文冠果殼苷對側(cè)腦室注射Aβ1-42 致癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用

1、文冠果殼苷對側(cè)腦室注射A1-42 致癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用鄒莉波1，王立華2，遲天燕1，紀(jì)雪飛1，李偉1，李曉春1，付琪1，楊柏珍2（1.沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，沈陽110016；2.中科院沈陽生態(tài)研究所，沈陽110016）摘 要目的：本論文以側(cè)腦室注射A1-42 致癡呆小鼠為模型，考察了文冠果殼苷對癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用，并從抗氧化損傷角度探討了文冠果殼苷對抗A1-42 致癡呆作用的機(jī)制。方法：采用小鼠新物體辨別、水迷宮、避暗等行為學(xué)測試方法研究文冠果殼苷改善學(xué)習(xí)記憶障礙的作用，用生化學(xué)方法檢測腦組織總抗氧化能力（T-AOC）、GSH/GSSG比值、MDA

2、含量及CAT活性。結(jié)果：文冠果殼苷( 0.08 0.32mg/kg ) 顯著延長新物體辨別實(shí)驗(yàn)中對新物體探索時(shí)間并提高優(yōu)先指數(shù)；顯著縮短水迷宮試驗(yàn)中小鼠到達(dá)安全臺的時(shí)間；顯著減少避暗實(shí)驗(yàn)中的錯(cuò)誤次數(shù)，延長潛伏期，縮短總電擊時(shí)間。生化檢測結(jié)果表明，文冠果殼苷顯著提高模型小鼠大腦組織中CAT活性及T-AOC，減少M(fèi)DA含量、增加GSH含量并提高GSH/GSSG比值。結(jié)論：綜上所述，文冠果殼苷能顯著改善側(cè)腦室注射A1-42 致癡呆模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙，其作用機(jī)制可能與對抗自由基損傷、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)等有關(guān)。關(guān)鍵詞：文冠果殼苷；A1-42；阿爾茨海默病；抗氧化阿爾茨海默病（Alzheimers d

3、isease, AD）的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多種神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙1，而現(xiàn)有的治療藥物絕大多數(shù)作用機(jī)制比較單一，如AChE抑制劑等，臨床療效有限，因此，尋找具有綜合治療作用的抗癡呆新藥仍是當(dāng)今醫(yī)藥界有待攻破的一大難題。文冠果 (Xanthoceras sorbifolia Bge) 為無患子科文冠果屬植物。一屬一種，為我國特有種，在我國東北、華北、西北都有栽培，資源豐富。文冠果果仁與果殼產(chǎn)量比為10:810:9，果殼產(chǎn)量很大，因尚未被研究利用，基本上屬廢棄物。文冠果殼苷（Xanthoceraside）即是一種從文冠果果殼中提取的三萜皂苷類化合物。前期研究結(jié)果表明2，文冠果殼苷能拮抗東莨菪堿、亞硝酸

4、鈉、40% 乙醇所致的記憶獲得、鞏固、再現(xiàn)和空間辨別障礙；顯著改善側(cè)腦室注射A25-35致癡呆模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙，并顯著提高模型小鼠腦內(nèi)的SOD及GSH-Px活性。本論文在前期工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察文冠果殼苷對A1-42致癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用及機(jī)制，為文冠果殼苷開發(fā)成治療AD的新型藥物提供依據(jù)。 1. 實(shí)驗(yàn)材料1.1藥品與試劑文冠果殼苷 ( Xanthoceraside )：由中科院生態(tài)所提供；銀杏葉片：深圳海王藥業(yè)有限公司，批號20070704；Amyloid (1-42) fragment：北京博奧森生物技術(shù)有限公司；微量丙二醛 ( MDA ) 測試盒、氧化型谷胱甘肽

5、( GSSG ) 及還原型谷胱甘肽 ( GSH ) 測試盒、過氧化氫酶 ( CAT ) 測試盒、總抗氧化能力 ( TAOC ) 測試盒，均購自南京建成生物工程研究所。1.2實(shí)驗(yàn)動物昆明種小白鼠，雄性，體重24-28 g，由沈陽藥科大學(xué)動物中心提供，合格證號：SCXK（遼）2004-008。1.3實(shí)驗(yàn)儀器722S分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；UV-2000型熒光分光光度計(jì)，尤尼柯(上海) 儀器有限公司； JY92-超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)及DY89-電動玻璃勻漿機(jī)，寧波新芝生物科技有限公司；J2-HS型低溫超速離心機(jī)，美國BECKMAN；行為學(xué)實(shí)驗(yàn)裝置：小鼠避暗、水迷路、新物體辨別裝置均為定制。

6、 2. 實(shí) 驗(yàn) 方 法2.1 動物模型的建立3及實(shí)驗(yàn)方案取雄性昆明種小白鼠，體重2530 g。將小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，包括假手術(shù)組，模型組，銀杏葉片31.2 mg/kg組，文冠果殼苷0.08、0.16、0.32 mg/kg組。將小鼠用3.5%的水合氯醛( 10 ml/kg )麻醉后，參考文獻(xiàn)3，4 方法，除對照組外，每組小鼠均側(cè)腦室一次性注入5L凝聚態(tài)A1-42（含A1-42 410 pmol，以無菌生理鹽水溶解，37 120 h使其成凝聚態(tài)），留針1min，對照組小鼠同法側(cè)腦室給與等體積溶劑（1135的DMSO生理鹽水）。造模即日起開始給藥，至行為學(xué)測試結(jié)束。給藥后第8-9天進(jìn)行新物

7、體辨別實(shí)驗(yàn)，第10-14天進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，第15-16天進(jìn)行避暗實(shí)驗(yàn)，末次給藥后，斷頭取腦勻漿，測定各種生化指標(biāo)。2.2 新物體辨別實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)4進(jìn)行。用測試期對新物體的優(yōu)先指數(shù)來反應(yīng)小鼠的記憶能力。新物體優(yōu)先指數(shù)是探索新物體的時(shí)間占測試期探索總時(shí)間的百分比。2.3 小鼠水迷宮法參照文獻(xiàn)5進(jìn)行。每只小鼠每天訓(xùn)練10次，間隔30s。以30s內(nèi)到達(dá)安全區(qū)為正確反應(yīng)。記錄小鼠到達(dá)安全區(qū)的時(shí)間，計(jì)算每天的平均時(shí)間和正確反應(yīng)次數(shù)。2.4 避暗法 參照文獻(xiàn)6進(jìn)行。記錄24h后測驗(yàn)期第一次進(jìn)入暗室的潛伏期、5min內(nèi)的錯(cuò)誤次數(shù)和總電擊時(shí)間，以此作為記憶成績。3. 實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果3.1文冠果殼苷對側(cè)腦室注射A

8、1-42 致癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用 水迷宮實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，與溶劑對照組相比，模型組在水迷宮實(shí)驗(yàn)的第二天開始到達(dá)安全臺的游泳時(shí)間顯著延長。與模型組相比，文冠果殼苷各組劑量依賴性地縮短到達(dá)安全臺的游泳時(shí)間。05101520253035the second daythe third day the fourth day the fifth dayLatency (s)VehicleModel Yinxing0.08mg/kg0.16mg/kg0.32mg/kgFig.1. Effect of Xanthoceraside on swimming time in water maz

9、e test in mice with i.c.v. A1-42 ( n = 8-10, x ± sd )3.1.2 新物體辨別實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各組小鼠在訓(xùn)練期對兩個(gè)相同物體的探究時(shí)間無顯著差異；測試期模型組小鼠對新物體和舊物體的探究時(shí)間仍基本相同，而溶劑對照組、銀杏葉片組和文冠果殼苷 0.32mg/kg 組小鼠對新物體的探究時(shí)間顯著延長；對新物體的優(yōu)先指數(shù)顯著增加，與模型組相比有顯著差異 ( 見表 1)。Table 1. Effect of Xanthoceraside on preferential index for object 1 or new object in the

10、 novel object recognition in mice with i.c.v. A 1-42 ( n = 10-15, x ± sd ). Training Phase Testing Phase Dose Group ( mg/kg ) Preferential index for object 1 Preferential index for the novel objectVehicle 0.56 ± 0.06 0.65 ± 0.06 Model 0.52 ± 0.16 0.44 ± 0.06# Yinxing 31.2 0.

11、49 ± 0.12 0.64 ± 0.13*Xanthoceraside 0.08 0.43 ± 0.05 0.57 ± 0.07* 0.16 0.46 ± 0.14 0.61 ± 0.10* 0.32 0.53 ± 0.12 0.65 ± 0.13* #P<0.001 vs. vehicle group; *P<0.001 vs. model group.3.1.3 避暗實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與溶劑對照組相比，模型組測試階段潛伏期顯著縮短，錯(cuò)誤次數(shù)顯著增加，總電擊時(shí)間顯著延長。與模型組相比，文冠果殼苷0.

12、32、0.16 mg/kg及銀杏葉片組均能夠顯著延長潛伏期，并減少錯(cuò)誤次數(shù)和總電擊時(shí)間 ( 見表2 )。Table 2. Effect of Xanthoceraside on latency in step-through test in mice with i.c.v. A 1-42 ( n = 12-16, x ± sd ) Group Dose ( mg/kg ) Latency ( s ) Vehicle 224.07 ± 117.25Model 49.53 ± 95.40#Yinxing 31.2 135.64 ± 120.95*Xantho

13、ceraside 0.08 125.43 ± 124.06 0.16 184.80 ± 124.46* 0.32 187.47 ± 115.52*#P <0.001 vs. vehicle group; *P <0.05, *P <0.01 vs. model group3.2 文冠果殼苷抗氧化作用研究3.2.1文冠果殼苷對側(cè)腦室注射A1-42致癡呆模型小鼠T-AOC的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示：與溶劑對照組相比，模型組小鼠T-AOC顯著降低。與模型組比較，文冠果殼苷0.16mg/kg, 0.32mg/kg組及銀杏葉片組T-AOC顯著升高。Xanth

14、oceraside Yinxingmg/kgFig.2. Effect of Xanthoceraside on the T-AOC in the brain of mice with i.c.v. A1-42 ( n = 8-10, x ± sd ). #P < 0.05 vs. vehicle group; *P < 0.05, *P < 0.01 vs. model group.3.2.2 文冠果殼苷對側(cè)腦室注射A1-42致癡呆模型小鼠GSH 、GSSG含量的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3、圖4所示，與溶劑對照組相比，模型組小鼠腦組織GSSG含量未見顯著改變， 但GSH含

15、量及GSH/GSSG 顯著降低。與模型組比較，文冠果殼苷0.16mg/kg，0.32mg/kg 組及銀杏葉組小鼠腦組織GSSG含量未見顯著改變，但GSH含量及GSH/GSSG 顯著升高。XanthocerasideYinxingmg/kgFig.3. Effect of Xanthoceraside on the content of GSH in the brain of mice with i.c.v.A1-42 ( n = 8-10, x ± sd ). #P < 0.05 vs. vehicle group; *P < 0.05 vs. model group.X

16、anthocerasideYinxingmg/kgFig. 4. Effect of Xanthoceraside on the ratio of GSH/GSSG in the brain of mice with i.c.v.A1-42 ( n =8-10, x ± sd ). #P < 0.01 vs. vehicle group; *P < 0.05, *P < 0.01 vs. model group.3.2.3文冠果殼苷對側(cè)腦室注射A1-42致癡呆模型小鼠過氧化氫酶 (CAT) 活力的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示：與溶劑對照組相比，模型組小鼠CAT活力顯著降低

17、。與模型組比較，文冠果殼苷0.32mg/kg 組，銀杏葉片組CAT 活力顯著升高。XanthocerasideYinxingmg/kgFig.5. Effect of Xanthoceraside on the CAT activity in the brain of mice with i.c.v. A1-42 ( n = 8-10, x ± sd ). #P < 0.01 vs. vehicle group; *P < 0.05 vs. model group.3.2.4 文冠果殼苷對側(cè)腦室注射A1-42致癡呆模型小鼠MDA含量的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示：與溶劑對照組相

18、比，模型組小鼠MDA含量顯著升高。與模型組比較，文冠果殼苷0.08mg/kg, 0.16mg/kg, 0.32mg/kg 組及銀杏葉片組MDA含量顯著降低。XanthocerasideYinxingmg/kgFig.6. Effect of Xanthoceraside on the content of MDA in the brain of mice with i.c.v.A1-42 ( n = 8-10, x ± sd ).#P < 0.05 vs. vehicle group; *P < 0.05, *P < 0.01 vs. model group.4.

19、討論有研究表明，氧自由基與A神經(jīng)毒性有關(guān)，應(yīng)用多光子成像技術(shù)，在AD轉(zhuǎn)基因鼠及AD患者的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)都提示A沉積與氧自由基的產(chǎn)生有直接關(guān)系，A沉積所形成的淀粉樣斑塊聚集物內(nèi)有大量的氧自由基產(chǎn)生。A的神經(jīng)毒性作用所致的細(xì)胞氧自由基損傷主要有以下途徑： A本身可作為氧自由基供體，產(chǎn)生活性氧； A可通過誘導(dǎo)使氧自由基產(chǎn)生； A通過與特異的受體結(jié)合激活小膠質(zhì)細(xì)胞，產(chǎn)生大量自由基，加劇氧化應(yīng)激。氧自由基對A的聚集也有重要作用，A肽段的某些氨基酸易受自由基攻擊，并使蛋白質(zhì)分子交聯(lián)；A的第 35 位氨基酸蛋氨酸( Met35 ) 在疏水區(qū)的中部，氧化的 Met35 含有更極性化的基團(tuán)，使A聚集加速。A亦通過影

20、響腦突觸后膜上腺苷酸環(huán)化酶的活性,調(diào)節(jié) G 蛋白偶聯(lián)的信號傳導(dǎo)影響氧自由基代謝。綜上所述，AD 腦組織中氧自由基代謝發(fā)生紊亂，A可以看作是氧化應(yīng)激與AD腦神經(jīng)元死亡之間的偶聯(lián)分子7。我們前期研究結(jié)果表明，文冠果殼苷能夠拮抗東莨菪堿、亞硝酸鈉、40% 乙醇所致的記憶獲得、鞏固、再現(xiàn)和空間辨別障礙；顯著改善側(cè)腦室注射A25-35致癡呆模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙，并顯著提高模型小鼠腦內(nèi)的SOD及GSH-Px活性。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明文冠果殼苷在微克級的劑量下能夠顯著改善A1-42致癡呆模型小鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙及物體辨別記憶障礙；顯著降低腦組織中MDA含量，提高GSH/GSSG比值，增加總抗氧化能力，提高CA

21、T活力。上述結(jié)果提示，文冠果殼苷改善A1-42致癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的作用可能與其抗自由基損傷有關(guān)。參考文獻(xiàn)1 PARIHAR M.S., HEMNANI T. Alzheimers disease pathogenesis and therapeutic interventionsJ. Journal of Clinical Neuroscience, 2004, 11(5 ): 456 - 467.2 LIU X , YANG X A, QU C, et al. Effects of extract of the husk of Xanthoceras sorbifolia Bunge

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26、ceZOU Li-Bo1*, WANG Li-Hua2, CHI Tian-Yan1, JI Xue-Fei 1, LI Wei1, LI Xiao-Chun1, FU Qi1, YANG Bai-Zhen2 (1. Department of Pharmacology, School of Life Science and Biopharmaceutics, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang110016, China; 2.Institute of Applied Ecology, Chinese Academy of Sciences

27、, Shenyang110016, China)OBJECTIVE: To investigate the improving effect of Xanthoceraside on learning and memory impairment induced by i.c.v. A1-42 in mice. METHOD: Object recognition test, water maze task and step-through test were used to evaluate the learning and memory function of mice. The activity of catalase (CAT), total antioxidant capacity (T-AOC), the ratio of tGSH/GSSG and the contents of MDA were measured with colorimetry.