional)修改為“CZL”； Which instrument are you using to run the experiment ?中選擇“96 wells”，

14、一般無需修改； What type of experiment do you want to setup ?中選擇“Quantitation-Comparative CT(CT)”； Which reagents do you want to use to detect the target sequence ? 中選擇“SYBR Green Reagents”； Which ramp speed do you want to use in the instrument run ? 中選擇“Fast( 40 minutes to complete a run)”；C、Plate Setup界面

15、-Define Targets and Samples界面： Define Targets欄中：如果有GAPDH、PLK1、Akt、PI3K三個引物，則點擊“ Add New Target ”三下，出現(xiàn)“Target1、Target2、Target3、Target4”三個=>將其重命名； Define Samples欄中：如果有6個樣品(N;1.5;3;6;9;12)，則點擊“Add New Sample ”，出現(xiàn)“Sample 1、Sample 2、Sample 3、Sample 4、Sample 5、Sample 6”六個=>將其重命名； Plate Setup界面-Assig

16、n Targets and Samples界面：GAP/1GAP/1GAP/1GAP/2GAP/2GAP/2GAP/3GAP/3GAP/3GAP/4GAP/4GAP/4Plk1/1Plk1/1Plk1/1Plk1/2Plk1/2Plk1/2Plk1/3Plk1/3Plk1/3Plk1/4Plk1/4Plk1/4Akt/1Akt/1Akt/1Akt/2Akt/2Akt/2Akt/3Akt/3Akt/3Akt/4Akt/4Akt/4PI3K/1PI3K/1PI3K/1PI3K/2PI3K/2PI3K/2PI3K/3PI3K/3PI3K/3PI3K/4PI3K/4PI3K/4GAP/5GAP/5GAP/5GAP/6GAP/6GAP/6Plk1/5Plk1/5Plk1/5Plk1/6Plk1/6Plk1/6Akt/5Akt/5