農(nóng)殘分析12--農(nóng)藥殘留的酶抑制法與免疫測定

1、農(nóng)藥殘留的酶抑制法與免疫測農(nóng)藥殘留的酶抑制法與免疫測定技術(shù)定技術(shù)6.1 酶抑制分析測定法酶抑制分析測定法 1951年年,Giang與與Hall應(yīng)用有機磷和氨基甲酸應(yīng)用有機磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥在體外對膽堿酯酶具有抑制作用的機理來酯農(nóng)藥在體外對膽堿酯酶具有抑制作用的機理來測定其含量測定其含量. 1968年年Mendoza利用薄層利用薄層-酶抑制技術(shù)測定酶抑制技術(shù)測定10種有機磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥種有機磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥,最小檢出量可達納最小檢出量可達納克水平克水平. 1975年年Kramer與與Gamson用一種與靛酚乙酸用一種與靛酚乙酸酯相似的化合物酯相似的化合物,測定測定110g的各種有機磷酸酯的

2、各種有機磷酸酯化合物化合物,與此同時與此同時,Zweig等也測定了甲萘威等農(nóng)藥等也測定了甲萘威等農(nóng)藥. 進入進入20世紀世紀80年代年代,人們開始以來源豐富人們開始以來源豐富,取取材和制備都十分方便的材和制備都十分方便的植物酶源植物酶源,建立薄層建立薄層-植物植物酯酶抑制方法酯酶抑制方法,為酶抑制法的進一步推廣和應(yīng)用創(chuàng)為酶抑制法的進一步推廣和應(yīng)用創(chuàng)造了條件造了條件.6.1.2 酶法檢測原理酶法檢測原理 有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥 對參與神經(jīng)生理傳對參與神經(jīng)生理傳遞過程的乙酰膽堿酯酶遞過程的乙酰膽堿酯酶AChE具有抑制作用具有抑制作用,使該酶使該酶的分解作用不能正常進行的分

3、解作用不能正常進行,從而導(dǎo)致底物乙酰膽堿的從而導(dǎo)致底物乙酰膽堿的積累積累,影響動物正常的神經(jīng)傳導(dǎo)影響動物正常的神經(jīng)傳導(dǎo),引起中毒或死亡引起中毒或死亡. 可將這一昆蟲毒理學原理應(yīng)用到農(nóng)藥殘留檢測可將這一昆蟲毒理學原理應(yīng)用到農(nóng)藥殘留檢測中中,如果農(nóng)產(chǎn)品樣品提取液中不含有或含有很低的有如果農(nóng)產(chǎn)品樣品提取液中不含有或含有很低的有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥,酶的活性就不被抑制酶的活性就不被抑制,試樣試樣中加入的基質(zhì)就被酶水解中加入的基質(zhì)就被酶水解,或少部分水解或少部分水解, 水解產(chǎn)物水解產(chǎn)物與加入的顯色劑反應(yīng)產(chǎn)生顏色與加入的顯色劑反應(yīng)產(chǎn)生顏色;反之反之,如果試樣提取液如果試樣提取液中含

4、有一定量的有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥中含有一定量的有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥, 酶的活酶的活性就被抑制性就被抑制,試樣中加入的基質(zhì)就不被酶水解試樣中加入的基質(zhì)就不被酶水解, 從而從而不顯色或顏色很淺不顯色或顏色很淺,用分光光度計測定吸光度值用分光光度計測定吸光度值,計算計算出抑制率出抑制率,就可判斷出樣品中農(nóng)藥殘留情況就可判斷出樣品中農(nóng)藥殘留情況.6.1.3 酶源選擇與提取酶源選擇與提取 酶源選擇是生物酶技術(shù)應(yīng)用的基礎(chǔ)酶源選擇是生物酶技術(shù)應(yīng)用的基礎(chǔ),其其性質(zhì)的好壞性質(zhì)的好壞,特異性大小特異性大小,穩(wěn)定與否直接關(guān)系穩(wěn)定與否直接關(guān)系到檢測的結(jié)果到檢測的結(jié)果. 在酶抑制檢測的技術(shù)中在酶抑制檢測的技術(shù)中,

5、既有應(yīng)用既有應(yīng)用AChE的的,也有應(yīng)用非特異性酯酶的也有應(yīng)用非特異性酯酶的,其來源其來源既有動物的既有動物的,也有植物的也有植物的.6.1.4 底物和底物和 顯色劑顯色劑 酶抑制劑顯色反應(yīng)可使用的底物和顯酶抑制劑顯色反應(yīng)可使用的底物和顯色劑很多色劑很多,大致可分為以下幾類大致可分為以下幾類:(1)乙酰膽堿乙酰膽堿-溴百里酚藍顯色溴百里酚藍顯色;(2) 乙酸乙酸-萘酯萘酯-固藍固藍B鹽顯色反應(yīng)鹽顯色反應(yīng);(3)乙酸羥基吲哚顯色法乙酸羥基吲哚顯色法;(4)乙酸靛酯顯色法乙酸靛酯顯色法;6.1.5 檢測方法檢測方法(1)比色法比色法: 我國農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所利用酶抑我國農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所利用酶抑制產(chǎn)生的

6、顯色反應(yīng)制產(chǎn)生的顯色反應(yīng),通過分光光度計比色測通過分光光度計比色測定酶的抑制率定酶的抑制率,以測定有機磷和氨基甲酸酯以測定有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量類農(nóng)藥殘留量.(2)酶片法酶片法: 酶片即為浸漬有膽堿酯酶或其他敏感酶酶片即為浸漬有膽堿酯酶或其他敏感酶類的濾紙或類似載體物質(zhì)類的濾紙或類似載體物質(zhì).(3)固相酶速測技術(shù)固相酶速測技術(shù)6.2 免疫檢測技術(shù)免疫檢測技術(shù) 6.2.1免疫分析概述免疫分析概述 當細菌、病毒和有害物等病原入侵時當細菌、病毒和有害物等病原入侵時,能產(chǎn)生能產(chǎn)生抵御外來物的抗體，這就是動物的免疫反應(yīng)，致抵御外來物的抗體，這就是動物的免疫反應(yīng)，致病的外來物稱為抗原。病的外來物稱

7、為抗原。 免疫分析是以抗原與抗體的特異性、可逆性免疫分析是以抗原與抗體的特異性、可逆性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析技術(shù)。結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析技術(shù)。6.2.2酶聯(lián)免疫吸附測定法酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA) 原理是在測定過程，樣品提取液中的農(nóng)藥與原理是在測定過程，樣品提取液中的農(nóng)藥與已知數(shù)量的酶聯(lián)劑競爭有限數(shù)量的抗體吸附位點。已知數(shù)量的酶聯(lián)劑競爭有限數(shù)量的抗體吸附位點。 為了觀察測定結(jié)果，往往加入底物和顯色劑，為了觀察測定結(jié)果，往往加入底物和顯色劑，以產(chǎn)生顏色變化。根據(jù)樣品顏色和標準物質(zhì)顏色以產(chǎn)生顏色變化。根據(jù)樣品顏色和標準物質(zhì)顏色的吸光度之差就可計算出樣品中農(nóng)藥的含量的吸光度之差就可計算出樣品中農(nóng)藥

8、的含量. 農(nóng)藥殘留免疫分析方法的建立，一般包括待農(nóng)藥殘留免疫分析方法的建立，一般包括待測農(nóng)藥的選擇、半抗原合成、人工抗原合成、抗測農(nóng)藥的選擇、半抗原合成、人工抗原合成、抗體制備和樣品前處理方法等幾個步驟體制備和樣品前處理方法等幾個步驟.(1)直接直接ELISA原理原理: 是在抗原與抗體發(fā)生反應(yīng)后，直接進行顯色是在抗原與抗體發(fā)生反應(yīng)后，直接進行顯色的非均相固相反應(yīng)免疫分析方法。的非均相固相反應(yīng)免疫分析方法。 1類類:首先將抗原固定在聚苯乙烯反應(yīng)板孔內(nèi)壁，首先將抗原固定在聚苯乙烯反應(yīng)板孔內(nèi)壁，然后加入然后加入待測抗原待測抗原和和酶標記酶標記抗體，固相抗原與待抗體，固相抗原與待測游離抗原競爭測游離抗

9、原競爭有限量有限量的酶標記抗體，反應(yīng)后洗的酶標記抗體，反應(yīng)后洗去可溶性的游離抗原與抗體的結(jié)合物，加入酶作去可溶性的游離抗原與抗體的結(jié)合物，加入酶作用底物，測定固相抗原與抗體結(jié)合物上的酶活性，用底物，測定固相抗原與抗體結(jié)合物上的酶活性，便可得到待測抗原的量。酶反應(yīng)活性與待測抗原便可得到待測抗原的量。酶反應(yīng)活性與待測抗原的量呈負相關(guān)的量呈負相關(guān).2類: 首先固定抗體，然后同時加入待測抗原和酶標首先固定抗體，然后同時加入待測抗原和酶標記抗原，待測抗原與酶標記抗原競爭記抗原，待測抗原與酶標記抗原競爭有限量有限量的固的固相抗體，反應(yīng)后測定固相抗體與酶標記抗原結(jié)合相抗體，反應(yīng)后測定固相抗體與酶標記抗原結(jié)合

10、物上的酶活性，便可得到待測抗原的量。物上的酶活性，便可得到待測抗原的量。 酶活性酶活性強度與待測抗原呈負相關(guān)。強度與待測抗原呈負相關(guān)。(2) 間接間接ELISA原理原理 首先固定抗原，然后加入待測抗原和抗體，首先固定抗原，然后加入待測抗原和抗體，固相抗原與待測抗原競爭有限的第一輪抗體，反固相抗原與待測抗原競爭有限的第一輪抗體，反應(yīng)后洗去游離的結(jié)合物，再加入酶標記的第二抗應(yīng)后洗去游離的結(jié)合物，再加入酶標記的第二抗體體(以第一抗體為抗原的酶標記抗體以第一抗體為抗原的酶標記抗體)，反應(yīng)后吸，反應(yīng)后吸取酶標記的游離抗體，測定結(jié)合物上的酶活性。取酶標記的游離抗體，測定結(jié)合物上的酶活性。酶活性與待測抗原濃

11、度呈負相關(guān)。酶活性與待測抗原濃度呈負相關(guān)。(3)半抗原的制備 抗原是指一切能刺激機體產(chǎn)生抗體和致敏淋抗原是指一切能刺激機體產(chǎn)生抗體和致敏淋巴細胞，并能與之結(jié)合發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的物巴細胞，并能與之結(jié)合發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的物質(zhì)。質(zhì)。 抗原具有抗原具有免疫原性免疫原性和和反應(yīng)原性反應(yīng)原性。 免疫原性免疫原性是指能刺激機體產(chǎn)生抗體或能誘導(dǎo)是指能刺激機體產(chǎn)生抗體或能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)；機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)； 而而反應(yīng)原性反應(yīng)原性是指能與其誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體或致是指能與其誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體或致敏淋巴細胞進行反應(yīng)的特性。敏淋巴細胞進行反應(yīng)的特性。 既具有免疫原性反又具有反應(yīng)原性的抗原稱既具有免疫原性反又具有

12、反應(yīng)原性的抗原稱為為完全抗原完全抗原, 而只具有而只具有反應(yīng)原性反應(yīng)原性而沒有免疫原性而沒有免疫原性的抗原稱為的抗原稱為不完全抗原不完全抗原,也稱也稱半抗原半抗原.(4)人工免疫抗原的合成人工免疫抗原的合成 首先將半抗原活化，然后通常是在條件溫和首先將半抗原活化，然后通常是在條件溫和的水溶液中將半抗原與載體蛋白共價結(jié)合。的水溶液中將半抗原與載體蛋白共價結(jié)合。 如半抗原分子含有羧基，可用碳二亞胺法或如半抗原分子含有羧基，可用碳二亞胺法或混合酸酐法，如具有羥基活性基團則采用琥珀酸混合酸酐法，如具有羥基活性基團則采用琥珀酸酐法酐法.(5)農(nóng)藥抗體制備農(nóng)藥抗體制備 農(nóng)藥抗體是經(jīng)由小分子農(nóng)藥與大分子載體

13、偶農(nóng)藥抗體是經(jīng)由小分子農(nóng)藥與大分子載體偶聯(lián)后的聯(lián)后的復(fù)合物復(fù)合物免疫動物使機體產(chǎn)生抗農(nóng)藥的抗體，免疫動物使機體產(chǎn)生抗農(nóng)藥的抗體，并取其免疫動物血清，然后進行分離、鑒定其特并取其免疫動物血清，然后進行分離、鑒定其特異性而得到的。農(nóng)藥抗體的產(chǎn)生一般可采用兩種異性而得到的。農(nóng)藥抗體的產(chǎn)生一般可采用兩種途徑途徑.1)多克隆抗體技術(shù)多克隆抗體技術(shù) 多克隆抗體是由許多多克隆抗體是由許多B淋巴細胞克隆產(chǎn)生的混合抗體淋巴細胞克隆產(chǎn)生的混合抗體.2)雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)單抗雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)單抗 單克隆抗體是指由一個單克隆抗體是指由一個B淋巴細胞分化增殖的漿細胞淋巴細胞分化增殖的漿細胞產(chǎn)生的針對單一抗原決定簇的抗體產(chǎn)生的

14、針對單一抗原決定簇的抗體.(6)ELISA方法的選擇方法的選擇分為五種類型分為五種類型:1)酶標抗原直接競爭抑制法酶標抗原直接競爭抑制法;2)酶標抗體直接競爭抑制法酶標抗體直接競爭抑制法;3)酶標抗體間接競爭抑制法酶標抗體間接競爭抑制法;4)抗體夾心法抗體夾心法; 5)間接夾心法間接夾心法(7)實驗條件的選擇實驗條件的選擇 必須注意以下幾個方面必須注意以下幾個方面: 1)確定酶結(jié)合的最適濃度確定酶結(jié)合的最適濃度. 2) 確定包被物質(zhì)的最適濃度確定包被物質(zhì)的最適濃度. 3)樣品往往會產(chǎn)生交叉反應(yīng)樣品往往會產(chǎn)生交叉反應(yīng). 4)樣品前處理時樣品前處理時,使用的溶液必須考慮其影響抗體使用的溶液必須考慮

15、其影響抗體對分析物識別的可能性對分析物識別的可能性.(8)ELISA法的特點法的特點: 1)適用現(xiàn)場快速篩選適用現(xiàn)場快速篩選; 2)適用常規(guī)方法難以檢測的農(nóng)藥適用常規(guī)方法難以檢測的農(nóng)藥; 3)適用環(huán)境監(jiān)控適用環(huán)境監(jiān)控.6.3 生物傳感器在農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用6.3.1 生物傳感器的原理生物傳感器的原理 生物傳感器是指由一種生物敏感部件與轉(zhuǎn)換生物傳感器是指由一種生物敏感部件與轉(zhuǎn)換器緊密配合器緊密配合,對特定種類物質(zhì)或生物活性物質(zhì)具有對特定種類物質(zhì)或生物活性物質(zhì)具有選擇性和可逆響應(yīng)的分析裝置選擇性和可逆響應(yīng)的分析裝置. 傳感器的生物敏感層與復(fù)雜樣品中特定的目傳感器的生物敏感層與復(fù)雜樣品中特定的目標分析物之間標分析物之間,如酶與底物如酶與底物,抗原與抗體抗原與抗體,外源凝集外源凝集素與糖素與糖,核酸與其互補片段之間的識別反應(yīng)會產(chǎn)生核酸與其互補片段之間的識別反應(yīng)會產(chǎn)生一些物理化學信號的變化一些物理