真核生物基因組DNA序列的復(fù)雜度

1、第二節(jié)真核生物基因組DNA序列的復(fù)雜度一、重復(fù)序列的檢測真核生物基因組DNA C值的巨大差異提出了一個重要的問題，是否C值愈大的物種就含有更多的基因？還是基因數(shù)目并未增加而是含有大量不編碼蛋白質(zhì)的重復(fù)序列DNA？如果是基因數(shù)目隨著C值大小而增加，那么編碼這些結(jié)構(gòu)基因的單一DNA序列的數(shù)量也應(yīng)隨之增加，相反如基因組中DNA含大量不編碼的重復(fù)序列，那么基因的數(shù)目就不一定與C值成比例增加。為此可通過復(fù)性動力學(xué)來檢測基因組DNA序列的復(fù)雜性（sequence complesity of DNA poputation）。也就是通過DNA的變性（denaturation）和復(fù)性（renaturation）

2、反應(yīng)的動力學(xué)過程分析DNA序列的性質(zhì)，由于復(fù)性的速率取決于互補的DNA序列之間的隨機(jī)碰撞，所以DNA復(fù)性是一個雙分子二級反應(yīng)。單鏈消失速度其中：C為單鏈DNA的濃度（單位是每升的核苷酸摩爾數(shù)）；t為時間（單位為s）；k為重組速率常數(shù)（單位是Lmol·s），k取決于陽離子濃度、溫度、片段大小和DNA序列的復(fù)雜性。當(dāng)t=0時，CC0，表明所有DNA都是單鏈，C0為DNA總濃度。復(fù)性的分?jǐn)?shù)CC0是起始濃度和經(jīng)過時間的乘積C0t的函數(shù)，這樣的函數(shù)繪成圖稱為C0t曲線（圖7-3）。從方程式可見控制復(fù)性反應(yīng)的參數(shù)是C0t，如當(dāng)tt1/2時，即如果基因組中每一種基因只有一個，即都是單拷貝序列，那么

3、基因組愈大則基因組的復(fù)雜性愈大，復(fù)性速率愈小，k也愈小，所以C0t1/2與非重復(fù)序列的基因組大小呈正比。即圖6-3表明，C0t1/2與基因組的大小成正比。其中polyUpolyA，其kC0t1/2=1個核苷酸對，因而復(fù)性最快；MS2是RNA噬菌體，T4為DNA噬菌體，每個基因組的大小用箭頭標(biāo)于圖的上方。二、DNA序列的類別不同生物基因組的C0t1/2是不相同的，C0t1/2的位置除了決定于基因組的大小以外，還取決于每個基因的核苷酸序列的重復(fù)次數(shù)，重復(fù)次數(shù)愈少則復(fù)性愈慢，C0t1/2的位置愈后，重復(fù)次數(shù)愈多，C0t1/2位置愈前。真核生物基因組的復(fù)性曲線往往出現(xiàn)兩個或3個明顯不同的C0t1/2位

4、置，說明這類基因組中包含著重復(fù)次數(shù)顯然不同的幾個成分（圖7-4），該圖是假設(shè)的一個真核生物基因組復(fù)性曲線。從上圖可以看出，最后復(fù)性這部分DNA的C0t1/2630，它占全部DNA的45，相當(dāng)于3.0×108bp，重復(fù)頻率為1；中間這部分DNA的C0t1/2=1.4，占全部DNA的30，相當(dāng)于60×105bp，該DNA序列重復(fù)頻率為350；復(fù)性最快部分DNA的C0t1/20.0013，占基因組DNA的25，相當(dāng)于340bp，重復(fù)頻率為5×105。顯然第一部分，即復(fù)性最慢的部分是單拷貝DNA序列，第二部分為少量重復(fù)或中度重復(fù)DNA序列，第三部分為高度重復(fù)DNA序列。因

5、此真核生物基因組序列大致可分為許多類型。（一）單拷貝序列（unique sequence）亦稱非重復(fù)序列（nonrepetitive sequence）在一個基因組中只有一個拷貝或2-3個拷貝。真核生物的大多數(shù)基因在單倍體中都是單拷貝的。不同生物基因組中單拷貝序列所占的比例是不同的（圖7-5）。原核生物中一般只含有非重復(fù)序列，較低等的真核生物中大部分DNA也是單拷貝的。動物細(xì)胞基因組中將近50DNA是中度或高度重復(fù)的，特別是植物和兩棲類生物中單拷貝DNA序列降低，而中度和高度重復(fù)序列增加。從圖中還可看出，隨著生物的基因組大小的增加，非重復(fù)DNA片段長度也隨之增加，通常單拷貝序列比較短，只有10

6、00bp左右，故所占的DNA的百分比也很低。兩棲類和植物基因組C值的增加并非是單拷貝序列的增加，而是重復(fù)序列DNA比例的增加。非重復(fù)DNA很少達(dá)到2×109bp的。由此可見，非重復(fù)DNA含量和生物的相對復(fù)雜程度是一致的。而且大多數(shù)結(jié)構(gòu)基因是位于基因組的非重復(fù)DNA序列之中。單拷貝的基因編碼許多重要的蛋白質(zhì)，例如，絲心蛋白單拷貝基因能夠合成高達(dá)104的mRNA分子，每個mRNA分子又可合成出105個蛋白質(zhì)分子，這充說明單拷貝基因的高度表達(dá)能力。當(dāng)然也不是所有的單拷貝序列都是編碼多肽鏈的結(jié)構(gòu)基因，因為真核生物基因組中編碼的序列不過只有百分之幾。（二）中度重復(fù)序列（moderately r

7、epetitive sequence）中度重復(fù)序列中的重復(fù)單位平均長度約300bp，重復(fù)次數(shù)為10102，人的珠蛋白（紅血蛋白）基因?qū)儆谶@種少量重復(fù)序列，人的珠蛋白基因中除了包括已確定的8個珠蛋白功能基因和3個珠蛋白假基因外，還有一個近年發(fā)現(xiàn)的基因。假基因也屬于少量重復(fù)序列。另一類中度重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)為103105，該序列常以回文序列方式出現(xiàn)在基因組的許多位置上，一些回文序列中間間隔著單拷貝序列，另一些中間不存在單拷貝序列，所以經(jīng)變性復(fù)性后，前者可觀察到莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，后者則形成發(fā)夾圖像（圖7-6）。中度重復(fù)序列一般是不編碼的序列，這種重復(fù)序列和非重復(fù)序列一樣都不是一個長序列，它們都要被其他組分

8、所隔斷。（三）高度重復(fù)序列（highly repetitive sequence）顧名思義，高度重復(fù)序列就是在基因組中存在大量拷貝的序列，一般重復(fù)次數(shù)在106以上。通常這些序列的長度為6200bp，如衛(wèi)星DNA。這些重復(fù)序列大部分集中在異染色質(zhì)區(qū)，特別是在著絲粒和端粒附近。高度重復(fù)序列中常有一些AT含量很高的簡單串聯(lián)重復(fù)序列。因序列簡單，缺乏轉(zhuǎn)錄所必需的啟動子，故沒有轉(zhuǎn)錄能力。然而DNA復(fù)制能力卻和單一序列復(fù)制得一樣快。大多數(shù)高等真核生物DNA都有20以上的高度重復(fù)序列，而且數(shù)目變化很大，這類序列的多少對C值的影響可能最大。一般認(rèn)為大多數(shù)重復(fù)序列是過剩的DNA，但其中某些重復(fù)序列具有特殊的功能

9、，如調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，增強同源染色體之間的配對和重組，維持染色體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)mRNA前體的加工過程，參與DNA復(fù)制等，此外重復(fù)序列還可能是進(jìn)化的源泉之一。但是，重復(fù)序列的確切生物學(xué)意義尚有待闡明。三、衛(wèi)星DNA衛(wèi)星DNA（satellite DNA）是一類高度重復(fù)的DNA序列。各種DNA在氯化銫梯度離心中，平衡時的浮力密度決定于它的GC含量，GC含量越高，浮力密度越大。真核生物的DNA一般含有3050GC含量，在DNA的不同區(qū)段，GC含量約相差10。對一個物種來說，當(dāng)基因組DNA切斷成數(shù)百個堿基對的片段進(jìn)行超離心時，其浮力密度曲線是覆蓋一定浮力密度范圍的一條寬帶，但是有些DNA片段都含有異

10、常高或低的GC含量，常在主要DNA帶的前面或后面有一個次要的DNA帶相伴隨，這些小的區(qū)帶就像衛(wèi)星一樣圍繞著DNA主帶，故稱衛(wèi)星DNA。有的高度重復(fù)序列的堿基組成與基因組DNA總體的堿基組成差異不大，接近于平均值，因而并非所有的高度重復(fù)序列都能形成衛(wèi)星DNA。復(fù)性動力學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)高度重復(fù)的DNA與衛(wèi)星DNA一樣，具有串聯(lián)集中分布的特點。因此有時把這種高度重復(fù)序列稱為隱蔽衛(wèi)星DNA（cryptic satellite DNA）。衛(wèi)星DNA的重復(fù)單位長短不一，牛的衛(wèi)星DNA是1400bp，某些猴的衛(wèi)星DNA是172bp，蟹的衛(wèi)星DNA大部分是AT的重復(fù)序列，有時在30個左右的堿基對中才偶爾插入一個GC

11、對，因而AT含量達(dá)到97。果蠅（Dvirilis）有3條衛(wèi)星DNA區(qū)帶，也是多為AT對，并且還有一個隱蔽衛(wèi)星（表7-2）。Miklos 1985年的研究指出，果蠅Dnasutoides基因組的60由衛(wèi)星DNA構(gòu)成，而它們?nèi)慷继幵?對染色體的一對最大的染色體上，而這對染色體看來幾乎不含別的DNA。根據(jù)衛(wèi)星DNA的浮力密度可以分成、4類，它們的浮力密度分別是1.687、1.693、1.647和1.700gcm3。衛(wèi)星DNA在染色體上的位置可以用放射性標(biāo)記探針作DNA分子原位雜交（in situ hybri dization）來鑒定，發(fā)現(xiàn)4類衛(wèi)星DNA都能與人的各條染色體雜交，而且雜交的帶型也很相

12、似。說明這4類衛(wèi)星DNA也存在于人的染色體上，而且分布的狀況也相同。衛(wèi)星DNA分布于著絲粒附近的異染色質(zhì)區(qū)。由于異染色質(zhì)區(qū)是高度螺旋化的，DNA是不表達(dá)的。衛(wèi)星DNA在著絲粒處的集中分布可能與細(xì)胞分裂時染色體的運動有關(guān)。哺乳動物的衛(wèi)星DNA常常是多等級的，即一個大的重復(fù)單位是由若干個彼此相似的小重復(fù)單位串聯(lián)組成，每個小重復(fù)單位又由若干個彼此相似的更小的重復(fù)單位串聯(lián)組成。如小鼠衛(wèi)星DNA用限制性內(nèi)切酶EcoR切割，得到234240bp的一系列片段，序列分析發(fā)現(xiàn)其中234bp的帶在6070的衛(wèi)星DNA里都有這種序列。若將234bp的左、右各一半的各117bp排列起來進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)只有22個bp不同

13、，差異為19。說明234bp的重復(fù)單位是由117bp亞重復(fù)單位重復(fù)而來，由于突變而積累了差異。117bp的亞單位又可分成兩個58bp的14亞單位。4個58bp亞單位之間的差異達(dá)到40。58bp的亞單位又可分成兩個18的亞單位，其中之一是28bp（亞單位），另一部分是30bp（亞單位）。8個18亞單位之間的差異達(dá)61。如果再將18亞單位分成3個部分，每一部分都含有GAAAAACGT、GAAAAATGA、GAAAAAACT近似序列。由此推測小鼠的234bp高度重復(fù)序列可能是由一個9bp的祖先序列例如GAAAAATGT演化而來的。其演化原理可能是在某特定時刻由于某種原因使一個DNA序列橫向擴(kuò)增產(chǎn)生多

14、個串聯(lián)重復(fù)單位，經(jīng)92758117234bp4輪的橫向擴(kuò)增和突變積累過程，在這個過程中，使不同的重復(fù)單位失去同一性，也可能產(chǎn)生插入突變，致使現(xiàn)在的234bp的重復(fù)序列也并不完全相同。一般說衛(wèi)星DNA不受任何選擇壓的影響，因為它不編碼蛋白質(zhì)或RNA，因而小鼠衛(wèi)星DNA各個拷貝的序列有相似性而不完全相同。然而有些衛(wèi)星DNA如節(jié)肢動物的衛(wèi)星DNA是由幾乎相同的重復(fù)單位組成的。值得注意的是在人的第17號染色體上串聯(lián)分布的U2snRNA基因有1020個拷貝。每個重復(fù)單位約6000bp，而其編碼序列卻只有188bp。選擇壓作用于編碼序列而使其保持相同，這是不言而喻的。難以理解的是其余5800bp的間隔序列為什么也會保持相同？雖然其中有100bp左右的轉(zhuǎn)錄起始、終止