甲烷單加氧酶的研究進展

1、甲烷單加氧酶催化機理的研究進展摘 要：甲烷單加氧酶是甲烷營養(yǎng)細菌代謝過程中的重要酶系，同時也是一類能夠很好地催化底物分子單加氧反應的生物催化劑，在工業(yè)應用、醫(yī)藥和環(huán)境治理方面有著廣泛的應用前景。文章綜述了近年來在甲烷單加氧酶催化機理方面的研究，著重闡述了含非血紅素雙鐵核的結構及活化氧分子和底物的機理。關鍵詞：甲烷單加氧酶；活性中心；催化機理加氧酶：催化分于氧的氧原子與底物結合的氧化反應酶的總稱，屬于氧化還原酶類。梅森等（HSMason et al，1955）用18O2示蹤，根據(jù)18O結合于其氧化生成物而發(fā)現(xiàn)的，可分成氧分子的雙原子氧與底物結合的加二氧酶（dioxygenase）和僅結合一原子氧

2、，且必需有對另一原子氧的氫供體（NADPH等）的單加氧酶（monooxygenase）。后者亦稱混合功能加氧酶（mixedfunction oxygenase）或羥化酶。甲烷單加氧酶：甲烷單加氧酶（methane monooxygenase，MMO）是一類含有雙核鐵活性中心的非血紅素蛋白酶1，是甲烷營養(yǎng)細菌（methanotrophic bacteria）代謝過程中產(chǎn)生的重要酶系，也是自然界中為數(shù)不多的能夠同時活化分子氧和小分子烴的酶系之一2-4。MMO 能斷裂非常穩(wěn)定的C-H 鍵，將分子氧中的一個氧原子插入C-H 中，另一個氧原子則生成水。反應過程見下式： CH4 + NADH + H O2

3、 CH3OH + NAD H2O MMO 催化烷烴發(fā)生單加氧反應生成相應的醇的過程與其他單加氧酶如細胞色素P450很類似，但在所有的單加氧酶中，只有MMO 能催化非常穩(wěn)定的甲烷有效氧化生成甲醇，而這個反應在催化化學上是難以實現(xiàn)的。甲醇作為一種清潔的汽油替代品，是C1 化學重要的原料。目前，天然氣作為甲烷的主要來源，一般是通過水蒸氣重整法制成合成氣，然后再進一步深度開發(fā)。此法存在投資大、設備復雜、能耗高、選擇性差的缺點，且產(chǎn)品不宜直接用來合成甲醇和其他烴類5。如果能夠使用酶直接催化甲烷生成甲醇，就具有速度快、選擇性高、條件溫和等優(yōu)點，對于深度開發(fā)天然氣資源，解決世界能源危機有著深遠的影響。除了催

4、化甲烷進行單加氧反應外，MMO 還有著非常廣泛的底物譜，包括：C8 以下的飽和的、不飽和的、線狀的、分枝的、芳香族的、環(huán)狀的和鹵化的烴類。反應生成的產(chǎn)物有：醇類、環(huán)氧化物、苯酚等6。其中MMO 催化烯烴進行環(huán)氧化反應生成環(huán)氧化物是化學合成制藥工業(yè)的重要中間體，催化鹵代烴類和芳烴類的氧化在環(huán)境污染的控制中具有潛在的應用價值。目前研究表明，MMO 還能降解污水中的致癌物質N-亞硝基二甲胺7。MMO 的這些特性使其受到了極大地關注，對其催化機理的研究也成了國際上引人注目的前沿領域。1.MMO簡介：在甲烷營養(yǎng)細菌中，存在可溶性甲烷單加氧酶（soluble MMO，sMMO）和顆粒性甲烷單加氧酶（par

5、ticulate MMO，pMMO）?；旧纤械募淄闋I養(yǎng)菌中都含有pMMO，一般存在于細胞膜上，但是由于pMMO 難以純化和不穩(wěn)定性，目前對其了解還不多。目前研究得比較深入的是來源于Methylococcus capsulatus（Bath）和Methylosinus trichosprium OB3b 兩個菌株的sMMO。sMMO 是一種三組分的復合酶體系。三組分蛋白分別是羥基化酶MMOH，還原酶MMOR 和蛋白調節(jié)酶MMOB。雙核鐵活性中心一般以三種形式存在，氧化態(tài)：FeIIIFeIII，混合態(tài)：FeIIIFeII 和還原態(tài)：FeIIFeII 2。氧化態(tài)和還原態(tài)的MMOH 的結構如圖1

6、所示。由圖1 可以看出，氧化態(tài)的MMOH的兩個FeIII 是通過1 個羥基、1 個雙齒的谷氨酸和1 個水分子的外源橋構成的三重橋彼此聯(lián)接。還原態(tài)的MMOH 中兩個FeIII 少一個羥基橋。MMOH 中的鐵離子是以-氧橋連接的雙鐵金屬簇的形式存在。還原態(tài)和混合態(tài)的MMOH 能與底物、分子氧結合，并使之活化，如還原態(tài)的MMOH 單獨存在時能夠催化丙烯的環(huán)氧化反應8。在催化過程中，MMOH 被不斷地氧化，當其完全轉化為氧化態(tài)后就不再有催化活性，只有得到MMOR 輔助，才能使之還原恢復活性。2 MMO的作用機理 ：對 MMO 結構的了解，給深入研究MMO 的催化機制提供了良好的開端。MMO 的催化反應

7、過程中，三個亞基的作用是不同的， MMOH是 MMO的催化活性單元；MMOR 接受 NADH 的電子，并將電子傳遞到 MMOH；MMOB 在 MMOH和 MMOR 之間的電子傳遞中起到調節(jié)作用； 而 NADH 在催化過程中作為 MMO的電子給體，每轉化一分子底物需要消耗一分子 NADH9。2.1 MMOH 的催化機理：如圖2 所示，MMOH中含有的氧化態(tài)雙核鐵活性中心在催化反應過程中首先接受NADH的兩個電子成為還原態(tài)，然后還原態(tài)MMOH 與氧分子反應，經(jīng)過兩個中間體O、P（過氧橋連MMOH），最終形成FeIV 雙核鐵簇Q。中間體Q 與底物分子結合，經(jīng)過中間體R、T，釋放出產(chǎn)物并重新回到MMO

8、H 的氧化態(tài)。目前對MMOH 催化反應機理的研究主要集中在兩個方面：(1)分子氧的活化；(2)烷烴的活化。2.1.1 分子氧的活化機理 分子氧活化是指在反應過程中， 中間體 P轉化到中間體 Q的過程中 O-O鍵的斷裂方式。關于其斷裂方式的爭論目前主要集中在均裂反應（homolytic cleavage）和異裂反應（heteroliytic cleavage）兩種。 （1）分子氧的異裂機制 Lee等18在對來源于M. trichosprium OB3b中sMMO的動力學研究基礎上提出了分子氧異裂的理論。通過對 pH效應和質子總量的研究表明，在催化反應過程中需要兩個質子。氧分子先與雙鐵核中心形成一

9、個過氧橋，形成中間體 P，此時加入一個質子，使其中一個氧原子質子化形成單齒的過氧化態(tài)中間體 TS1。另一個質子作用于中間體 TS1 向 Q轉換過程中，使 O-O 鍵發(fā)生異裂，形成高價態(tài)雙核鐵簇。此時，一個氧原子作為雙核鐵中心的氧橋，另一個氧原子形成了水，過程如式所示：（2）分子氧的均裂機制 均裂機制大部分的理論，主要是利用理論化學的方法對中間體 P 和中間體 Q 模型化合物及其相互間轉化的研究。但在不同的計算方法中 P有著不同的結構，均裂機制的過程見式：與異裂機制不同的是，在分子氧均裂機制中，由分子氧衍生的O-O 鍵都保留下來作為中間體Q 的氧橋，形成水分子的氧原子是由雙鐵中心原來保留的橋連氧

10、原子形成的。 烷烴 C-H的活化機理MMO催化氧化反應的分子機制研究的第二個重點是烷烴 C-H鍵的活化， 目前有兩種主要的機制：自由基回彈機制（radical rebound mechanism）和協(xié)調的氧插入機制（concert insertion of an oxygen atom） 。 （1）自由基回彈機制 自由基回彈機制最早由Lipsomb等人提出，Rabion等10也通過理論計算驗證了此機制。據(jù)推測，中間體Q的進一步活化形成不對稱的FeIIIFeIV-氧基自由基。這種自由基從烷烴中奪取一個氫形成FeIIIFeIV-羥基自由基，生成的甲基自由基迅速與四價鐵中心重組，形成弱的Fe-C鍵。

11、Basch，Lippard，Yazunari等最近用理論研究說明了奪取氫原子的反應機理，從而驗證自由基回彈機制。過程見式：（2）協(xié)調的氧插入機制協(xié)調的氧插入機制（又稱協(xié)調的無自由基機制，concert non-radical mechanism）是由Newcomb等11運用甲基立方烷烴作為自由基探針來研究M.capsilalus Bath菌的sMMO后提出的Yoshizawa 等19認為甲烷首先和 FeIV配位形成一種五價碳中心，隨后通過兩步協(xié)調的氫和甲基轉變形成甲醇。過程見式：2.2 MMOB 的作用機理MMOB 的作用是影響 MMOH和 MMOR 之間的電子傳遞過程。不同的光學研究方法表明

12、，MMOB 通過靠近 MMOH 的雙核鐵中心，將活性中心結構進行輕微的改變從而影響MMOH催化反應的速率、區(qū)域選擇性及其氧化還原的能力12。然而 MMOB 作為一個微小的輔因子如何進行調節(jié) MMO的催化的過程尚不清楚。2.3 MMOR 的催化機理及電子傳遞過程MMOR 含有一個Fe2-S2簇和一個 FAD 輔因子，它們的作用是傳遞電子13。上式說明了這個電子傳遞過程。 NADH 首先和 MMOR 中的 FAD發(fā)生作用，F(xiàn)AD 接受 NADH 的電子，形成了電荷轉移（charge-transfer）中間體 CT1，位于 NADH 的煙酰胺分子和 FAD的異咯嗪環(huán)中間。當氫離子由 NADH 轉移到

13、 FAD 時，就形成了第二個電荷轉移中間體 CT2。它比 CT1 要活潑，釋放 NAD+同時將電子從 FADH轉移到Fe2-S2ox，再由 FAD還原Fe2-S2中心。這個單電子轉移的步驟產(chǎn)生了黃素半醌和Fe2-S2red 。最后由還原態(tài)的Fe2-S2將電子傳遞給 MMOH 的雙核鐵中心。其電子傳遞鏈為：3結論與展望：總之，近年來在 MMO的研究方面取得了很大的進展，通過動力學、理論化學和光譜動力學等方法，MMO 的催化機理正被逐步深入了解。MMO 催化反應高效、條件溫和、無污染，催化烷烴的羥基化、烯烴的環(huán)氧化和鹵代烴、芳烴的降解反應使得 MMO在工業(yè)應用、醫(yī)藥和環(huán)境治理上有著廣泛的應用前景。

14、只有更加清晰的了解 MMO的催化機制，才能盡快地使 MMO得到應用， 造福人類。 然而目前存在影響 MMO進行工業(yè)應用的問題主要有： （1）MMO 需要輔酶如 NADH 作為反應過程中氫或電子的傳遞體，而輔酶價格昂貴且不穩(wěn)定，將成為工業(yè)應用中的瓶頸因素。 （2）菌種的來源不同，酶的催化機理可能不同目前還沒有統(tǒng)一的機理來解釋 MMO的反應過程。因此，對 MMO的催化機理的研究有待深入。同時，MMO催化過程中輔酶的循環(huán)問題還有待解決。 目前，對 MMO 進行結構模擬的模型化合物層出不窮14。模型化合物具有結構簡單，穩(wěn)定性強，機理研究容易， 反應過程中不需要輔酶等優(yōu)點，為進一步了解 MMO和進行MM

15、O工業(yè)應用指出了一條新的道路。未來所面臨的挑戰(zhàn)就是解決 MMO的工業(yè)應用問題，以及利用 MMO的結構和催化機制合成一些功能型的模型化合物替代 MMO，從而展開工業(yè)應用。參考文獻： 1 RYLE M J, HAUSINGER R P. Non-heme iron oxygenases J. Curr Opin Chem Biol, 2002, 6(2):193-201. 2 MERKX M, KOPP D A, SAZINSKY M H, et al. Dioxygen activation and methane hydroxylation by solublemethane monooxyg

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