黃芩素治療子宮內(nèi)膜異位癥的作用研究

1、黃芩素治療子宮內(nèi)膜異位癥的作用研究         【摘要】  目的觀察黃芩素對大鼠子宮內(nèi)膜異位癥防治作用及其機(jī)制。 方法 采用手術(shù)移植法制備大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型,大鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組和黃芩素高、低劑量組，測定大鼠的血清TNF，IL6，IL8含量及脾臟NK細(xì)胞活性，采用免疫化學(xué)的方法檢測異位內(nèi)膜標(biāo)本中Bcl2，ICAM1的表達(dá)。結(jié)果黃芩素 治療 組與模型組相比血清TNF，IL6，IL8活性明顯降低，脾臟NK細(xì)胞活性顯著增高，異位內(nèi)膜標(biāo)本中ICAM1， Bcl2表達(dá)明顯下降。結(jié)論 黃芩素對子

2、宮內(nèi)膜異位癥大鼠具有治療作用，其作用機(jī)制可能與其抑制TNF，IL6，IL8產(chǎn)生，抑制ICAM1 ，BcI2的表達(dá)以及增強(qiáng)脾臟NK細(xì)胞活性有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  黃芩素；子宮內(nèi)膜異位癥； 自然 殺傷細(xì)胞；細(xì)胞間黏附分子1The Therapeutic Effects of Scutellarin on Endometriosis in Rats Abstract：ObjectiveTo investigate the therapeutic effects and mechanism of scutellarin on endometriosis in rats.Methods

3、The endometriosis  model of rats was created by surgical implantation and rats were randomly divided into four groups. At the end of the experiment,the activities of serum TNF，IL6，IL8  were observed, the expression of Bcl2 and ICAM-1  were also observed by immunohistochemistry and the

4、 activity of nature kill cell in spleen was measured.  ResultsThe activities of serum TNF，IL6，IL8 in scutellarin groups were lower than those in the model control group , the expressions of Bcl2，ICAM1 in scutellarin groups were lower than those in the model control group ,the activity of nature

5、 kill cell in spleen of scutellarin groups rose more significantly than that of the model control group .ConclusionScutellarin may have the therapeutic effect on the endometriosis  of rats by inhibiting the producing of serum TNF，IL6，IL8 , decreasing the expressions of Bcl2，ICAM-1 and enhancing

6、 the activity of nature kill cell in spleen.Key words：Scutellarin;   Endometriosis;   NK cell;   ICAM1   子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis EM) 是一種常見的婦科疾病，主要指子宮內(nèi)膜在子宮腔被覆面以外的地方種植生長，是一種具有侵襲性的良性病變。該病的表現(xiàn)主要為頑固性的痛經(jīng)，腹痛及不孕等，成為危害當(dāng)今育齡婦女健康及生活質(zhì)量的一種很重要的疾病。EM在育齡婦女中發(fā)病率約15%左右，在不孕婦女中高達(dá)50%，其

7、發(fā)生機(jī)制可能與體腔上皮化生學(xué)、激素、免疫、遺傳學(xué)說等因素相關(guān)1，2。黃酮類化合物是一類低分子的廣泛分布于植物界的天然植物成分,具有多方面的生物活性,如:抗炎、抗病毒、抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)以及抗腫瘤作用等。黃芩素（scutellarin）是從黃芩中提取的一種黃酮類單體化合物3。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型后給予黃芩素進(jìn)行治療，觀察黃芩素對子宮內(nèi)膜異位癥大鼠細(xì)胞因子，ICAM1及凋亡相關(guān)因素的 影響 ，為探討子宮內(nèi)膜異位癥的治療提供 理論 和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1  材料與方法1.1  材料雌性Wistar大鼠，體重為（220±20） g，鼠齡812周，由華中 科技

8、 大學(xué)同濟(jì)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。黃芩素：sigma公司；大鼠IL6， TNFa檢測試劑盒、大鼠IL8 ELISA檢測試劑盒：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Bcl2檢測試劑盒、大鼠ICAM1檢測試劑盒：武漢博士德生物技術(shù)有限公司；其余為國產(chǎn) 分析 醇。I125一放免測定儀及FJ2107液體閃爍計(jì)數(shù)器：西安262廠；ELISA酶標(biāo)儀：美國BioRed公司2550型。1.2  動物模型及分組造模方法4：雌性未孕Wistar大鼠，體重（220±20）g。皮下注射乙烯雌酚0.2 mg/只促情，以20%烏拉坦1.5 g/kg ip麻醉，待麻醉生效后，將大鼠固定操作臺上，腹部剪毛，碘伏消毒

9、，在無菌條件下開腹，約1.5 cm長，右側(cè)離卵巢0.5 cm處分離子宮，結(jié)扎后在中間剪取約2 cm一段子宮，剖開子宮剝離子宮內(nèi)膜，將內(nèi)膜剪成3塊，分別縫于子宮分叉處、左側(cè)卵巢附近、左側(cè)腹膜壁層，關(guān)腹縫合。每鼠ip慶大霉素0.1 ml × 3 d，正常清潔飼養(yǎng)。正常飼養(yǎng)1個(gè)月后再次開腹，大鼠異位組織生長好，肉眼觀察見移植物體積增大，呈結(jié)節(jié)狀、囊狀，內(nèi)有液體積聚，有的為內(nèi)含血性液的囊性小泡，周圍被結(jié)締組織覆蓋，并有血管生成，表明模型成功。實(shí)驗(yàn)分4組:正常對照組、模型對照組、黃芩素高劑量組（4 mg/kg），黃芩素低劑量組（2 mg/kg），于造模1個(gè)月后腹腔給藥，連續(xù)4周，4周后無菌摘取

10、大鼠眼球取血，然后斷頭處死，剖取大鼠在位及異位子宮內(nèi)膜組織及脾組織。1.3 檢測指標(biāo)1.4  學(xué)方法所有數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)處理。2  結(jié)果2.1  病理組織HE染色模型組：異位內(nèi)膜呈子宮腔狀或環(huán)形鋸齒狀封閉式結(jié)構(gòu)，有囊腫形成，囊壁厚。腺體數(shù)目多，腺體上皮呈柱狀，腺腔大，增生現(xiàn)象明顯，向間質(zhì)生長，呈假腺體改變。間質(zhì)中有大量炎細(xì)胞浸潤，血管較多。治療組：異位內(nèi)膜呈縫隙狀，個(gè)別呈環(huán)狀封閉式結(jié)構(gòu)，多無囊腫形成。異位內(nèi)膜極薄，呈萎縮性改變，腺體數(shù)目少，腺腔小，腺上皮呈扁平或矮立方形，未見假腺體改變，間質(zhì)細(xì)胞小而稀疏，并有纖維化傾向,有少量白細(xì)胞浸潤

11、，血管較模型組少。         2.2  黃芩素對子宮內(nèi)膜異位大鼠血漿PGF2，PGE2的 影響 與正常對照組相比模型組大鼠外周血中PGF2，PGE2含量顯著升高（P0.01），黃芩素與模型組相比外周血中PGF2，PGE2含量明顯降低，兩者有明顯差異性（P0.01或P0.05）。結(jié)果見表1。表1  黃芩素對子宮內(nèi)膜異位大鼠血漿PGF2a，PGE2的影響（略）2.3  黃芩素對子宮內(nèi)膜異位大鼠血清細(xì)胞因子的影響模型組大鼠外周血中TNF，IL6，IL8含量明顯高于正常對照組，黃芩素能降

12、低外周血中TNF，IL6，IL8含量，使TNF，IL6，IL8含量趨于正常水平，與模型組相比有明顯差異性（P0.01或P0.05）。結(jié)果見表2。表2  黃芩素對子宮內(nèi)膜異位大鼠血清TNF，IL6，IL8的影響(略)2.4  黃芩素對子宮內(nèi)膜異位大鼠ICAM-1表達(dá)的影響細(xì)胞膜和細(xì)胞漿棕色反應(yīng)為陽性，無棕色反應(yīng)為陰性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠細(xì)胞膜和細(xì)胞均呈漿棕色反應(yīng)，模型組局部ICAM- 1陽性表達(dá)明顯強(qiáng)于正常組，黃芩素能明顯降低子宮內(nèi)膜異位大鼠局部ICAM- 1含量，以高劑量組效果明顯，使ICAM- 1表達(dá)趨于正常，與正常組相比無顯著性差異。結(jié)果見表3。表3 

13、黃芩素對子宮內(nèi)膜異位大鼠NK細(xì)胞活性的影響（略）3  討論   子宮內(nèi)膜異位癥自1860年首次發(fā)現(xiàn)至今其發(fā)病機(jī)制仍不清楚， 治療 的副作用較大且治療后容易復(fù)發(fā)，處理十分棘手。近年來 研究 發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜異位癥患者血中的免疫異常是繼發(fā)于細(xì)胞免疫功能缺陷。在子宮內(nèi)膜異位癥患者腹腔中的巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞及T細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用被抑制，而外周血單核細(xì)胞又可以刺激子宮內(nèi)膜細(xì)胞在異位種植和生長，子宮內(nèi)膜細(xì)胞在腹腔中成功種植以后，在一些內(nèi)分泌的、免疫的及血管形成因子的作用下進(jìn)一步的 成為子宮內(nèi)膜異位癥。   越來越多的證據(jù)表明，細(xì)胞因子在子宮內(nèi)膜異位癥的形成、

14、發(fā)展中起重要作用。細(xì)胞因子是由細(xì)胞產(chǎn)生，在細(xì)胞間相互作用并溝通信息的一類介導(dǎo)炎癥和免疫反應(yīng)的多肽類蛋白，有著廣泛而復(fù)雜的生物學(xué)活性。在子宮內(nèi)膜異位癥患者腹腔液中巨噬細(xì)胞數(shù)量增多、活性增強(qiáng)，活化的巨噬細(xì)胞釋放TNF，IL2, IL6, IL8, IL10, IL13等一系列細(xì)胞因子，細(xì)胞因子在腹腔液內(nèi)通過局部漸而作用全身5。通過刺激T, B淋巴細(xì)胞增殖、活化，介導(dǎo)免疫反應(yīng)，促進(jìn)前列腺素如PGF2，PGE2合成，并且導(dǎo)致局部纖維母細(xì)胞增生、膠原沉積和纖維蛋白形成，使得盆腔纖維化和粘連，促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)展6。   ICAM- 1是粘附分子免疫球蛋白超家族中非常重要的一種，存

15、在于細(xì)胞表面，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間或細(xì)胞與基質(zhì)間相互接觸和結(jié)合的分子。研究表明7，異位內(nèi)膜ICAM- 1蛋白表達(dá)量明顯高于對照組。ICAM-1表達(dá)升高一方面直接促進(jìn)異位內(nèi)膜黏附種植，另一方面可產(chǎn)生免疫抑制和降低NK細(xì)胞活性8。NK細(xì)胞活性下降可使異位內(nèi)膜細(xì)胞未能被識別、溶解和清除，而有機(jī)會進(jìn)一步黏附種植。因此ICAM 1可能是異位內(nèi)膜細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視，進(jìn)而黏附侵襲種植的機(jī)理之一。   研究也發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜細(xì)胞生長特性可能與細(xì)胞凋亡改變有關(guān)，多種凋亡相關(guān)基因參與其中并相互影響。在EM患者正常位和異位子宮內(nèi)膜中都有Bcl2表達(dá)9。EM患者的正常位子宮內(nèi)膜在增生期Bcl2

16、蛋白陽性率高，到黃體后期，Bcl-2陽性率降低，在異位子宮內(nèi)膜組織Bcl2呈陽性。異位內(nèi)膜細(xì)胞可通過Bcl2基因的高表達(dá)而增強(qiáng)自身的抗凋亡能力，延長其壽命，得以在宮腔外存活及種植，形成異位病灶。   本實(shí)驗(yàn)通過手術(shù)將大鼠子宮內(nèi)膜移植到卵巢周圍組織及腹壁的 方法 成功復(fù)制子宮內(nèi)膜異位癥的模型，給予黃芩素進(jìn)行治療。結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芩素能明顯減輕子宮內(nèi)膜異位癥大鼠的病理損傷，降低血中前列腺素（PGF2a，PGE2）的合成，抑制TNF，IL6，IL8等細(xì)胞因子的表達(dá)以及增強(qiáng)脾臟NK細(xì)胞活性。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)黃芩素通過降低異位內(nèi)膜細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)和ICAM - 1蛋白的表達(dá)，使異位內(nèi)膜細(xì)胞

17、的凋亡抑制解除，縮短異位內(nèi)膜細(xì)胞的壽命，并且抑制異位內(nèi)膜的黏附、侵襲、種植，達(dá)到清除異位病灶從而達(dá)到治療子宮內(nèi)膜異位癥的目的?！?參考 文獻(xiàn) 】 1Vasquez J, Bastias C, Mink MB. Techniques of Treatment of Peritoneal Endometriosis: The Cavitational Ultrasonic Surgical AspiratorJ.Surg Technol Int. 1998，VII：263.2Dmowski WP, Gebel H, Braun DP. Decreased apoptosis and se

18、nsitivity to macrophage mediated cytolysis of endometrial cells in endometriosisJ.Hum Reprod Update. 1998 ，4(5)：696.3陳季武， 朱振勤， 胡天喜，等.天然黃酮類化合物清除羥自由基的構(gòu)效關(guān)系J. 中國 藥 報(bào)，2002，23（7）：667.4劉建文. 藥理實(shí)驗(yàn)方M.北京：化學(xué) 工業(yè) 出版社， 2003.5Darai E, Detchev R, Hugol D, Quang NT. Serum and cyst fluid levels of interleukin (IL) 6, IL8 and tumour necrosis factor-alpha in women with endometriomas and benign and malig