版微生物限度檢驗操作規(guī)程資料

1、青島*有限公司文件文件名稱微生物限度檢驗操作規(guī)程文件編號SOP-ZL65-2制 定 人審 核 人審 核 人制定日期審核日期審核日期批 準 人批準日期生效日期頒發(fā)部門品管部印 數(shù)份分發(fā)部門品管部目的 建立微生物限度檢查操作規(guī)程，規(guī)范操作，保證結(jié)果的準確性。范圍 成品、輔料、內(nèi)包裝袋及純化水的檢驗。責(zé)任 品管部微生物限度檢驗人員內(nèi)容 概述：本檢驗操作規(guī)程依據(jù)中國藥典2015年版四部通則1105 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法和通則1106 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法進行檢查。微生物計數(shù)法 一、計數(shù)方法1微生物計數(shù)法系用于能在有氧條件下生長的嗜溫細菌和真菌的計數(shù)。2、計數(shù)方法 本

2、法包括平皿法、薄膜過濾法。3、計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和供試品計數(shù)方法適用性檢查 供試品微生物計數(shù)中所使用的培養(yǎng)基應(yīng)進行適用性檢查。供試品的微生物計數(shù)方法應(yīng)進行方法適用性試驗，以確定采用的方法適合于該產(chǎn)品的微生物計數(shù)。4、菌種及菌液的制備4.1試驗用菌株的傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0袋），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進行保藏。計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和計數(shù)方法適用性試驗見表1。4.2菌液制備 按表1規(guī)定培養(yǎng)各試驗菌株。取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物，用PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液；取黑曲霉的

3、新鮮培養(yǎng)物加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管中，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液。菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時內(nèi)使用；若保存在2-8，可在24小時內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2-8，在驗證過的貯存期內(nèi)使用。表1 試驗菌液的制備和使用試驗菌株試驗菌液的制備計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查計數(shù)方法適用性試驗需氧菌總數(shù)霉菌和酵母菌總數(shù)需氧菌總數(shù)霉菌和酵母菌總數(shù)金黃色葡萄球菌Stap

4、hylococcus aureus CCMCC(B) 26003胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度3035，培養(yǎng)時間1824h胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度3035，培養(yǎng)時間不超過3天，接種量不大于100cfu。胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度3035，培養(yǎng)時間不超過3天，接種量不大于100cfu。銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa CMCC(B) 10104枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis CMCC(B) 63501白色念珠菌Candida albicans CMCC(F) 98001沙氏葡萄糖瓊

5、脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度2025，培養(yǎng)時間23天胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度3035，培養(yǎng)時間不超過5天，接種量不大于100cfu。沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度2025，培養(yǎng)時間不超過5天，接種量不大于100cfu。胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度3035，培養(yǎng)時間不超過5天，接種量不大于100cfu。沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度2025，培養(yǎng)時間不超過5天，接種量不大于100cfu。黑曲霉菌Aspergillus niger CMCC(F) 98003沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度2025，培養(yǎng)時間57天，或直到獲得豐富的孢子4.3陰性對照 為確認

6、試驗條件是否符合要求，應(yīng)進行對照試驗，陰性對照試驗應(yīng)無菌生長。4.4培養(yǎng)基適用性檢查 按照表1規(guī)定，接種不大于100cfu的菌液至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板，置規(guī)定的條件下培養(yǎng)。每一試驗菌株平行制備2管或2個平皿。同時用相應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進行上述試驗。被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值應(yīng)在0.5-2范圍內(nèi)，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對照培養(yǎng)基上的菌落一致。被檢液體培養(yǎng)基管與對照培養(yǎng)基管比較，試驗菌應(yīng)生長良好。5、計數(shù)方法適用性檢查5.1供試品制備 根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采用適宜的方法制備供試液。制備時若需加

7、溫應(yīng)加熱均勻且溫度不得超過45。供試液從制備到加入檢驗用培養(yǎng)基不得超過1小時。成品、輔料供試液的制備 取供試品，加PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖溶液或PH7.2磷酸鹽緩沖溶液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基或稀釋制成1:10供試液，若需要，調(diào)節(jié)供試液PH至6-8，必要時用同一稀釋液將供試液進一步10倍稀釋系列。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。內(nèi)包裝膜、袋：取供試品100cm2，剪碎，加PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或PH7.2磷酸鹽緩沖溶液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，浸泡，振搖，制成1:10供試液。若需要，調(diào)節(jié)供試液PH至6-8，必要時用同一稀釋液將供試液進一步10倍稀釋系列。5.

8、2接種和稀釋 按下列要求進行供試液的接種和稀釋，制備微生物回收試驗用供試液。所加菌液的體積應(yīng)不超過供試液體積的1%。為確認供試品中微生物能被充分檢出，應(yīng)首先選擇最低稀釋級的供試液進行計數(shù)方法適用性試驗。試驗組 取上述制備好的供試液，加入試驗菌液，混勻，使每1ml供試液所含菌量不大于100cfu。供試品對照組 取制備好的供試液，以稀釋液代替菌液同試驗組操作。菌液對照組 取不含中和劑及滅活劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液，按試驗組操作加入試驗菌液并進行微生物回收試驗。5.3供試品中微生物的回收 表1所列的計數(shù)方法適用性試驗的各試驗菌應(yīng)逐一進行微生物回收，微生物回收采用平皿法。平皿法 采用傾注法，表1中每株

9、試驗菌每種培養(yǎng)基至少制備2個平皿。取照上述“供試液的制備”和“接種和稀釋”制備的供試液1ml，置直徑90mm的無菌平皿中，注入15-20ml溫度不超過45熔化的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)、計數(shù)。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌液，計算各試驗組的平均菌落數(shù)。薄膜過濾法 采用的濾膜孔徑不大于0.45um。濾膜直徑一般為50mm。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時，應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜

10、，每張濾膜每次沖洗量不超過100ml，總沖洗量不得超過1000ml；以免濾膜上的微生物受損傷。取照上述“供試液的制備”和“接種和稀釋”制備的供試液適量（一般取相當(dāng)于1g、1ml、10cm2的供試品，若供試品中所含菌數(shù)校對，供試液可酌情減量），加至適量的稀釋液總，混勻，過濾，用適量的沖洗液沖洗濾膜。測定需氧菌總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上；測定霉菌和酵母菌總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，按表1規(guī)定條件培養(yǎng)、技術(shù)。每株試驗菌每種培養(yǎng)基至少制備1張濾膜。同法測定供試品對照組和菌液對照組菌數(shù)。6、結(jié)果判斷 計數(shù)方法適用性試驗中，采用平皿法或薄膜過濾法，試驗組

11、菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.5-2范圍內(nèi)。若各試驗驗菌的回收試驗均符合要求，照所用的供試液制備方法及計數(shù)方法進行該供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)。若存在一株或多株試驗菌的回收達不到要求，應(yīng)選擇回收最接近要求的方法和試驗條件進行供試品檢查。二 供試品的檢查1、檢驗量 即一次試驗所用的供試品量（g、ml或cm2）。一般隨機抽取不少于2個最小包裝的供試品，混合，取10g、10ml或100cm2進行檢驗。2、供試品檢查 按計數(shù)方法適用性試驗確認的計數(shù)方法進行供試品中需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的測定。胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基用于測定需氧菌

12、總數(shù)；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于測定霉菌和酵母菌總數(shù)。2.1陰性對照試驗 以稀釋液代替供試液進行陰性對照試驗，陰性對照試驗應(yīng)無菌生長。若有菌生長應(yīng)進行偏差調(diào)查。2.2平皿法 取規(guī)定量的供試品，按方法適用性試驗確認的方法進行供試液制備和菌數(shù)測定，每稀釋級每種培養(yǎng)基至少制備2個平板。2.2.1培養(yǎng)和計數(shù) 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板倒置于3035培養(yǎng)箱中培養(yǎng)35天。沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板倒置于2025培養(yǎng)箱中培養(yǎng)57天，觀察菌落生長情況，點計平板上生長的所有菌落數(shù)并報告。菌落蔓延成片的平板不宜計數(shù)。點計菌落數(shù)后計算各稀釋級供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報告規(guī)則報告菌落數(shù)。若同稀釋級兩個平板的菌落數(shù)平均值不

13、小于15，則兩個平板的菌落數(shù)不能相差1倍或以上。2.2.2菌數(shù)報告規(guī)則 需氧菌總數(shù)宜選取平均菌落數(shù)小于300cfu的稀釋級、霉菌和酵母菌總數(shù)宜選取平均菌落數(shù)小于100cfu的稀釋級，作為菌數(shù)報告的依據(jù)。取最高平均菌落數(shù)，計算1g、1ml或10cm2供試品中所含微生物，取兩位有效數(shù)字報告。如各稀釋級的平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板有菌落生長，但平均茵落數(shù)小于1時，以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報告菌數(shù)。2.3薄膜過濾法 按計數(shù)方法適用性試驗確認的計數(shù)方法進行供試液制備。取相當(dāng)于每張濾膜含1g、1ml或10cm2供試品的供試液，若供試品所含的菌數(shù)較多時，可取適宜稀釋級的供試液，照方法適用性試驗確

14、認的方法加至適量稀釋液中，立即過濾，沖洗，沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。2.4培養(yǎng)和計數(shù) 培養(yǎng)條件和計數(shù)方法同平皿法，每張濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過100cfu。2.5菌數(shù)報告規(guī)則 以相當(dāng)于1g、1ml或10cm2供試品的菌落數(shù)報告菌數(shù)；若濾膜上無菌落生長，以1報告菌數(shù)（每張濾膜過濾1g、1ml或10cm2供試品），或1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。3、結(jié)果判斷3.1需氧菌總數(shù)是指胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上生長的總菌落數(shù)（包括真菌菌落數(shù)）；霉菌和酵母菌總數(shù)是指沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的總菌落數(shù)（包括細菌菌落數(shù)）。若因沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的細菌

15、使霉菌和酵母菌的計數(shù)結(jié)果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素（如氯霉素、慶大霉素）的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或其他選擇性培養(yǎng)基（如玫瑰紅鈉培養(yǎng)基）進行霉菌和酵母菌總數(shù)測定。使用選擇性培養(yǎng)基時應(yīng)進行培養(yǎng)基適用性檢查。3.2各品種項下規(guī)定的微生物限度標準解釋如下：101cfu：可接受的最大菌數(shù)為20；102cfu：可接受的最大菌數(shù)為200；103cfu：可接受的最大菌數(shù)為2000，以此類推。3.3若供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的檢查結(jié)果均符合該品種項下的 規(guī)定，判供試品符合規(guī)定；若其中任何一項不符合該品種項下的規(guī)定，判供試品不符合規(guī)定?？刂凭鷻z查法l、簡述控制菌檢查法是用于在規(guī)定的試驗條件下，

16、檢查供試品中是否存在某些特定微生物。本標準的控制菌為大腸埃希菌CMCC(B) 44102、銅綠假單胞菌 CMCC(B) 10104和金黃色葡萄球菌 CMCC(B) 26003供試品檢出控制菌或其他致病菌時，按一次檢出結(jié)果為準，不再復(fù)試。供試液制備及實驗環(huán)境要求同“微生物計數(shù)法”。2、培養(yǎng)基適用性檢查和控制菌檢查方法 適用性試驗供試品控制菌檢查中所使用的培養(yǎng)基應(yīng)進行適用性檢查。供試品的控制菌檢查方法應(yīng)進行適用性驗證。2.1菌種 試驗用菌株的傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0袋），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進行保藏。金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus CM

17、CC(B) 26003銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa CMCC(B) 10104大腸埃希菌Escherichia coli CMCC(B) 44102乙型副傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi B）CMCC(B) 50094白色念珠菌（Candida albicans）CMCC(F) 98001生孢梭菌（Clostridium sporogenes）CMCC(B) 649412.2菌液制備 將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門菌分別接種于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基上， 3035培養(yǎng)1824h；將白色念珠菌接種于沙氏葡萄糖瓊脂

18、培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，2025培養(yǎng)23天；將生孢梭菌接種于梭菌增菌培養(yǎng)基中置厭氧條件下3035培養(yǎng)2448h，或接種于硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中3035培養(yǎng)1824h。上述培養(yǎng)物用PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液。菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時內(nèi)使用；若保存在2-8，可在24小時內(nèi)使用。生孢梭菌孢子懸液可替代新鮮的菌懸液，孢子懸液保存在2-8，在驗證過的貯存期內(nèi)使用。2.3陰性對照 為確認試驗條件是否符合要求，應(yīng)進行對照試驗，陰性對照試驗應(yīng)無菌生長。2.4培養(yǎng)基適用性檢查 控制菌檢查用的培養(yǎng)基應(yīng)進行培養(yǎng)基適用性檢查。檢查項目包括促生長能

19、力、抑制能力及指示特性的檢查。各培養(yǎng)基的檢查項目及所用菌株見下表2。表2 控制菌檢查用培養(yǎng)基的促生長能力、抑制能力及指示特性控制菌檢查培養(yǎng)基特性試驗菌株耐膽鹽革蘭陰性菌腸道菌增菌液體培養(yǎng)基促生長能力大腸埃希菌、銅綠假單胞菌抑制能力金黃色葡萄球菌紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基促生長能力+指示特性大腸埃希菌、銅綠假單胞菌大腸埃希菌麥康凱液體培養(yǎng)基促生長能力大腸埃希菌抑制能力金黃色葡萄球菌麥康凱瓊脂培養(yǎng)基促生長能力+指示特性大腸埃希菌沙門菌RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基促生長能力乙型副傷寒沙門菌抑制能力金黃色葡萄球菌木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基促生長能力+指示特性乙型副傷寒沙門菌三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基指示能力乙型副

20、傷寒沙門菌銅綠假單胞菌溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基促生長能力銅綠假單胞菌抑制能力大腸埃希菌金黃色葡萄球菌甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基促生長能力+指示特性金黃色葡萄球菌抑制能力大腸埃希菌梭菌梭菌增菌培養(yǎng)基促生長能力生孢梭菌哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基促生長能力生孢梭菌白色念珠菌沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基促生長能力白色念珠菌沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基促生長能力+指示特性白色念珠菌念珠菌顯色培養(yǎng)基促生長能力+指示能力抑制能力白色念珠菌大腸埃希菌2.4.1液體培養(yǎng)基促生長能力檢查 分別接種不大于100cfu的表2的試驗菌株與被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不大于規(guī)定的最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)，與對照培養(yǎng)基比較

21、，被檢培養(yǎng)基試驗菌應(yīng)生長良好。2.4.2固體培養(yǎng)基促生長能力檢查 用涂布法分別接種不大于100cfu的表2的試驗菌株與被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不大于規(guī)定的最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)，被檢培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基上生長的菌落大小、形態(tài)應(yīng)一致。2.4.3培養(yǎng)基抑制能力檢查 接種不少于100cfu的表2的試驗菌株與被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不大于規(guī)定的最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)，試驗菌應(yīng)不得生長。2.4.4培養(yǎng)基指示特性的檢查 用涂布法分別接種不大于100cfu的表2的試驗菌株與被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不大于規(guī)定的

22、最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)，被檢培養(yǎng)基上試驗菌生長的菌落大小、形態(tài)特征、指示劑能力等英語對照培養(yǎng)基一致。2.5控制菌檢查方法適用性檢查2.5.1供試液制備：按“供試品檢查”中規(guī)定的方法制備供試液。2.5.2試驗菌 根據(jù)各品種項下微生物限度標準中規(guī)定的檢查控制菌選擇相應(yīng)的試驗菌株。確認耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法是，采用大腸埃希菌和銅綠假單胞菌為試驗菌。2.5.3適用性檢查 按控制菌檢查法取規(guī)定量供試液及不大于100cfu的試驗菌接入規(guī)定的培養(yǎng)基中，采用薄膜過濾法是取規(guī)定量供試液，過濾沖洗，在最后一次沖洗液中加入試驗菌，過濾后注入規(guī)定的培養(yǎng)基或取出濾膜接入規(guī)定的培養(yǎng)基中。依相應(yīng)控制菌檢查方法，在規(guī)定的溫度和

23、最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)，應(yīng)能檢出所加試驗菌相應(yīng)的反應(yīng)特征。2.5.4結(jié)果判斷 上述試驗若檢出試驗菌，按此供試液之被罰和控制菌檢查方法進行供試品檢查；若未檢出試驗菌，營銷處供試品中的抑菌活性（中國藥典2015年版四部通則1105中抗菌活性的去除或滅活），并重新進行方法適用性試驗。 若經(jīng)過試驗確證供試品對試驗菌的抗菌作用無法消除，可認為受抑制的微生物不易存在于該供試品中，選擇抑菌成分消除相對徹底的方法進行供試品的檢查。3、供試品檢查 供試品的控制菌檢查應(yīng)經(jīng)方法適用性試驗確認的方法進行。3.1陽性對照 陽性對照試驗方法同供試品的控制菌檢查，對照菌的加入量應(yīng)不大于100cfu，陽性對照應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。

24、3.2陰性對照 以稀釋劑代替供試液照相應(yīng)控制菌檢查法檢查，陰性對照應(yīng)無菌生長。3.3大腸埃希菌（Escherichia coli）供試液制備和增菌培養(yǎng) 取供試品，照“微生物計數(shù)法”制成1:10的供試液，取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液，接種于適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗確定）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，3035培養(yǎng)1824h。選擇和分離培養(yǎng) 取上述培養(yǎng)物1ml接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，4244培養(yǎng)2448h。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035培養(yǎng)1872h。結(jié)果判斷 若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，應(yīng)進行分離、純化及適宜的鑒定試驗，確證是否為大腸埃希

25、菌；若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。3.4銅綠假單胞菌 （Pseudomonas aeruginosa）供試液制備和增菌培養(yǎng) 取供試品，照“微生物計數(shù)法”制成1:10的供試液，取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液，接種于適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗確定）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，3035培養(yǎng)1824h。選擇和分離培養(yǎng) 取上述培養(yǎng)物1ml接種至溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035培養(yǎng)1872h。取上述平板上生長的菌落進行氧化酶試驗，或采用其他適宜方法進一步鑒定。氧化酶試驗 將潔凈的濾紙片置于平皿內(nèi)，用無菌玻璃棒取上述平板上

26、生長的菌落涂于濾紙片上，滴加新配制的1%鹽酸N,N-二甲基對苯二胺試液，在30秒內(nèi)培養(yǎng)物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗陽性，否則為陰性。結(jié)果判斷 若溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，且氧化酶試驗陽性，應(yīng)進一步進行適宜的鑒定試驗，確證是否為銅綠假單胞菌。若平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，或氧化酶試驗陰性，判供試品未檢出銅綠假單胞菌。3.5金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）供試液制備和增菌培養(yǎng) 取供試品，照“微生物計數(shù)法”制成1:10的供試液，取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液，接種于適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗確定）的胰酪大豆胨液體培

27、養(yǎng)基中，混勻，3035培養(yǎng)1824h。選擇和分離培養(yǎng) 取上述培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035培養(yǎng)1872h。結(jié)果判斷 若甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上有黃色菌落或外周有黃色環(huán)的白色菌落生長，應(yīng)進行分離、純化及適宜的鑒定試驗，確證是否為金黃色葡萄球菌；若平板上沒有與上述形態(tài)特征相符或疑似的菌落生長，或雖有相符或疑似菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。附件附件1微生物限度檢查記錄（R-SOP-ZL65-2-01） 附件2計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查記錄（R-SOP-ZL65-2-02） 附件3控制菌檢查培養(yǎng)基適用性檢查記錄（R-SOP-ZL65-2-03） 附件4陽

28、性菌使用記錄（R-SOP-ZL65-2-04）修訂歷史文件修訂、變更歷史原文件編號現(xiàn)文件編號生效日期修訂變更原因SOP-ZL65-1SOP-ZL65-2執(zhí)行2015年版中國藥典附件1 微生物限度檢查記錄（1/4）編號：R-SOP-ZL65-1-01檢品名稱檢品來源檢品批號檢驗日期年 月 日包裝規(guī)格報告日期年 月 日批量 kg（ 件）檢驗依據(jù)中國藥典2010年版二部供試品制備：常規(guī)法供試品 g（ml）加無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液（PH7.0）（配制批號 ）至 ml細菌數(shù) 3035 3天霉菌(酵母菌)總數(shù) 2328 5天培養(yǎng)基配制批號： 培養(yǎng)時間 月 日 時 月 日 時 培養(yǎng)基配制批號：培養(yǎng)時間 月

29、日 時 月 日 時原液1：101：100陰性對照原液1：101：100陰性對照12121212121224h24h48h48h72h72h96h120h平均平均結(jié)果cfu/g、ml 結(jié)果cfu/g、ml 大腸埃希菌檢查 菌種編號： 試驗方法培養(yǎng)基配制批號培養(yǎng)時間h培養(yǎng)溫度結(jié)果備注供試品陽性對照陰性對照BLMUG靛基質(zhì)結(jié)論微生物限度檢查記錄（2/4）編號：R-SOP-ZL65-1-01活螨檢查供試品 袋（瓶）直接檢查法結(jié)論 金黃色葡萄球菌檢查 菌種編號： 試驗方法培養(yǎng)基配制批號培養(yǎng)時間h培養(yǎng)溫度結(jié)果備注供試品口 亞碲酸鈉肉湯口 營養(yǎng)肉湯口 卵黃氯化鈉瓊脂平板口 甘露醇氯化鈉瓊脂平板培養(yǎng)基配制批號

30、觀察結(jié)果培養(yǎng)時間（h）244872口 平板無菌落生長，結(jié)論：未檢出金黃色葡萄球菌?？?平板有菌落生長，與金黃色葡萄球菌典型菌落形態(tài)特征不符，結(jié)論：未檢出金黃色葡萄球菌?？?平板有菌落生長，與金黃色葡萄球菌典型菌落形態(tài)特征相符（或疑似），結(jié)論：需進行革蘭染色、鏡檢及血漿凝固酶試驗。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)培養(yǎng)基配制批號：培養(yǎng)時間： h 培養(yǎng)溫度： 革蘭染色、鏡檢1、染色觀察： 口 呈藍紫色，為革蘭陽性菌； 口 呈紅色，為革蘭陰性菌2、鏡檢結(jié)果： 口 球菌、 口 芽孢、 口 莢膜、口 單個排列、口 成雙排列、 口 短鏈狀排列、口 排列不規(guī)則的葡萄狀營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)培養(yǎng)基配制批號：培養(yǎng)時間： h 培養(yǎng)溫度： 血漿凝

31、固酶試驗結(jié)論 微生物限度檢查記錄（3/4）編號：R-SOP-ZL65-1-01 銅綠假單胞菌檢查 菌種編號： 試驗方法培養(yǎng)基配制批號培養(yǎng)時間h培養(yǎng)溫度結(jié)果備注供試品BL增菌培養(yǎng)基溴代十六烷基三甲胺平板培養(yǎng)基配制批號觀察結(jié)果培養(yǎng)時間（h）244872口 平板無菌落生長，結(jié)論：未檢出銅綠假單胞菌?？?平板有菌落生長，與銅綠假單胞菌典型菌落形態(tài)特征不符，結(jié)論：未檢出銅綠假單胞菌?？?平板有菌落生長，與銅綠假單胞菌典型菌落形態(tài)特征相符（或疑似），結(jié)論：需進行革蘭染色、鏡檢及氧化酶試驗。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)培養(yǎng)基配制批號：培養(yǎng)時間： h 培養(yǎng)溫度： 革蘭染色、鏡檢1、染色觀察： 口 呈藍紫色，為革蘭陽性菌； 口

32、 呈紅色，為革蘭陰性菌2、鏡檢結(jié)果： 口 芽孢桿菌、口 單個排列、口 成雙排列、 口 短鏈排列氧化酶觀察結(jié)果： 加1的二鹽酸二甲基對苯二胺試液，在30S內(nèi)培養(yǎng)基顯色：口 由粉紅色逐漸變?yōu)樽霞t色，為氧化酶試驗陽性，需做綠膿菌素試驗；口 無上述氧化酶試驗陽性顯色現(xiàn)象為陰性。綠膿菌素培養(yǎng)基配制批號：培養(yǎng)時間： h 陰性對照：培養(yǎng)溫度： 觀察結(jié)果：加三氯甲烷35ml，充分振搖攪碎培養(yǎng)基，靜置片刻，將三氯甲烷移至另一試管中，加入1mol/L鹽酸試液1ml，振搖后靜置片刻觀察：口 鹽酸溶液呈粉紅色，為綠膿菌素陽性；口 鹽酸溶液呈粉紅色，為綠膿菌素陰性。結(jié)論 結(jié)論：本品按中國藥典2010年版二部微生物限度檢

33、查法標準檢查，結(jié)果 。檢驗人： 復(fù)核人：微生物限度檢查記錄（4/4）編號：R-SOP-ZL65-1-01檢品名稱檢品來源檢品批號檢驗日期年 月 日包裝規(guī)格報告日期年 月 日批量 kg（ 件）檢驗依據(jù)中國藥典2010年版二部試驗方法培養(yǎng)基配制批號培養(yǎng)時間h培養(yǎng)溫度結(jié)果觀察備注口EMB口MacC純培養(yǎng)生化試驗乳糖發(fā)酵試驗靛基質(zhì)試驗（I）甲基紅試驗（M）乙酰甲基甲醇生成試驗（V-P） 枸櫞酸鹽利用試驗（C）革蘭染色鏡檢制備過程觀察結(jié)果：口 呈藍紫色，為格蘭陽性菌； 口 呈紅色，為格蘭陰性菌結(jié)論結(jié)論：本品按中國藥典2010年版二部微生物限度檢查法檢查，結(jié)果 。檢驗人： 復(fù)核人：附件2 計數(shù)培養(yǎng)基適用性

34、檢查記錄培養(yǎng)基名稱： 編號：R-SOP-ZL65-1-02培養(yǎng)基批號培養(yǎng)基生產(chǎn)廠家對照培養(yǎng)基批號對照培養(yǎng)基生產(chǎn)廠家配制日期 年 月 日使用日期年 月 日一、 菌液制備（需要的菌種在內(nèi)劃“” ）：（1）大腸埃希菌新鮮肉湯培養(yǎng)物1ml， 9ml0.9%無菌NaCl溶液，10倍遞增稀釋；（2）金黃色葡萄球菌新鮮肉湯培養(yǎng)物1ml，9ml0.9%無菌NaCl溶液10倍遞增稀釋；（3）枯草芽孢桿菌新鮮肉湯培養(yǎng)物1ml，9ml0.9%無菌NaCl溶液10倍遞增稀釋；（4）白色念珠菌新鮮改良馬丁培養(yǎng)物1ml，9ml0.9%無菌NaCl溶液10倍遞增稀釋；（5）黑曲霉新鮮孢子洗脫液1ml，9ml0.05%（v/v）聚山梨酯80的0.9%無菌NaCl溶液10倍遞增稀釋。二. 檢查結(jié)果：培養(yǎng)溫度： 培養(yǎng)時間： 天菌種類型被檢培養(yǎng)基對照培養(yǎng)基A/B（%）被檢培養(yǎng)基菌與對照培養(yǎng)基上的菌落落形態(tài)皿1皿2平均A皿1皿2平均B大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑 曲 霉檢驗標準被檢培養(yǎng)基的菌落數(shù)與對照培養(yǎng)基菌落數(shù)相比大于70%，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對照培養(yǎng)基上的菌落一致。判該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。結(jié) 論檢驗人： 復(fù)核人： 檢驗日期： 年 月 日 復(fù)核日期： 年 月 日附件3 控制菌檢查培養(yǎng)基適用性檢查記錄培養(yǎng)基名稱： 編號：R-SOP