感染性疾病相關(guān)

1、感染性疾病相關(guān)個(gè)體化醫(yī)學(xué)分子檢測技術(shù)指南前言感染性疾病是當(dāng)今世界嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，快速、準(zhǔn)確的診斷是有效治療、病情監(jiān)測和控制疾病蔓延的重要前提。隨著分子檢測技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，分子檢測在病原微生物感染診斷及治療監(jiān)測上的臨床應(yīng)用日益廣泛，已成為一些重要的感染性疾病的診斷和療效評價(jià)中不可缺少的重要工具。為使我國的感染性疾病分子檢測臨床應(yīng)用健康有序發(fā)展，更好的為醫(yī)患提供高質(zhì)量的服務(wù)，有必要制訂感染性疾病相關(guān)的分子檢測技術(shù)指南，規(guī)范臨床實(shí)驗(yàn)室相關(guān)分子檢測操作程序，指導(dǎo)從事感染性疾病分子診斷的醫(yī)務(wù)人員正確開展工作。本指南以大量、豐富的臨床實(shí)踐為基礎(chǔ)，同時(shí)消化吸取了大量國內(nèi)外文獻(xiàn)的精華，廣泛征

2、求相關(guān)學(xué)科專家的意見，遵循科學(xué)性、實(shí)用性、可行性的原則，反復(fù)修改而成。我們衷心希望感染性疾病相關(guān)個(gè)體化醫(yī)學(xué)分子檢測技術(shù)指南能夠?qū)V大檢驗(yàn)人員起到很好的幫助和指導(dǎo)作用，從而為提高感染性疾病臨床診治水平發(fā)揮積極的作用本指南起草單位：中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、國家衛(wèi)生計(jì)生委臨床檢驗(yàn)中心本指南起草人：尚紅、李金明、郭曉臨、代娣、程仕彤目錄1. 本指南適用范圍32. 標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語33. 感染性疾病相關(guān)的個(gè)體化醫(yī)學(xué)分子檢測概述94. 感染性疾病相關(guān)的個(gè)體化醫(yī)學(xué)分子檢測分析前質(zhì)量控制124.1 標(biāo)本采集134.2 標(biāo)本的轉(zhuǎn)運(yùn)164.3 標(biāo)本的接收174.4 標(biāo)本的保存184.5 檢驗(yàn)項(xiàng)目的選擇195. 感染性疾

3、病相關(guān)的個(gè)體化醫(yī)學(xué)分子檢測分析中質(zhì)量控制205.1 實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)要求205.2常用的分子檢測方法215.3 試劑和方法的選擇295.4 設(shè)備維護(hù)和校準(zhǔn)365.5 人員培訓(xùn)365.6 試劑性能驗(yàn)證376. 感染性疾病相關(guān)的個(gè)體化醫(yī)學(xué)分子檢測分析后質(zhì)量控制406.1 結(jié)果報(bào)告406.2 結(jié)果的解釋及醫(yī)患的溝通416.3 檢測后標(biāo)本的保存及處理427. 質(zhì)量保證427.1 標(biāo)準(zhǔn)操作程序427.2 質(zhì)控品427.3 室內(nèi)質(zhì)量控制437.4 室間質(zhì)量評價(jià)478. 感染性疾病相關(guān)的個(gè)體化醫(yī)學(xué)分子檢測應(yīng)用488.1 乙型肝炎病毒感染診療的個(gè)體化分子檢測488.2 丙型肝炎病毒感染診療的個(gè)體化分子檢測528.

4、3 結(jié)核分枝桿菌感染診療的個(gè)體化分子檢測568.4 人獲得性免疫缺陷病毒感染診療的個(gè)體化分子檢測57附錄65參考文獻(xiàn)661. 本指南適用范圍本指南由國家衛(wèi)生計(jì)生委個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)專家委員會(huì)編訂，是國家衛(wèi)生計(jì)生委個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)系列指南之一，旨為臨床實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行感染性疾病相關(guān)的個(gè)體化醫(yī)學(xué)分子檢測提供參考和指導(dǎo)。本指南介紹了感染性疾病相關(guān)的個(gè)體化醫(yī)學(xué)分子檢測應(yīng)注意的相關(guān)問題、技術(shù)方法、結(jié)果報(bào)告與解釋、質(zhì)量保證及臨床應(yīng)用等內(nèi)容。本指南主要適用于開展個(gè)體化醫(yī)學(xué)分子檢測的醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，同時(shí)供從事感染性疾病診治的臨床醫(yī)師參考。2. 標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語2.1 感染性疾病（infectious diseas

5、e）即由病原微生物引起的疾病的統(tǒng)稱。2.2 病原微生物（pathogen）指侵犯人體，引起感染的微生物，或稱病原體。病原微生物包括病毒、細(xì)菌、真菌、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體、寄生蟲和朊毒體。2.3 宿主（host）為病原體提供生存環(huán)境的生物，本指南中的“宿主”僅指人體。2.4 窗口期（window period）宿主感染病原體，需要一段時(shí)間之后才能產(chǎn)生抗體。從感染病原體到能檢測到抗體的時(shí)間就叫做窗口期。2.5 擴(kuò)增子擴(kuò)增產(chǎn)物（amplicon/amplification product）由目標(biāo)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的相對低分子量的產(chǎn)物。2.6 質(zhì)控品（control）為質(zhì)量控制目的而制備的標(biāo)本稱

6、為質(zhì)控品。質(zhì)控品不能用于校準(zhǔn)。質(zhì)控品的性能指標(biāo)有:穩(wěn)定性、瓶間差、定值和非定值、分析物水平、預(yù)處理的要求等。2.7 標(biāo)準(zhǔn)品（standard）用于定標(biāo)，即標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。2.8 校準(zhǔn)品（calibrator）指定用來校準(zhǔn)某檢測系統(tǒng)（儀器+試劑+方法程序）的，是在考慮到基質(zhì)效應(yīng)的情況下，人為賦予校準(zhǔn)品的校準(zhǔn)值。因此，校準(zhǔn)品必須專用于某一檢測系統(tǒng)。2.9 抑制作用（inhibition）臨床標(biāo)本中的某些成分或者標(biāo)本采集和處理過程中引入的某些外源性物質(zhì)可能對擴(kuò)增反應(yīng)或者識別過程產(chǎn)生的削弱作用。2.10 內(nèi)部質(zhì)控（internal control）在同一個(gè)反應(yīng)管中存在的一段非目標(biāo)序列，將與目標(biāo)序列一同

7、被擴(kuò)增，用于識別由溫控故障、不合格的試劑或聚合酶活性等造成的抑制作用，以及識別相同的基質(zhì)內(nèi)是否存在抑制性物質(zhì)。2.11 核酸酶（nuclease）能夠水解核酸的多種酶中的任何一種，比如內(nèi)切酶和外切酶。2.12 核酸提?。╪ucleic acid extraction）將核酸（RNA，DNA）從生物物質(zhì)中分離出來的過程，以備進(jìn)行核酸的擴(kuò)增和分析。2.13 檢驗(yàn)（examination）以確定一個(gè)特性的值或特征為目的的一組操作。實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)也常稱為檢測或試驗(yàn)。確定一個(gè)特性的值的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)稱為定量檢驗(yàn)，確定一個(gè)特性的特征的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)稱定性檢驗(yàn)。2.14 原始樣品（primary sample）標(biāo)本（s

8、pecimen）為檢驗(yàn)、研究或分析一種或多種量或特性而取出的認(rèn)為可代表整體的一獨(dú)立部分的體液、呼出氣、毛發(fā)或組織等。2.15 樣品（sample）取自原始樣品的一部分或多部分。2.16 寡核苷酸（Oligonucleotide）一種短分子單鏈DNA，通常為6-100個(gè)核苷酸，由化學(xué)方式合成。2.17 引物（Primer）一個(gè)寡核苷酸，可以與目標(biāo)DNA的互補(bǔ)鏈雜交。在DNA聚合酶和核苷酸的參與下，啟動(dòng)DNA的合成過程（從3-OH 端開始）。2.18 探針（Probe）已定義的單鏈核酸片段，用于識別特定的包含其互補(bǔ)序列的DNA或者RNA分子。探針通常都附帶一個(gè)標(biāo)記（放射性標(biāo)記或者化學(xué)性標(biāo)記），使探

9、針在雜交后能被檢測到。2.19 淬滅劑（Quencher）能夠從熒光基團(tuán)接收能量并且通過近端淬滅或者FRET淬滅來消耗該能量的分子。2.20 野生型（wild type）基因或生物體在自然界中常見的或非突變型的形式。2.21 突變（mutation）基因的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而導(dǎo)致細(xì)胞、病毒或微生物的基因型發(fā)生穩(wěn)定的、可遺傳的變化過程。2.22 點(diǎn)突變（point mutation）基因內(nèi)單個(gè)核苷酸置換所造成的結(jié)構(gòu)改變。2.23 缺失突變（deletion mutation）由于相鄰的多個(gè)核苷酸或片段丟失所造成的突變。2.24 雜合子（heterozygote）又稱“雜合體”。在二倍體生物中，一對同源

10、染色體上特定的基因座上有兩個(gè)不同的等位基因的個(gè)體或細(xì)胞。2.25 純合子（homozygote）又稱“純合體”。在二倍體生物中，一對同源染色體上特定的基因座上有兩個(gè)相同的等位基因的個(gè)體或細(xì)胞。2.26 表型（phenotype）一個(gè)生物體（或細(xì)胞）可以觀察到的性狀或特征，是特定的基因型和環(huán)境相互作用的結(jié)果。2.27 基因型（genetype）一個(gè)生物體或細(xì)胞的特定基因組成。2.28 單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms, SNPs）是指由單個(gè)核苷酸A、T、C或G的改變而引起的DNA序列的改變，造成包括人類在內(nèi)的物種之間染色體基因組的多樣性。2.29 隨

11、機(jī)誤差（random error）在重復(fù)測量中按不可預(yù)見方式變化的測量誤差的分量。通常隨機(jī)誤差的參考量值是對同一被測量多次重復(fù)測量得到的均值。2.30 系統(tǒng)誤差（systematic error）在重復(fù)測量中保持不變或按可預(yù)見方式變化的測量誤差的分量。系統(tǒng)誤差的參考量值是真值,或者是測量不確定度可忽略不計(jì)的測量標(biāo)準(zhǔn)測得的值,還可以約定量值。2.31 驗(yàn)證（verification）通過提供客觀證據(jù)證實(shí)對規(guī)定要求已得到滿足的認(rèn)定。驗(yàn)證過程證實(shí)的檢驗(yàn)程序的性能指標(biāo),應(yīng)與檢驗(yàn)結(jié)果的預(yù)期用途相關(guān)。2.32 確認(rèn)（validation）通過提供客觀證據(jù)對特定的預(yù)期用途或應(yīng)用要求已得到滿足的認(rèn)定。性能確認(rèn)

12、應(yīng)盡可能全面,并通過客觀的證據(jù)(以性能特征形式) 證實(shí)滿足檢驗(yàn)預(yù)期用途的特定要求。2.33 精密度（precision）在規(guī)定條件下，對同一或類似被測對象重復(fù)測量所得示值或測得值間的一致程度。規(guī)定條件可以是重復(fù)性測量條件、期間精密度測量條件或復(fù)現(xiàn)性測量條件。精密度通常無法衡量，而以不精密度表達(dá)，常用標(biāo)準(zhǔn)差、方差或變異系數(shù)表示，是對隨機(jī)誤差的衡量。2.34 正確度（trueness）多次重復(fù)檢測所得量值的平均值與一個(gè)參考量值間的一致程度。通常用“偏倚”表達(dá)，是對系統(tǒng)誤差的衡量。選擇一個(gè)合適的參考對正確度評價(jià)很重要，最好采用參考方法。2.35 可報(bào)告范圍（reportable range）指測量儀

13、器的誤差在預(yù)期規(guī)定范圍內(nèi)的被測量值的集合。2.36 測量范圍（measurement range）檢測方法可直接對未經(jīng)稀釋、濃縮或其他非常規(guī)檢測流程預(yù)處理的標(biāo)本進(jìn)行檢測，得到的分析物濃度范圍。2.37 臨床可報(bào)告范圍（clinically reportable range）通過采用標(biāo)本的稀釋、濃縮或其他預(yù)期處理，用于延長直接的分析測量范圍下的分析物值的范圍，其范圍一般較測量范圍寬，是考慮方法檢測限和預(yù)處理流程后的測量范圍的延伸。2.38 參考區(qū)間（reference interval）又稱為參考范圍、正常范圍等，通常采用參考值分布的中間95%區(qū)間。2.39 檢測限（limit of detec

14、tion, LoD）指某一分析方法在給定的可靠程度內(nèi)可以從樣品中檢測待測物質(zhì)的最小濃度或最小量。2.40 干擾（interference）指被測物質(zhì)濃度因樣品特性或其他成分的影響而出現(xiàn)的臨床顯著性偏差，評價(jià)的是由樣品引起的特異性偏差。2.41 敏感性（sensitivity）指金標(biāo)準(zhǔn)診斷有病的全部病例中，被評價(jià)方法結(jié)果為陽性的病例占全部有病病例的比例，即敏感性=真陽性/(真陽性+假陰性) 100%。2.42 特異性（specificity）指金標(biāo)準(zhǔn)診斷全部無病病例中，被評價(jià)檢驗(yàn)方法結(jié)果為陰性的病例所占全部無病病例的比例，即特異性=真陰性/(假陽性+真陰性) 100%。2.43 生物學(xué)變異（ b

15、iological variation）指在機(jī)體穩(wěn)定狀態(tài)下，排除已知可能影響因素（例如，疾病、用藥、禁食、運(yùn)動(dòng)等），除外已知節(jié)律性變化（例如，對于某些檢驗(yàn)項(xiàng)目，晝夜或季節(jié)性變化等），依然存在的隨機(jī)變異。2.44 分析前變異（pre-analytical variation）從患者準(zhǔn)備開始至樣品分析啟動(dòng)前各環(huán)節(jié)造成的變異，包括抽血及有關(guān)條件、運(yùn)輸、離心、保存等環(huán)節(jié)或因素造成的變異。2.45 檢驗(yàn)前過程（pre-examination processes）分析前階段（preanalytical phase）按時(shí)間順序從醫(yī)生申請至分析檢驗(yàn)啟動(dòng)前的過程，包括檢驗(yàn)申請、患者準(zhǔn)備和識別、原始樣品采集、運(yùn)送

16、和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)運(yùn)送等。2.46 檢驗(yàn)后過程（post-examination processes）分析后階段（postanalytical phase）包括結(jié)果復(fù)核、臨床材料保留和儲(chǔ)存、樣品和廢物處理，以及檢驗(yàn)結(jié)果的格式化、發(fā)布、報(bào)告和留存等。3. 感染性疾病相關(guān)的個(gè)體化醫(yī)學(xué)分子檢測概述感染性疾病是由病原微生物（細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲等）引起的疾病的統(tǒng)稱。據(jù)統(tǒng)計(jì)感染性疾病死因占全部死因的25%以上，是當(dāng)今世界嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病。3.1 分子檢測與感染性疾病的個(gè)體化醫(yī)療 個(gè)體化醫(yī)療（personalized medicine）是以每個(gè)患者的信息為基礎(chǔ)來決定治療方案，從基因組成或表達(dá)變化的差

17、異來把握治療效果或毒副作用等應(yīng)答特異性，對每個(gè)患者進(jìn)行最適宜的治療。個(gè)體化醫(yī)療目前在個(gè)體化用藥、疾病診斷、治療監(jiān)測以及預(yù)后判斷中都發(fā)揮著重要作用。長期以來感染性疾病的診斷和療效監(jiān)測一直依靠形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)以及病原體分離培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)等方法，但形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)受檢測人員經(jīng)驗(yàn)影響較大，易誤診；而免疫學(xué)、藥敏試驗(yàn)和病原體分離培養(yǎng)的窗口期或檢測實(shí)驗(yàn)周期較長，易錯(cuò)過最佳治療時(shí)機(jī)。分子檢測在病原體檢測中優(yōu)勢明顯，靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速準(zhǔn)確。因此近年來發(fā)展較快，已成為病原體診治中不可或缺的重要工具，而且已經(jīng)廣泛應(yīng)用于感染性疾病的個(gè)體化診斷和治療中。例如利用分子檢測技術(shù)可以幫助明確乙型肝炎患者體內(nèi)HBV DNA的病

18、毒載量、基因型和基因突變情況，而這些正是判斷患者何時(shí)開始治療、采用何種治療方案、發(fā)生肝硬化等不良預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)的決定性因素。3.2 個(gè)體化醫(yī)學(xué)分子檢測在感染性疾病中的應(yīng)用 本指南中涉及的感染性疾病個(gè)體化醫(yī)學(xué)分子檢測主要包括病原體核酸定量檢測、分子分型檢測、耐藥基因檢測及與療效相關(guān)宿主基因型檢測。3.2.1 病原體核酸定量（載量）檢測 病原體核酸定量檢測有助于評估疾病階段及嚴(yán)重程度，指導(dǎo)臨床合理用藥，觀察療效，監(jiān)測疾病進(jìn)程以及判斷疾病預(yù)后。例如HCV RNA檢測是判斷HCV有無現(xiàn)癥感染的證據(jù)；其病毒載量的高低與患者的長期預(yù)后如肝硬化和肝癌的發(fā)生相關(guān)，是進(jìn)行抗病毒治療的基礎(chǔ)，同時(shí)還是應(yīng)用抗病毒治療過程中

19、耐藥監(jiān)測的最重要指標(biāo)。應(yīng)根據(jù)抗病毒治療的早期病毒學(xué)應(yīng)答情況來調(diào)整治療方案，以提高療效，降低耐藥發(fā)生率。3.2.2 病原體分子分型檢測 由于不同型別病原體具有迥異的致病性和藥物敏感性，因此病原體分子分型檢測有助于指導(dǎo)臨床合理治療以及判斷疾病預(yù)后。例如HCV分為6個(gè)基因型和80多種基因亞型，不同基因型患者的病毒學(xué)應(yīng)答率差距明顯，如2、3及6型患者較易獲得持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答（SVR），而1和4型應(yīng)答較差，屬于難治性丙型肝炎，其利巴韋林的用藥劑量和用藥時(shí)間有顯著差別。因此在采用傳統(tǒng)方法治療前須進(jìn)行HCV基因型檢測，以便決定治療方案。目前，丙肝的臨床治療已取得重大進(jìn)展，一些小分子藥物對丙肝病毒無基因型要求，

20、并且臨床治愈率很高。宮頸癌早期癥狀不明顯，發(fā)展過程中存在較長的、可逆轉(zhuǎn)的癌前病變期。從一般的宮頸癌前病變發(fā)展為宮頸癌大約需要10年時(shí)間。如能在癌前病變階段進(jìn)行醫(yī)學(xué)干預(yù)，宮頸癌治愈率可達(dá)98%。多中心研究表明，我國宮頸癌及宮頸高危病變以感染HPV16和18型為主，約85%左右的宮頸癌確診病例屬于這兩種類型，且HPV16/18型的感染率和致癌率都明顯高于其他高危HPV型別。因此對高風(fēng)險(xiǎn)人群進(jìn)行HPV16/18等高危型篩查有助于宮頸癌的防治。3.2.3 病原體耐藥基因檢測所有產(chǎn)生耐藥的病原體，不論其產(chǎn)生的機(jī)制如何，均與病原體基因位點(diǎn)突變有關(guān)，因此進(jìn)行病原體耐藥基因檢測有助于早期指導(dǎo)臨床合理用藥，控制

21、耐藥病原體的流行。例如結(jié)核分枝桿菌對利福平耐藥與ropB位點(diǎn)突變有關(guān)；腸球菌對糖肽類抗生素的耐藥基因由Van A、Van B、Van C等介導(dǎo)，測定這些基因可以預(yù)測對萬古霉素和壁霉素的耐藥性。因此，應(yīng)根據(jù)耐藥基因突變情況來調(diào)整治療方案，以提高療效，避免耐藥發(fā)生。3.2.4 與療效相關(guān)的宿主基因型檢測宿主基因多態(tài)性可能對病原體的清除和治療產(chǎn)生影響。研究發(fā)現(xiàn)，IL28B的單核苷酸多態(tài)性（single-nucleotide polymorphism, SNP）與抗HCV療效密切相關(guān)，IL28B的基因型有助于臨床療效預(yù)測，確定慢性丙型肝炎患者的個(gè)體化治療方案，使病人獲得最大的收益。3.3 分子檢測在感

22、染性疾病個(gè)體化醫(yī)療應(yīng)用中的局限性綜上所述，個(gè)體化醫(yī)學(xué)分子檢測已日益廣泛地應(yīng)用于感染性疾病的診治過程，并取得了顯著成效。然而，在目前的臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用中，應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：影響分子檢測準(zhǔn)確性的因素很多，如實(shí)驗(yàn)室污染或是標(biāo)本間交叉污染可導(dǎo)致假陽性結(jié)果，擴(kuò)增抑制物或是標(biāo)本處理不充分可能導(dǎo)致假陰性的結(jié)果等。因此，必須建立規(guī)范化實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制體系和標(biāo)準(zhǔn)操作程序，并嚴(yán)格按照要求進(jìn)行檢測。盡管其具有敏感性高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，但其本身還有許多方面有待進(jìn)一步完善。如單次的分子檢測不能判斷是否為活的病原體；受多種因素影響，基因型耐藥和表型耐藥可能存在差異等。因此當(dāng)我們選擇分子檢測方法時(shí)，必須基于該種檢測結(jié)果的臨床價(jià)值

23、，需考慮結(jié)合其他檢測項(xiàng)目或檢測方法綜合判斷結(jié)果。感染性疾病的臨床診治常是極其錯(cuò)綜復(fù)雜的，僅依靠一項(xiàng)或幾項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室檢查還不夠，詳細(xì)的病史詢問，細(xì)致的體格檢查等綜合分析是極為重要的。4. 分析前質(zhì)量控制分子檢測分析前質(zhì)量控制包括填寫正確完整的檢驗(yàn)申請單，合理規(guī)范的標(biāo)本采集，適當(dāng)?shù)臉?biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)周期和轉(zhuǎn)運(yùn)條件，以及適宜的標(biāo)本預(yù)處理和分析前標(biāo)本保存等。感染性疾病個(gè)體化分子檢測通常檢測的是病原體的核酸，其濃度、穩(wěn)定性和完整性對檢驗(yàn)結(jié)果有決定性影響，因此為得到可靠和準(zhǔn)確的檢驗(yàn)結(jié)果，有必要規(guī)范分析前質(zhì)量控制的各項(xiàng)程序。病原微生物核酸檢測不同于其他分子檢測，有其自身的特點(diǎn)，在分析前階段主要包括：病原微生物核酸不僅存在

24、于血液、腦脊液等體液中，還存在于尿液、糞便等排泄物中，因此影響核酸純化的干擾物質(zhì)（如血紅素、尿素、pH值等）較多。病原微生物核酸受病原微生物生命周期、復(fù)制環(huán)境和患者用藥等情況的影響，所以要根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康恼_選擇檢驗(yàn)項(xiàng)目、標(biāo)本采集時(shí)間和標(biāo)本采集類型等。標(biāo)本采集和轉(zhuǎn)運(yùn)容器、標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存條件以及標(biāo)本處理方法等都會(huì)直接影響病原微生物核酸檢測。標(biāo)本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)及儲(chǔ)存需按照血源性病原體職業(yè)接觸防護(hù)導(dǎo)則、病原微生物實(shí)驗(yàn)室管理?xiàng)l例和實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求等相關(guān)生物安全要求進(jìn)行操作。鑒于病原微生物分子檢測的特殊性，有如下建議：4.1 正確、規(guī)范的標(biāo)本采集 感染性疾病是臨床的常見病，重癥感染有較高的病死率。正確的標(biāo)

25、本采集對感染的早期診斷和有效治療等有重要的臨床意義。 標(biāo)本采集原則 詳見個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量保證指南，但在感染性疾病個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測中尤其需注意以下幾點(diǎn)：采集標(biāo)本時(shí)應(yīng)使用嚴(yán)格的無菌技術(shù)，將污染的可能性降至最低；標(biāo)本采集時(shí)間由檢測目的決定，如在感染的急性期，應(yīng)在使用抗生素或傷口局部治療前采集標(biāo)本進(jìn)行基線檢測，再根據(jù)治療時(shí)間和循環(huán)病原微生物半衰期等確定再次采樣時(shí)間；在患者使用抗感染治療前，應(yīng)在發(fā)熱初期或高峰期或發(fā)熱前半小時(shí)采集標(biāo)本，對已使用抗感染治療而又不能停藥的患者，應(yīng)重復(fù)采集標(biāo)本數(shù)次以提高檢出率；采取適當(dāng)?shù)慕馄饰恢煤图夹g(shù)，防止標(biāo)本溶血等影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性；正確選擇采集/儲(chǔ)存容器，例如檢測的病原微

26、生物為RNA病毒（如HCV、HIV等），由于RNA易受RNA 酶的降解, 須使用經(jīng)高壓滅菌或經(jīng)RNase酶清除處理過的無RNase酶的一次性耗材。 確定正確的標(biāo)本量 為避免因病原體核酸濃度過低造成假陰性結(jié)果，應(yīng)根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康暮蜋z驗(yàn)方法的要求采集足夠量的標(biāo)本。例如利用支氣管肺泡灌洗液進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌核酸檢測時(shí)，至少要留取1ml支氣管肺泡灌洗液。 常用標(biāo)本類型 常用標(biāo)本包括血漿、血清、全血、支氣管肺泡灌洗液、骨髓、腦脊液、培養(yǎng)的細(xì)胞、培養(yǎng)的菌株、尿液、痰液、拭子、尿液、乳汁等。為避免標(biāo)本中核酸的降解，保證核酸的完整性和檢測的準(zhǔn)確性，對每種標(biāo)本的采集有以下建議，但具體要求由臨床需求和檢測目的決定： 血

27、液標(biāo)本 肝素是Taq 酶的強(qiáng)抑制劑，全血和血漿標(biāo)本宜選擇乙二胺四乙酸（EDTA）或枸櫞酸（ACD）鹽作為抗凝劑。鑒于注射器采血易導(dǎo)致溶血，建議采用真空負(fù)壓采血管采集血液標(biāo)本；采用帶有促凝劑的真空負(fù)壓采血管采集血清標(biāo)本。 呼吸系統(tǒng)標(biāo)本 痰液標(biāo)本應(yīng)以清晨第一口痰為宜，患者晨起用清水漱口數(shù)次，用力咳出深部痰液，混有血液為不合格樣品。留取至少1ml于無菌可密封標(biāo)本盒中。痰量少者可采用加溫45左右的10%氯化鈉溶液霧化吸入，使痰液容易排出。咽拭子應(yīng)用棉拭子采集患者咽后壁或懸雍垂的后側(cè)，反復(fù)涂抹數(shù)次。鼻咽拭子應(yīng)經(jīng)鼻腔進(jìn)入鼻咽部采集標(biāo)本，置于運(yùn)送培養(yǎng)基中送檢；鼻咽管應(yīng)用細(xì)鼻飼管從鼻腔進(jìn)入到鼻咽部，用負(fù)壓吸引

28、器吸取鼻咽部分泌物并放入無菌容器內(nèi)送檢。支氣管肺泡灌洗液應(yīng)留取至少1ml于無菌可密封試管中。 泌尿生殖系統(tǒng)標(biāo)本 尿液標(biāo)本：建議采集濃縮晨尿，至少10ml于無菌可密封試管中。應(yīng)考慮尿量、距上次排尿的時(shí)間、感染等因素對結(jié)果的影響。在應(yīng)用抗感染治療前或停藥1-2天后采集標(biāo)本，最好采集清晨第一次尿液或者采集在膀胱內(nèi)貯留6-8小時(shí)的尿液?？刹捎弥卸文蛞翰杉?、導(dǎo)尿采集法、膀胱穿刺法。宮頸和尿道拭子標(biāo)本：男性尿道標(biāo)本采用滌綸拭子，女性宮頸和陰道標(biāo)本采用人造纖維或滌綸拭子，并放入適當(dāng)?shù)幕|(zhì)液中。用于支原體分子檢測, 取材時(shí)一定要取到上皮細(xì)胞（沙眼衣原體在活細(xì)胞內(nèi)才能增殖復(fù)制），而只取分泌物會(huì)降低檢出率。宿主

29、細(xì)胞DNA比例、其他微生物、分泌物的量等可能會(huì)直接影響分子檢測結(jié)果。 其他體液標(biāo)本 胸腹水標(biāo)本：首次穿刺抽到積液后，應(yīng)棄掉第一管標(biāo)本及所用注射器，然后更換新的一次性注射器抽取。穿刺采集后留取中段液體于帶蓋的無菌試管內(nèi)，因積液易凝集，應(yīng)采用EDTA抗凝，同時(shí)注意防止外傷性血液的進(jìn)入。乳汁標(biāo)本：留取至少10ml。糞便標(biāo)本：留取有粘液或其他特征性糞便標(biāo)本于無菌可密封標(biāo)本盒中，不能混有尿液。腦脊液標(biāo)本：建議在留取化學(xué)和免疫學(xué)、細(xì)菌學(xué)、以及一般性狀等檢查標(biāo)本后，留取至少1ml腦脊液于無菌可密封試管中，以避免皮膚病菌污染和混入血液致溶血而影響檢測結(jié)果。組織標(biāo)本：淺表、開放性膿庖和創(chuàng)口應(yīng)清創(chuàng)后,使用拭子涂抹

30、創(chuàng)口；蜂窩織炎和丹毒應(yīng)使用穿刺針抽吸組織取樣；復(fù)雜性皮膚軟組織感染使用組織活檢、穿刺針抽吸、外科手術(shù)等方法取深層組織進(jìn)行檢測。 培養(yǎng)的細(xì)胞或菌株/毒株 在提取前最好放在37或其適宜生長的溫度或環(huán)境中；并嚴(yán)格按照相關(guān)生物安全要求進(jìn)行操作。4.2 標(biāo)本的轉(zhuǎn)運(yùn)4.2.1 標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)原則 詳見個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量保證指南，但在感染性疾病個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測中尤其需注意以下幾點(diǎn)：按照國家病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例進(jìn)行相應(yīng)病原微生物標(biāo)本的運(yùn)輸，如已知為HIV陽性標(biāo)本需由經(jīng)過相關(guān)培訓(xùn)并具有相應(yīng)資質(zhì)的人員使用WHO三級包裝系統(tǒng)的容器運(yùn)輸。如條件允許，建議盡快將標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行預(yù)處理或保存。根據(jù)檢驗(yàn)的靶基因和處

31、理前時(shí)間決定轉(zhuǎn)運(yùn)條件，如腦脊液標(biāo)本用于DNA檢測時(shí)應(yīng)2-8轉(zhuǎn)運(yùn)，用于RNA檢測時(shí)應(yīng)立即冰上轉(zhuǎn)運(yùn)。采用適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)方式和容器，以避免標(biāo)本污染，如采血管可采用氣動(dòng)傳送轉(zhuǎn)運(yùn)，但糞便標(biāo)本建議采用人工轉(zhuǎn)運(yùn)。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)評估標(biāo)本容器，確保其不會(huì)對所進(jìn)行的分析造成任何干擾。4.2.2 常見類型標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)要求4.2.2.1 血液標(biāo)本 全血標(biāo)本：如轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間在24小時(shí)內(nèi)可室溫轉(zhuǎn)運(yùn)，在2472小時(shí)內(nèi)則2-8轉(zhuǎn)運(yùn)；凍存樣本需用干冰轉(zhuǎn)運(yùn)。血漿、血清標(biāo)本：建議2-8轉(zhuǎn)運(yùn)；凍存樣本需用干冰轉(zhuǎn)運(yùn)。 腦脊液、胸腹水、支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本 用于DNA檢測的樣本，應(yīng)2-8轉(zhuǎn)運(yùn)；用于RNA檢測的樣本，應(yīng)立即冰上轉(zhuǎn)運(yùn)；凍存樣本需用干冰轉(zhuǎn)運(yùn)。

32、尿液、乳汁、糞便、宮頸和尿道拭子標(biāo)本 應(yīng)盡快轉(zhuǎn)運(yùn)，如環(huán)境溫度25，建議2-8轉(zhuǎn)運(yùn)。 痰液標(biāo)本 用于DNA檢測的標(biāo)本，如在30分鐘內(nèi)不能轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，建議2-8轉(zhuǎn)運(yùn)。 培養(yǎng)的細(xì)胞或菌株/毒株 最好放在37或其適宜生長的溫度或環(huán)境中轉(zhuǎn)運(yùn)；注意按照相關(guān)生物安全要求進(jìn)行操作。4.3 標(biāo)本的接收4.3.1 不合格標(biāo)本判斷標(biāo)準(zhǔn) 通用標(biāo)準(zhǔn) 標(biāo)本信息不正確、不完整（必要時(shí)應(yīng)包括詳盡的臨床信息和采集部位，以便于準(zhǔn)確地進(jìn)行臨床解釋）、標(biāo)本類型或標(biāo)本容器與檢驗(yàn)?zāi)康牟环?、?biāo)本量過少/過多、無采集時(shí)間、標(biāo)本有明顯的污染跡象（如已溢灑）、標(biāo)本采集后超過預(yù)處理時(shí)間送檢等。4.3.1.2 不合格標(biāo)本判斷標(biāo)準(zhǔn) 血液標(biāo)本溶血、乳

33、糜、嚴(yán)重黃疸等；體液標(biāo)本混有血液；痰標(biāo)本為褐色血痰或含有少量新鮮血液的血痰、唾液標(biāo)本（透明或半透明水樣、粘度較低、有時(shí)伴有氣泡）；固體培養(yǎng)物培養(yǎng)在非適當(dāng)?shù)墓腆w培養(yǎng)基、菌苔較少；液體培養(yǎng)物菌液濃度小于1個(gè)麥?zhǔn)蠞岫鹊取?讓步檢驗(yàn)標(biāo)本的接收標(biāo)準(zhǔn) 對于樣本量較少，能滿足檢驗(yàn)用量但不足樣本保存量的，且患者重新采樣存在困難的，與臨床科室溝通后予以接收。對于樣本有輕微乳糜或溶血，患者重新采樣存在困難或由于藥物等影響再次采樣仍會(huì)存在乳糜或溶血的，經(jīng)與臨床科室溝通堅(jiān)持檢驗(yàn)的，予以接收，記錄至當(dāng)日的工作日志，并在發(fā)送的檢驗(yàn)報(bào)告的備注中注明樣本情況。 當(dāng)標(biāo)本標(biāo)識不清或不全，但標(biāo)本再獲取困難或原始標(biāo)本中需檢測的核酸不

34、穩(wěn)定，可先接收標(biāo)本，待項(xiàng)目申請醫(yī)師或標(biāo)本采集人員識別了標(biāo)本信息，提供適當(dāng)?shù)男畔⒉⒋_定標(biāo)本所對應(yīng)的患者后再發(fā)送檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告。4.4 標(biāo)本的保存4.4.1 標(biāo)本保存的原則 詳見個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量保證指南，但在感染性疾病個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測中尤其需注意以下幾點(diǎn)：為保證核酸的完整性和穩(wěn)定性，選擇適宜的溫度保存。不能使用無霜冰箱保存標(biāo)本，要記錄冰箱溫度，如有條件可安裝冷鏈系統(tǒng)監(jiān)測冰箱溫度。使用適宜的容器保存標(biāo)本和預(yù)處理后的樣本，如血漿在有分離膠的采血管中凍存后會(huì)使HIV-1病毒載量檢測值假性升高，因此需離心分離出血漿后，轉(zhuǎn)移至無RNase酶的可密封容器中保存。反復(fù)凍融會(huì)降解核酸，因此避免反復(fù)凍融。如果有條件，

35、在用于RNA檢測的標(biāo)本采樣器中加入RNA穩(wěn)定劑凍存。DNA在TE（Tris-EDTA）中會(huì)更穩(wěn)定，室溫可保存26周，2-81年，-207年，-707年。保存病原微生物標(biāo)本的冰箱需雙人雙鎖，取用具有高致病性病原微生物標(biāo)本需申報(bào)，經(jīng)審批后按相應(yīng)生物安全要求操作。4.4.2 常見類型標(biāo)本保存條件血液標(biāo)本 全血標(biāo)本：室溫可保存24小時(shí)，保存2-8時(shí)應(yīng)在72小時(shí)內(nèi)提取DNA；建議在去除紅細(xì)胞后，-20或-70長期保存。血漿、血清標(biāo)本：如果4小時(shí)內(nèi)不能提取RNA，應(yīng)-70保存血漿。建議-20或-70長期保存。4.4.2.2 呼吸系統(tǒng)標(biāo)本 痰液標(biāo)本：如不能立即檢測應(yīng)在-70保存。用于分枝桿菌分子檢測需液化后

36、保存。支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本：如果24小時(shí)內(nèi)不能檢測，2-8可保存72小時(shí)，如近期不能檢測應(yīng)在-70保存。如進(jìn)行分枝桿菌檢測，應(yīng)在液化后保存。 其他體液標(biāo)本 腦脊液、胸腹水標(biāo)本：用于DNA檢測的樣本，如不能立即檢測應(yīng)在-20或-70保存。用于RNA檢測的樣本，應(yīng)在1-4小時(shí)內(nèi)提?。蝗缃诓荒軝z測，應(yīng)在去除紅細(xì)胞后立即凍存。宮頸和尿道拭子標(biāo)本：用于DNA檢測的樣本2-8保存10天。尿液、乳汁、糞便標(biāo)本：建議采集后保存在2-8，并盡快提取核酸。 培養(yǎng)的細(xì)胞或菌株/毒株 在檢測前最好放在37或其適宜生長的溫度或環(huán)境中，注意按照相關(guān)生物安全要求進(jìn)行操作。4.5 正確選擇檢驗(yàn)項(xiàng)目 根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康暮侠磉x擇，包

37、括根據(jù)患者的診治情況正確選擇各檢驗(yàn)項(xiàng)目的檢測時(shí)機(jī)和頻次，根據(jù)臨床意義選擇正確的標(biāo)本類型，根據(jù)不同標(biāo)本情況正確選擇檢測方法、判斷檢測結(jié)果等。 正確選擇檢測時(shí)機(jī)和頻次 一般情況下，病原體核酸定量檢測應(yīng)根據(jù)病原體感染的自然史，在進(jìn)行用藥指導(dǎo)、治療或者療效預(yù)測時(shí)進(jìn)行檢測。例如HBV DNA定量檢測應(yīng)在抗病毒治療前進(jìn)行基線檢測，再根據(jù)治療效果的不同，每3個(gè)月或6個(gè)月進(jìn)行隨訪檢測。病原體基因型和耐藥基因檢測，通常在進(jìn)行用藥指導(dǎo)、治療或者病原體核酸數(shù)量反彈時(shí)進(jìn)行檢測，一般檢測一次即可，但如果存在再次感染或更換治療方案時(shí)，可能需要再次進(jìn)行檢測。與療效相關(guān)的宿主基因型檢測，通常在進(jìn)行用藥指導(dǎo)或治療時(shí)進(jìn)行，檢測一

38、次即可。 根據(jù)臨床意義選擇正確的標(biāo)本類型 不同標(biāo)本類型中的病原體可能是處在不同生命周期中的病原體，其分子檢測的臨床意義可能不同。例如外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）可用于檢測HIV整合入宿主基因組的前病毒DNA（即潛伏病毒），而血漿用于檢測HIV的病毒RNA（即游離病毒），在對HIV感染產(chǎn)婦所生的未滿18個(gè)月的嬰幼兒進(jìn)行早期診斷時(shí)，應(yīng)選擇HIV DNA檢測，以免受到母親以及嬰幼兒預(yù)防性抗病毒治療的干擾而影響診斷。 根據(jù)標(biāo)本類型正確判斷檢測結(jié)果 不同的標(biāo)本類型可能導(dǎo)致檢測結(jié)果有顯著差異，這些差異將影響臨床決策，因此要依據(jù)臨床需要選擇正確的標(biāo)本類型，如EBV在全血中的病毒載量比血漿高1個(gè)log。5.

39、感染性疾病相關(guān)個(gè)體化醫(yī)學(xué)分子檢測的分析中質(zhì)量控制5.1 實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)要求 參見醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法等相關(guān)要求，同時(shí)需根據(jù)病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例和人間傳染的病原微生物名錄對所檢測的病原微生物進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估，然后在相應(yīng)生物安全級別的實(shí)驗(yàn)室按照實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求和血源性病原體職業(yè)接觸防護(hù)導(dǎo)則等衛(wèi)生法律法規(guī)和各項(xiàng)生物安全管理規(guī)范開展檢測工作。例如結(jié)核分枝桿菌分子檢測，如僅涉及少量活菌可在BSL-2級實(shí)驗(yàn)室開展，但如果需要先進(jìn)行培養(yǎng)，則需要在BSL-3級實(shí)驗(yàn)室開展。5.2 常用的分子檢測方法5.2.1 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）5.2.1.1 基本原理 PCR技術(shù)的基本原理類似于

40、DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性退火延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至95左右一定時(shí)間后，模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離成為單鏈，它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備。模板DNA與引物的退火：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至最佳退火溫度，引物與模板DNA單鏈以互補(bǔ)序列配對結(jié)合。引物的延伸：DNA模板引物結(jié)合物在72條件下、利用DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性退火延伸

41、三過程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需24分鐘，23小時(shí)就能 將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。 主要類型及臨床應(yīng)用5.2.1.2.1 定性檢測 定性檢測包括病原體分子分型、耐藥基因突變及宿主基因型檢測。 等位基因特異性PCR（allele specific-PCR, ASO-PCR）：又稱作ARMS（amplification refractory mutation system）或PASA（PCR amplification）。基本原理：根據(jù)基因變異位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異引物，其中一條鏈（特異鏈）的3末端與突變位點(diǎn)的堿基互補(bǔ)，另一條鏈（通用鏈）按常規(guī)

42、方法設(shè)計(jì)。因?yàn)樘禺愐镌谧儺惢蛐椭杏袛U(kuò)增產(chǎn)物，在野生型中沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，用凝膠電泳能夠很容易地分辨出擴(kuò)增產(chǎn)物的有無，從而確定有無突變基因型。常用的結(jié)果分析方法：a)瓊脂糖凝膠電泳。b)聚丙烯酰胺凝膠電泳。主要特點(diǎn)：對實(shí)驗(yàn)條件要求較低，操作簡單易行，成本低，重復(fù)性好，所需DNA的量較少且對DNA質(zhì)量要求較低；但對引物設(shè)計(jì)要求較高，且僅能進(jìn)行已知突變檢測。2 多重PCR（multiplex PCR）基本原理：多重PCR在同一PCR反應(yīng)體系里加上二對以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR。常用的結(jié)果分析方法：毛細(xì)管電泳法（capillary electrophoresis, CE）又稱高效毛細(xì)管電

43、泳（high performance capillary electrophoresis, HPCE）：是利用離子的電泳遷移率不同，在電場中移動(dòng)的速度不同，從而將不同的離子分離。高效液相色譜層析（high performance liquid chromatography, HPLC）：溶于流動(dòng)相的各組分在經(jīng)過固定相時(shí)，與固定相發(fā)生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強(qiáng)弱不同，導(dǎo)致在固定相中滯留的時(shí)間不同，由此判斷待測物。單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析（single-strand conformational polymorphism, SSCP）：是利用不同空間構(gòu)型的DNA分子，在凝膠電泳中

44、的泳動(dòng)速率不同，從而區(qū)分變異的DNA分子。主要特點(diǎn)：多重PCR經(jīng)濟(jì)簡便，多種病原體在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢出，將大大地節(jié)省時(shí)間，且節(jié)約開支；但特異性會(huì)有所降低，且僅能進(jìn)行已知突變檢測。3 長距離反向PCR（long distance inverse PCR, LD-IPCR）基本原理：根據(jù)已知的核心DNA去末端序列設(shè)計(jì)兩條引物，使兩引物3端相互反向。擴(kuò)增前先用限制性內(nèi)切酶酶切樣品DNA，然后用DNA連接酶連接成一個(gè)環(huán)狀DNA分子，通過反向PCR擴(kuò)增引物的上游片段和下游片段，從而獲得引物外側(cè)的DNA片段。常用的結(jié)果分析方法：脈沖場凝膠電泳（PFGE）：利用定時(shí)改變電場方向的交變電源以分離大分子DNA

45、。標(biāo)記寡核苷酸探針：針對待測基因設(shè)計(jì)相應(yīng)的特異性標(biāo)記寡核苷酸探針，使其在固相或液相中與擴(kuò)增產(chǎn)物反應(yīng)，檢測相應(yīng)的熒光信號即可判斷待測樣本的基因型。主要特點(diǎn)：LD-IPCR適用于較長序列的分析，且不需預(yù)知待分析序列的具體結(jié)構(gòu)；但方法較為復(fù)雜，需要特殊儀器。4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR或real-time PCR）基本原理：實(shí)時(shí)熒光定量PCR是指在PCR反應(yīng)中引入一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)產(chǎn)物不斷累積，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。基于檢測PCR擴(kuò)增周期每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上擴(kuò)增產(chǎn)物的量，通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量，從而實(shí)現(xiàn)對起始模板定性或定量檢測。根據(jù)使用的熒光標(biāo)記類型可分為探針類和非探針

46、兩大類。非探針類是利用非特異性的插入雙鏈DNA的熒光結(jié)合染料或者特殊設(shè)計(jì)的引物來指示擴(kuò)增的增加。探針類則是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加。前者簡便易行，而后者由于增加了探針的互補(bǔ)識別步驟，特異性更高。常用的特異性熒光探針及其特點(diǎn)：TaqMan探針：是目前臨床應(yīng)用最廣泛的探針之一。TaqMan是一類寡核苷酸探針，依據(jù)目標(biāo)DNA序列的上游引物和下游引物之間的序列配對來設(shè)計(jì)。探針的5-端用報(bào)告熒光染料（reporter fluorescence dye，R）標(biāo)記，3-端則標(biāo)記淬滅染料（quencher dye，Q）。當(dāng)完整的探針與目標(biāo)序列配對時(shí)，5-端報(bào)告熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3-端

47、的淬滅劑接近而被淬滅。但隨著PCR延伸，DNA聚合酶的5-端外切酶活性將探針切開，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離，報(bào)告基團(tuán)的熒光得以釋放而被檢測。TaqMan MGB探針：是在TaqMan探針基礎(chǔ)上改進(jìn)而來的，其3端不是淬滅基團(tuán)而是一種非熒光淬滅劑，另外3端還增加了一個(gè)小溝結(jié)合分子MGB，該分子能夠結(jié)合在雙鏈DNA小溝部位，從而使探針與模板緊密結(jié)合。MGB的存在提高了探針的Tm值，一般12-17bp的探針在MGB的作用下Tm值可升高15-30，從而使它能夠分辨單個(gè)堿基的差別；而且連在MGB分子后的是非熒光物質(zhì)的淬滅基團(tuán)，因此這種探針具備更好的淬滅效果，且具有無背景熒光、熒光標(biāo)記靈活、提高熒光信號的信

48、噪比等優(yōu)點(diǎn)。分子信標(biāo)（molecular beacon）：是一種莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙標(biāo)記寡核苷酸探針，位于分子一端的熒光基團(tuán)與分子另一端的淬滅基團(tuán)靠近。不存在模板時(shí)，探針呈莖環(huán)結(jié)構(gòu)；存在模板時(shí)，莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開與模板配對，構(gòu)象改變使得熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分開，釋放熒光。分子信標(biāo)也有缺點(diǎn)，即探針匹配的是基因內(nèi)部序列，不一定在每個(gè)基因上都能找到長短適中且?guī)в心┒嘶匚慕Y(jié)構(gòu)的序列，所以分子信標(biāo)的探針設(shè)計(jì)要求較高。該方法檢測的特異性高于TaqMan等線性探針，較適用于基因點(diǎn)突變的鑒定。蝎形探針:是一種雙分子實(shí)時(shí)熒光檢測體系，具有反應(yīng)迅速、熒光強(qiáng)度高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)。該方法中引物與探針的功能被綜合到同一段寡核苷酸序列上

49、。雙雜交探針：該方法的特點(diǎn)是淬滅效率高，特異性強(qiáng)，但由于兩個(gè)探針結(jié)合于模板上，故影響了擴(kuò)增效率。此外，探針合成成本也相對較高。常用的非探針類熒光標(biāo)記及其特點(diǎn)雙鏈DNA交聯(lián)熒光染料，通常指SYBR Green或LC Green TM染料，SYBR Green I能結(jié)合到DNA雙螺旋到小溝。在加入過量到SYBR熒光染料到PCR體系中，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺氲疆a(chǎn)物的DNA雙鏈，發(fā)射熒光信號，而未摻入DNA鏈中的染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。由于它與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，不必因?yàn)槟０宀煌貏e定制，因此設(shè)計(jì)的程序通用性好，且價(jià)格相對較低。但是，

50、內(nèi)嵌染料沒有序列特異性，可以結(jié)合到包括非特異產(chǎn)物、引物二聚體、單鏈二級結(jié)構(gòu)以及錯(cuò)誤的擴(kuò)增產(chǎn)物上，造成假陽性而影響定量的精確性。高分辨熔解曲線分析（high resolution melting, HRM）及其特點(diǎn)是根據(jù)DNA序列的長度、GC含量以及堿基互補(bǔ)性差異，應(yīng)用高分辨率的熔解曲線對樣品進(jìn)行分析。高分辨熔解對DNA序列的識別能力主要由三個(gè)因素所決定：檢測儀器的分辨率、雙鏈DNA嵌入型染料的種類和PCR產(chǎn)物的純度。其優(yōu)點(diǎn)是高通量、快速、高靈敏度、閉管檢測以防止污染造成的假陽性，但此方法對儀器要求較高。5 PCR-限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP）基本原理：根據(jù)DNA在限制性內(nèi)切酶酶

51、切后形成的特定DNA片段的大小，判斷待測樣品的基因特征。主要特點(diǎn)：簡便易行，但僅能識別位于酶切位置內(nèi)的突變，而且凝膠電泳的結(jié)果僅能判斷產(chǎn)物的大概長度，是非特異性的方法。目前對同一病原體檢測時(shí)應(yīng)用哪一種限制內(nèi)切酶仍沒有一致意見，因此質(zhì)量控制比較難實(shí)現(xiàn)。6 PCR-核酸序列分析技術(shù)Sanger測序技術(shù)（雙脫氧鏈終止法）：是廣泛應(yīng)用的第一代DNA測序技術(shù)的典型代表。通常情況下，要測序的DNA先進(jìn)行核酸擴(kuò)增，之后進(jìn)行測序反應(yīng)。測序反應(yīng)中除了加入4種正常的脫氧核苷三磷酸（dNTP）外，還加入一種少量的2,3-雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP），當(dāng)ddNTP位于鏈延伸末端時(shí)，由于它沒有3- OH，不能再與其它

52、的脫氧核苷酸形成3,5-磷酸二酯鍵，DNA合成便在此處終止，如果此處摻入的是一個(gè)ddATP，則新生鏈的末端就是A，依次類推可以通過摻入ddTTP、 ddCTP、 ddGTP ，則新生鏈的末端為T、C或G。Sanger測序技術(shù)可以獲得未知待分析序列的具體結(jié)構(gòu)，是確定基因序列的金標(biāo)準(zhǔn)，但它的準(zhǔn)確率仍然無法達(dá)到100%，大約2%的堿基無法被Sanger法測序所識別。因?yàn)橥康木壒?，它在大基因和多基因的檢測方面效率很低。焦磷酸測序技術(shù)（pyrosequencing）：是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。當(dāng)引物與模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸

53、化酶（ATP sulfurytase）、熒光素酶（luciferase）和三磷酸腺苷雙磷酸酶（Apyrase）4種酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個(gè)dNTP的聚合與一次熒光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測熒光的釋放和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)測定DNA序列的目的。焦磷酸測序技術(shù)是一種新型的酶聯(lián)級聯(lián)測序技術(shù)，其重復(fù)性和精確性可與Sanger測序相媲美，而測序速度則大大提高，非常適合對已知的短序列進(jìn)行測序分析；但對未知序列分析上，該方法的測序長度明顯短于Sanger法。高通量測序技術(shù)：又稱“下一代”測序技術(shù)（Next-generation sequencing technology, NGS），以能一次并行對幾十萬到

54、幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定和一般讀長較短等為標(biāo)志。不同廠家的產(chǎn)品測序原理不同，主要分為邊合成邊測序（Sequencing by synthesis，SBS）、基于“DNA簇”和“可逆性末端終結(jié)（Reversible Terminator）大規(guī)模平行測序、4色熒光標(biāo)記寡核苷酸的連續(xù)連接反應(yīng)測序和半導(dǎo)體芯片測序。與Sanger測序技術(shù)相比，新一代測序平臺最大的變化是無需克隆這一繁瑣的過程，而是使用接頭進(jìn)行高通量的并行PCR、測序反應(yīng)，并結(jié)合微流體技術(shù)，利用高性能的計(jì)算機(jī)對大規(guī)模的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接和分析。接頭的運(yùn)用，使得高通量測序技術(shù)不再局限于單純的基因組測序，而是作為一個(gè)平臺，可以開展全基因表

55、達(dá)圖譜分析、SNP、小RNA、ChIP、DNA甲基化等諸多研究。目前尚未在臨床廣泛應(yīng)用。7 PCR-基因芯片技術(shù)基本原理：又稱微列陣技術(shù)，是一種大規(guī)模集成的固相雜交（反向點(diǎn)雜交），即依據(jù)DNA雙鏈堿基互補(bǔ)配對、變性和復(fù)性的原理，以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作探針，檢測樣品中哪些核酸序列與其互補(bǔ)，分析得出待測樣品的基因信息。主要特點(diǎn)：一張芯片可同時(shí)對多名患者進(jìn)行多種疾病的檢測，通量較高；待測樣品用量少；靈敏度高，特異性好。5.2.1.2.2 定量檢測 定量檢測包括病原體核酸定量檢測。 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR或real-time PCR）基本原理：基于檢測PCR擴(kuò)增周期每個(gè)時(shí)

56、間點(diǎn)上擴(kuò)增產(chǎn)物的量，通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量從而實(shí)現(xiàn)對起始模板進(jìn)行定量。外標(biāo)法定量：參考基因或標(biāo)準(zhǔn)物與待測標(biāo)本在不同的反應(yīng)管里平行擴(kuò)增，則這樣的參考基因或標(biāo)準(zhǔn)物稱為外標(biāo)。利用外標(biāo)進(jìn)行PCR反應(yīng)的方法叫外標(biāo)法。外標(biāo)法操作簡便，檢測范圍廣泛；但管間擴(kuò)增效率的差異會(huì)可能影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，且難以排除假陰性結(jié)果。內(nèi)標(biāo)法定量：參考基因或標(biāo)準(zhǔn)物與待測標(biāo)本在同一個(gè)反應(yīng)管里擴(kuò)增，則這樣的參考基因或標(biāo)準(zhǔn)物稱為內(nèi)標(biāo)。利用內(nèi)標(biāo)進(jìn)行PCR反應(yīng)的方法叫內(nèi)標(biāo)法。內(nèi)標(biāo)法可以監(jiān)控整個(gè)反應(yīng)過程，但使PCR反應(yīng)變?yōu)殡p重PCR，可能會(huì)出現(xiàn)競爭現(xiàn)象。2 數(shù)字PCR（digital PCR, dPCR）數(shù)字PCR是一種基于單分子PCR方法來進(jìn)行計(jì)數(shù)的核酸絕對定量的方法。主要采用微流控或微滴化方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器或微滴中，每個(gè)反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于或者等于1個(gè)。經(jīng)過PCR循環(huán)之后，有一個(gè)核酸分子模板的反應(yīng)器就會(huì)給出熒光信號，沒有模板的反應(yīng)器就沒有熒光信號。根據(jù)相對比例和反應(yīng)器的體積，推算出原始溶液的核酸濃度。 轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增系統(tǒng)（TMA）轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增系統(tǒng)是一種利用Money鼠白血病病毒（MMLV）逆轉(zhuǎn)