沙棘多糖的提取

1、沙棘多糖的提取首先用蒸播水清洗干葉，以洗掉塵土、浮渣，去掉粗梗，剪細(xì)。適量石油酸反復(fù)脫脂，濾渣自然揮干，再用常溫水浸泡一次，80熱水浸泡兩次，以提取水溶性物質(zhì)，然后合并所有水提液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在適宜條件(t=50,抽真空0.09Mpa)下濃縮溶液至適宜體積，sevage法反復(fù)操作去蛋白，最后用95%的乙醇使溶液達(dá)到不同的濃度而沉淀出多糖，優(yōu)選出沉淀沙棘多糖的最優(yōu)靜濃度。0一5冰箱中放置48小時后，過濾時用無水乙醇，丙酮洗數(shù)次，真空抽干。粗產(chǎn)品重新溶解于適量水中，然后通過大孔樹脂進(jìn)行純化，蒸憎水洗脫，洗脫液在PH值為8時，用20%的H2O2,50以下保溫2h脫色，以保證產(chǎn)品的顏色,最后用95%

2、的乙醇使溶液醇濃度達(dá)到80%以析出多糖，重復(fù)上面的析糖操作，最后保存產(chǎn)品于干燥處。用D(+)葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)，苯酚一硫酸法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出線性回歸方程，從而得到粗多糖的含量，由此也可以算出沙棘葉中多糖的白分含量。然后進(jìn)行TLC法初步定性確定多糖成分，再進(jìn)行核磁共振定性分析，即可檢驗(yàn)其準(zhǔn)確成分沙棘(HippohaerhamnoidesL.),胡頹子科植物，分布于歐亞大陸的溫帶、寒溫帶及亞熱帶高三區(qū)。我國的東北、華北、西北和西南等地區(qū)是沙棘屬植物的主要分布區(qū)。山于沙棘屬植物具有極強(qiáng)的生態(tài)適應(yīng)性并富含多種營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)，已引起各國工作者的廣泛重視。沙棘是一種富含生物活性物質(zhì)的天然植物，目前已發(fā)

3、現(xiàn)的生化成分達(dá)190多種。我國是最早利用沙棘的國家，在成書公元八世紀(jì)的藏醫(yī)學(xué)典籍四部醫(yī)典中就詳細(xì)地記載了它的藥性。但是最早對沙棘進(jìn)行系統(tǒng)科學(xué)研究的是前蘇聯(lián)學(xué)者，我國對沙棘的研究始于1985年，并將沙棘列為國家科技攻關(guān)項(xiàng)目加以重點(diǎn)研究，如今已有專刊一一沙棘（由國家水利部主辦）。在前蘇聯(lián)，科學(xué)家開發(fā)利用沙棘由食用轉(zhuǎn)向以生化研究為基礎(chǔ)的醫(yī)用研究，并將沙棘果油和沙棘汁及其制品運(yùn)用于宇航食品，作為特殊的“日餐必需添加劑”口。而在沙棘的開發(fā)中，黃酮類化合物一直是國內(nèi)外學(xué)者較為關(guān)注的一類物質(zhì)。PeterC.H.Hollman等人就黃酮類物質(zhì)的分析及其重要作用寫了一篇綜述2。前蘇聯(lián)學(xué)者發(fā)現(xiàn)沙棘黃酮具有扼制動脈

4、粥樣硬化，降低血液中膽固靜等作用。國內(nèi)王家良王秉文等對沙棘的研究較多，其研究表明：沙棘黃酮能顯著增加心臟的收縮和舒張功能有明顯的抗心肌缺血作用及抗心律失常作用3-4。沙棘有很好的生態(tài)作用。是我國“三北”防護(hù)林的主要樹種之一，對于保持和改善那些地區(qū)的水土保持和生態(tài)環(huán)境起了重要作用5。沙棘葉乂是優(yōu)良的飼料或飼料添加劑，沙棘具有更高的蛋白質(zhì)和脂肪含量以及更好的適口性6,毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，沙棘葉和沙棘殘?jiān)邿o毒物質(zhì)。沙棘的嫩葉還可以炒制茶葉、提取SOD用于化妝品等廣泛用途。綜上所述，沙棘葉中的有效成分豐富，開發(fā)沙棘葉大有可為。目前對于沙棘果汁、果油的開發(fā)研究利用已經(jīng)比較成熟，但是其綜合利用技術(shù)不夠成熟

5、，沙棘葉的研究也不是很多，尤其是沙棘葉中多糖的研究，國內(nèi)外對此有關(guān)的研究還沒有見于發(fā)表，其生理活性目前也尚未證實(shí)，但是從相關(guān)報(bào)道來看，植物多糖主要有以下生物活性免疫調(diào)節(jié)、抗癌防癌及抗遺傳損傷、抗輻射及促進(jìn)骨髓造血機(jī)能、降血糖、降血脂（枸杞多糖）及抗動脈粥樣硬化（如云芝多糖）、抗氧化及抗衰老、保肝以及其他抗凝血、抗胃潰瘍、抗炎、抗微生物、鎮(zhèn)靜、抗驚厥、止喘降血壓作用。而從沙棘葉的多種功用可以估計(jì)它的多糖也應(yīng)具有多種活性，而且在提取黃酮的工藝中可以同時充分提取多糖，大大增加沙棘葉的綜合利用價值，創(chuàng)造高價值產(chǎn)品，可對當(dāng)?shù)厝嗣裾业揭粭l可行的脫貧致富途徑。這樣乂可調(diào)動當(dāng)?shù)剞r(nóng)民的積極性，大力種植沙棘對加快

6、黃土高原綜合治理，促進(jìn)生態(tài)環(huán)境的改變，防止沙漠化等具有重大的社會生態(tài)價值。對綠化荒漠更是形成良性循環(huán)。因此，本文對沙棘葉中多糖的探索研究很有必要，具有開創(chuàng)性意義。因此本實(shí)驗(yàn)首次研究沙棘葉中多糖的提取分離，借鑒其他植物多糖成分的提取方法，再考慮沙棘葉的自身特點(diǎn)，改進(jìn)傳統(tǒng)分離多糖的方法，采用AB8大孔樹脂分離純化各種多糖，無污染，效率高，節(jié)省成本，優(yōu)選出沙棘葉多糖提取分離的最優(yōu)工藝。測定其中粗多糖的白分含量,然后進(jìn)行TLC法初步定性確定多糖成分,再進(jìn)行核磁共振定性分析15-18,即可檢驗(yàn)其準(zhǔn)確成分。根據(jù)其具體成分，便可以知道沙棘葉中多糖的理論藥理作用。2.實(shí)驗(yàn)部分2.1 原料及儀器2 .1.1原料

7、沙棘葉(內(nèi)蒙)；大孔樹脂(AB-8)；石油酸(60-90)；工業(yè)酒精(95%)；濃硫酸(95.5%)；苯酚(AR)；無水乙醇(AR)；丙酮(AR)；乙醛(AR)；D(+)-葡萄糖(AR)；PH試紙；3 .1.2儀器752紫外可見光分光光度計(jì)；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；醫(yī)用離心機(jī)(4000r/min)；新飛電冰箱;SH2-D(III)循環(huán)水式真空泵;2.2 實(shí)驗(yàn)方法2.2.1 原料準(zhǔn)備：(1)試劑的準(zhǔn)備20%的H2O2：166.7mI30%的H2O2稀釋定容到250ml；0.05M的NaOH溶液：2gNaOH于1000ml容量瓶中定容；苯酚(5%)19：30g苯酚加水70ml使之溶解得到30%的苯

8、酚，置于冰箱中避光保存。臨用時振蕩混勻取4ml稀釋至20ml,即為5%濃度；樹脂的預(yù)處理及再生20：AB8樹脂用丙酮浸泡數(shù)天，濕法裝柱,再用丙酮洗至流出液與水混合不產(chǎn)生渾濁，再用大量水洗，水浸泡備用。0.05M的NaOH溶液洗至無色，水洗至中性，95%的乙醇洗至無色，水洗。4 / 16沙棘多糖的提取（2）沙棘葉的預(yù)處理將干沙棘葉用蒸儲水洗去塵土，時間要迅速，50烘箱中烘干。篩掉較大的梗和粗枝，將葉子輕輕于研缽中壓碎，不要太碎，放于干燥處備用。2.2.2 沙棘葉粗多糖的提?。?）脫脂將100g預(yù)處理過的沙棘葉浸泡于1200ml石油酸中8小時，再換一次石油酸，以石油酸浸過葉子為準(zhǔn)。6小時后倒出石油

9、酸，自然揮干石油酸。（2）提取取脫脂過的葉子40g,分兩份，依次用蒸儲水250ml（常溫）、200ml（80）s150ml（80）均浸泡1小時。合并所有浸提液,共1200ml,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至400ml（t=50,抽真空0.09Mpa）。（3）脫蛋白脫蛋白有多種方法：三氯乙酸法，sevage法,等等，基于試驗(yàn)條件，采用sevage法21較為適宜。1/5濃縮液體積的氯仿，1/25濃縮液體積的正丁醇，劇烈振蕩20分鐘，然后攪拌5小時，分液漏斗靜止分層1小時，分離掉有機(jī)溶劑和沉淀，再反復(fù)一次，基本可除盡蛋白質(zhì)。（4）醇析除蛋白后的溶液濃縮至50ml,加入95%的乙醇使其濃度分別達(dá)到50%、60%、70

10、%、80%、85%。放在05c冰箱中48小時。取出后抽濾，分別用無水乙醇，丙酮洗數(shù)次，真空抽干,得到粗產(chǎn)品。2.2.3 多糖的純化(1)過柱將得到的粗產(chǎn)品重新完全溶解于適量水中，將預(yù)處理過的AB-8樹脂濕法裝柱，控制流速3ml/min,用水洗脫,控制流速6ml/min,洗至洗脫液遞加95%的乙醇無沉淀。(2)脫色濃縮液體至50ml,加入40ml0.05M的NaOH溶液，調(diào)劑PH值至8,再滴加20%的H2O2,50c以下保溫2h除盡未反應(yīng)完的H2O2。(3)重析將脫完色的溶液濃縮至50ml,加入95%的乙醇使其濃度達(dá)到80%,使其沉淀完全，放在05冰箱中48小時，取出后抽濾，分別用無水乙醇，丙酮

11、，乙酸洗三次，真空抽干。得到較純產(chǎn)品。干燥處保存。2.2.4總多糖含量的測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備22及樣品含量的測定采用用D(+)葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)，苯酚一硫酸法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密稱取D(+)-葡萄糖0.02g,定容100mL分別取0,0.4,0.8,1.0,1.2,1.4,1.6,1.8o稀釋至5mL加入1.0ml苯酚（5%）,搖勻靜止,立即加入5.0ml濃H2so4,5min后，沸水浴15min,冷水冷卻，紫外可見光分光光度計(jì)于490nm波長處比色，測定吸光度，做吸光度A與濃度C（ug/ml）線性回歸方程。精密稱取樣品0.04g,稀釋定容1000ml,同上法測定其吸光度。3結(jié)果與討論3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3

12、.1.1 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提取數(shù)據(jù)a.脫脂：曾選用索氏提取法，現(xiàn)與浸泡法比較如下：表一索氏提取法與浸泡法脫脂的比較a.旗脂；曾迤用奈代髭取法，現(xiàn)與慢泡法比現(xiàn)如"表一索氏提取法與浸泡法脫脂的比較索氏提取法取30幽磨過的葉片，于虹吸管中加入350ml石油醛，燒瓶中加入400血，75笛水浴回流提取5.5h,提取液顏色為黃色。倒出提取液，加入新的石油髓回流提取1瓦石油隧顏色不再加深，停止回流。石油酰為淡黃色浸泡法30幽磨過的葉片，用石油正以15：1（體積、重量）的比例浸泡沙棘葉約24小時，倒出石油醛再以10；1的比例慢泡2024小時，石油一接提液黃色變淡即可。優(yōu)缺點(diǎn)通過對脫脂后的沙棘葉以及回收石油吹

13、時的剩余物進(jìn)行稱量，發(fā)覺質(zhì)量相差甚微，幾乎相等；而且對比石油醛提取液顏色，也相差不大，因而浸泡法操作較索氏提取法更簡單，所以本試驗(yàn)選取浸泡法對沙棘葉進(jìn)行脫脂處理。索氏提取法取30g研磨過的葉片，于虹吸管中加入350ml石油酷，燒瓶中加入400mL75oC水浴回流提取5.5h,提取液顏色為黃色；倒出提取液，加入新的石油酸回流提取lh,石油酸顏色不再加深，停止回流。石油酸為淡黃色浸泡法30g6 / 16沙棘多糖的提取研磨過的葉片，用石油酸以15：1（體積：重量）的比例浸泡沙棘葉約24小時,倒出石油酸再以10：1的比例浸泡2024小時,石油酸浸提液黃色變淡即可。優(yōu)缺點(diǎn)通過對脫脂后的沙棘葉以及回收石油

14、酸時的剩余物進(jìn)行稱量，發(fā)覺質(zhì)量相差甚微，幾乎相等；而且對比石油酸提取液顏色，也相差不大，因而浸泡法操作較索氏提取法更簡單，所以本試驗(yàn)選取浸泡法對沙棘葉進(jìn)行脫脂處理。b.醇析：濃縮液中加入95%的乙醇，使溶液達(dá)到不同的醇濃度，其所析出的多糖粗產(chǎn)品如下表：表二濃縮液在不同醇濃度下析出的粗糖產(chǎn)品編號®©沙棘葉（g）2020202020溶液體積（粒）505050505095%醇用量（ml）55.5685.7114.0266.67425.0醇濃度（）50.060.070.080.085.0產(chǎn)品質(zhì)量（g）0.5430.7950.8050.9911.021產(chǎn)品外觀灰色小顆粒黑色小顆?；液?/p>

15、黑小顆粒慶白細(xì)小粉末灰白細(xì)小顆粒產(chǎn)率（）2.1%3.975%4.025%4.952%5.105%含量測定數(shù)據(jù)：本步驟利用苯酚一硫酸法共測定了兩組數(shù)據(jù)，所用樣品均為醇沉濃度為80%的第組產(chǎn)品。所得到的數(shù)據(jù)見下面兩表：春三小同濃度的匍陽糖以及多糖稈品任49Unm取旨F的河應(yīng)時吸無度(第一綱空白12345678樣品8？濃度C0IZ66蔡1L0""R2""114116mI：20(ug.ml)11：20OM00.0680.0710.151G.1600.1550.1750.1790.1841:0.090ACam)II:0.080。表四不同濃度的葡萄糖以及多糖樣品在3

16、90皿帔長下所時應(yīng)的吸光度（第二組）空白1234567g樣品pd濃度C04.46.68.811.013.215.417.619.8I：20(ug.i(ml)II；20OJS00.0210.0420.0690.0820.1060.1280.1500.170IzO.OSe-13A(nm)I:0.086。3.1.2 結(jié)果處理（1）相關(guān)與直線方程本實(shí)驗(yàn)采用相關(guān)系數(shù)與直線回歸方程來檢驗(yàn)所測定的數(shù)據(jù)，相關(guān)系數(shù)，丫，10 / 16是測定變量之間相關(guān)密切程度和相關(guān)方向的代表性指標(biāo)。但是相關(guān)分析不能指出兩變量相互關(guān)系的具體形式，也無法從一個變量的變化來推測另一個變量的變化關(guān)系。而回歸方程則是通過一定的數(shù)學(xué)方程來

17、反映變量之間相互關(guān)系的具體形式，以便從一個已知量來推測另一個未知量，為估算預(yù)測提供一個重要的方法。直線回歸方程：y=a+bx；a=（nSxy-ZxZy）/（nSx:（Ex）：）b=（ZX±y-ZxZy）/（nZx；-0球）Y=Z（x*）（？-y）/"）：Z（y-命）；;”（2）數(shù)據(jù)處理考慮到有幾組平行數(shù)據(jù)，因此用c語言編程，減少運(yùn)算量，求得線性回歸方程與相關(guān)系數(shù)分別為：第一組：A=0.00734+0.61528C,y=0.88488第二組：A=0.009654+0.603429C,y=0.99909從結(jié)果中看出第一組數(shù)據(jù)中Y明顯不合要求，故采用第二組數(shù)據(jù)，作出相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

18、圖：圖五不同濃度的D(+)葡萄糖在490nm波長下與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖8.81113.215.417.6 -土 /.濃度 C (ug,ml>44.沙棘多糖的提取由圖五可見第二組數(shù)據(jù)基本呈線性關(guān)系，則由標(biāo)準(zhǔn)圖可得樣品中多糖的濃度為：11.6ug/ml那么可以計(jì)算出：a.樣品中總多糖的含量為：樣品多糖濃度樣品濃度X100%即：11.64-20X100%=58%b.沙棘葉中總多糖的含量：（產(chǎn)品質(zhì)量X樣品多糖含量）沙棘葉質(zhì)量X100%即：（0.991X58%）+20X100%=2.84%3.2 討論3.2.1 預(yù)處理：沙棘葉的預(yù)處理很重要，洗掉塵土，便于產(chǎn)品的純化;葉片不宜過碎，以防熱提取時引起

19、糊化。3.2.2 提取部分（1）脫脂：脫脂時間不宜過短或過長，過短脂溶性物質(zhì)溶解不完全,過長則浪費(fèi)時間；浸泡時宜少量多次，有利于脫脂（2）提?。禾崛r也是宜于先泡后加熱，少量多次水提取。加熱的溫度不宜過高，80c即可，高溫破壞多糖的活性，低溫不利于提取效率。而濃縮時濃縮為原體積的1/3即可，便于脫蛋白時節(jié)省試劑。（3）脫蛋白：a.除蛋白時宜采用sevage法，但需反復(fù)操作。經(jīng)實(shí)驗(yàn),劇烈振蕩20分鐘，然后攪拌5小時，分液漏斗靜止分層1小時，兩遍即可。采用三氯乙酸法，雖然效果很好，但是反應(yīng)太劇烈，部分多糖也隨之損耗；b.將提取液取少量與碘反應(yīng)，呈陰性，說明多糖中并無淀粉或量很少，并不需要加a淀粉酶去除淀粉。（4）醇析：用醇沉淀之前應(yīng)該濃縮至50ml,便于節(jié)省醇用量，節(jié)省成本。經(jīng)實(shí)驗(yàn)對比可知隨著醇濃度的加大，粗糖產(chǎn)量也隨之增大，但是80%和90%的醇沉濃度多糖產(chǎn)率相差不多，且高濃度時極有可能沉淀中包含其他大量雜質(zhì)，但是其醇的用量相差很大，從表二中看出用量相差