202X_202X學(xué)年高中生物1.2基因工程的基本操作程序課件新人教版選修3

1、1 1. .2 2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1.簡(jiǎn)述基因工程的原理及基本操作程序。2.能根據(jù)基因工程的操作程序設(shè)計(jì)出某一轉(zhuǎn)基因生物的研制過程。一二三四一、目的基因的獲取1.從基因文庫(kù)中獲取目的基因?qū)⒑心撤N生物不同基因的許多DNA片段導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存,各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫(kù)?；蛭膸?kù)包括兩種:基因組文庫(kù),即包含一種生物所有基因的文庫(kù);部分基因文庫(kù),即只包含一種生物的一部分基因的文庫(kù),如cDNA文庫(kù)。一二三四2.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因(1)PCR的含義:一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。(2)目的:短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因。

2、(3)原理:DNA雙鏈復(fù)制。(4)過程第一步,加熱至9095 ,DNA解鏈為單鏈。第二步,冷卻至5560 ,引物與單鏈DNA相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合。第三步,加熱至7075 ,熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶)從引物起始進(jìn)行互補(bǔ)鏈的合成。如此重復(fù)循環(huán)多次。(5)特點(diǎn):指數(shù)形式擴(kuò)增。一二三四3.用化學(xué)方法人工合成如果基因比較小,核苷酸序列又已知,也可以通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接人工合成。一二三四二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的組成:必須有目的基因、啟動(dòng)子、終止子以及 標(biāo)記基因等。1.啟動(dòng)子啟動(dòng)子是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段,位于基因的首端,是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位,可驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。2.終止子終

3、止子也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA短片段,位于基因尾端,使 轉(zhuǎn)錄在需要的地方停止。3.標(biāo)記基因標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因,從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)。一二三四三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.轉(zhuǎn)化目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi),并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程,稱為轉(zhuǎn)化。2.常用的導(dǎo)入方法(1)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞:采用最多的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,其次還有基因槍法和花粉管通道法。(2)將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞:最常用的方法是顯微注射技術(shù)。此方法的受體細(xì)胞多是受精卵。(3)將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞:Ca2+處理法。用Ca2+處理細(xì)胞,使細(xì)胞處于能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)

4、,這種細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞。將重組表達(dá)載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合,在一定溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子,完成轉(zhuǎn)化過程。一二三四四、目的基因的檢測(cè)與鑒定1.首先要檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的DNA上是否插入了目的基因,方法是采用DNA分子雜交技術(shù)。2.其次還要檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,方法是采用分子雜交技術(shù)。3.最后檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),從分子水平檢測(cè)的方法是采用抗原抗體雜交技術(shù)。有時(shí)還需進(jìn)行個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定。如需要做抗蟲或抗病的接種實(shí)驗(yàn)等。一二三四一、獲取目的基因的方法比較 一二三四二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建1.基因表達(dá)載體的組成及作用一二三四2.構(gòu)建過程 特別提醒不同基

5、因可以拼接的原因:不同生物的基因具有相同的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成,都是雙螺旋結(jié)構(gòu),都由四種脫氧核糖核苷酸組成;都遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則,即AT、GC。一二三四3.注意事項(xiàng)(1)基因表達(dá)載體載體:基因表達(dá)載體與載體相比增加了目的基因。(2)目的基因的插入位點(diǎn)不是隨意的:基因表達(dá)需要啟動(dòng)子與終止子的調(diào)控,所以目的基因應(yīng)插入啟動(dòng)子與終止子之間的部位,若目的基因插入啟動(dòng)子內(nèi)部,啟動(dòng)子將失去原功能。(3)啟動(dòng)子起始密碼子,終止子終止密碼子:啟動(dòng)子和終止子位于DNA片段上,分別控制轉(zhuǎn)錄過程的啟動(dòng)和終止;起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上,分別控制翻譯的啟動(dòng)和終止。(4)切割目的基因和載體并非只能用同一種限制酶。如

6、果用兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端相同,在DNA連接酶的作用下目的基因與載體也可以連接起來(lái)。一二三四三、目的基因的導(dǎo)入1.不同受體細(xì)胞的常用導(dǎo)入方法一二三四2.農(nóng)桿菌導(dǎo)入法分析 一二三四(1)完成基因表達(dá)載體的構(gòu)建,需要限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶。(2)目的基因能否在植株細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)的關(guān)鍵是目的基因是否插入到受體細(xì)胞中染色體的DNA上。(3)由棉株細(xì)胞形成抗蟲棉需要運(yùn)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)。特別提醒1.質(zhì)粒和重組質(zhì)粒是兩個(gè)不同概念,插入目的基因的質(zhì)粒稱為重組質(zhì)粒。2.(1)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法適用于雙子葉植物和裸子植物,因?yàn)樵谧匀粭l件下,農(nóng)桿菌能感染雙子葉植物和裸子植物,而對(duì)大多數(shù)單子葉植

7、物沒有感染能力。(2)單子葉植物常用的基因轉(zhuǎn)化方法是基因槍法。一二三四四、目的基因的檢測(cè)與鑒定 題型一題型二題型三題型一 基因文庫(kù)【例1】 下列關(guān)于cDNA文庫(kù)和基因組文庫(kù)的說法,錯(cuò)誤的是()A.cDNA文庫(kù)中的DNA來(lái)源于mRNA的逆轉(zhuǎn)錄過程B.如果某種生物的cDNA文庫(kù)中的某個(gè)基因與該生物的基因組文庫(kù)中的某個(gè)基因控制的性狀相同,則這兩個(gè)基因的結(jié)構(gòu)也完全相同C.cDNA文庫(kù)中的基因都沒有啟動(dòng)子D.一種生物的cDNA文庫(kù)可以有許多種,但基因組文庫(kù)只有一種解析:由于基因轉(zhuǎn)錄時(shí)只有編碼區(qū)段才能轉(zhuǎn)錄,所以以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成的DNA就只有外顯子區(qū)段,而缺少內(nèi)含子和啟動(dòng)子等非編碼區(qū)段,和原來(lái)的基因

8、結(jié)構(gòu)不相同。答案:B題型一題型二題型三題型二 基因表達(dá)載體的構(gòu)建【例2】 下圖是利用基因工程技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因植物,生產(chǎn)可食用疫苗的部分過程示意圖,其中Pst 、Sma 、EcoR、Apa為四種限制酶。下列說法錯(cuò)誤的是()題型一題型二題型三A.圖示過程是基因工程的核心步驟B.表達(dá)載體構(gòu)建時(shí)需要用到限制酶SmaC.抗卡那霉素基因的存在有利于將含有抗原基因的細(xì)胞篩選出來(lái)D.除圖示組成外,表達(dá)載體中還應(yīng)該含有啟動(dòng)子和終止子等結(jié)構(gòu)解析:圖示過程為基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程,是基因工程的核心步驟。構(gòu)建過程中需要將目的基因完整切割下來(lái),此時(shí)要用到限制酶Pst、EcoR。抗卡那霉素基因是標(biāo)記基因,用于鑒別和篩選含有

9、目的基因的細(xì)胞?；虮磉_(dá)載體包括啟動(dòng)子、目的基因、終止子和標(biāo)記基因等。答案:B題型一題型二題型三題型三 基因工程操作的具體步驟【例3】 下表中列出了幾種限制酶識(shí)別序列及其切割位點(diǎn),圖1、圖2中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)。請(qǐng)回答下列問題。題型一題型二題型三題型一題型二題型三(1)一個(gè)圖1所示的質(zhì)粒分子經(jīng)Sma切割前后,分別含有個(gè)游離的磷酸基團(tuán)。 (2)若對(duì)圖中質(zhì)粒進(jìn)行改造,插入的Sma酶切位點(diǎn)越多,質(zhì)粒的熱穩(wěn)定性越。 (3)用圖中的質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒,不能使用Sma切割,原因是 。 (4)與只使用EcoR相比較,使用BamH和Hind兩種限制酶同時(shí)處理質(zhì)粒、外源DNA的優(yōu)點(diǎn)在于可以防止。 (5)為了獲取重組質(zhì)粒,將切割后的質(zhì)粒與目的基因片段混合,并加入酶。 (6)重組質(zhì)粒中抗生素抗性基因的作用是為了。 題型一題型二題型三解析:(1)切割前質(zhì)粒為環(huán)狀,不含游離的磷酸基團(tuán)。切割后質(zhì)粒變成了一個(gè)鏈狀的雙鏈DNA分子,含2個(gè)游離的磷酸基團(tuán)。(2)Sma識(shí)別序列中均為GC堿基對(duì),G、C之間含三個(gè)氫鍵,熱穩(wěn)定性高。(3)據(jù)題圖可知,Sma既會(huì)破壞標(biāo)記基因,也會(huì)破壞