體外診斷試劑膠乳比濁法學(xué)習(xí)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上膠乳免疫比濁法相關(guān)知識(shí)很多公司開(kāi)展了熒光膠乳免疫層析做定量分析及膠乳增強(qiáng)免疫比濁分析項(xiàng)目，關(guān)注膠乳標(biāo)記技術(shù)的技術(shù)人員越來(lái)越多。本人總結(jié)了部分膠乳微球標(biāo)記技術(shù)，并加以分類(lèi)，以便朋友們查閱：膠乳微球物理吸附：反應(yīng)微球帶磺酸基、羧基、醛基表面的都是疏水微球，都可以用來(lái)設(shè)計(jì)被動(dòng)吸附蛋白。磺酸基微球表面含帶有負(fù)電荷的磺酸基團(tuán)，pka大約為2，因此在酸性pH保持穩(wěn)定。醛基微球表面也帶有磺酸基團(tuán)，但能和蛋白行程共價(jià)鍵。羧基微球表面含帶負(fù)電荷的羧基基團(tuán)，在pH5.0以上時(shí)保持穩(wěn)定。帶有疏水基團(tuán)的蛋白的吸附和配位結(jié)合，是最簡(jiǎn)單和直接的標(biāo)記方法。這種方法中，微球溶液和含目標(biāo)蛋白的溶液混合

2、，反應(yīng)后，未結(jié)合的游離蛋白通過(guò)清洗步驟除去，從而獲得膠體蛋白復(fù)合物。疏水吸附方法只能用于疏水微球（硫酸鹽、羧基、醛基表面修飾的微球）。醛基表面修飾微球是一個(gè)特例，其疏水吸附結(jié)果取決于后來(lái)的共價(jià)結(jié)合。雖然物理吸附是不依賴pH的，但反應(yīng)緩沖液的pH對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)有非常大的影響，從而影響蛋白吸附到微球上的反應(yīng)效率。一般，在被吸附蛋白等電點(diǎn)附近pH時(shí)，物理吸附效率會(huì)很高。反應(yīng)步驟： 1.  用反應(yīng)緩沖液系數(shù)蛋白到10mg/ml；2.  用反應(yīng)緩沖液系數(shù)膠乳微球到1%；3.  將蛋白溶液加入到膠乳微球溶液中，10ml膠乳中加入1ml蛋白溶液。室溫

3、攪拌孵育2hr；4.  離心或超濾，除去未結(jié)合蛋白；5.  將微球蛋白復(fù)合物用儲(chǔ)存緩沖液溶解。注意事項(xiàng)：1.  最優(yōu)蛋白標(biāo)記量影響因素1）  有效比表面積：粒徑減小時(shí)，比表面積/mg微球值得增加；2）  膠體穩(wěn)定性：蛋白對(duì)膠乳有穩(wěn)定和去穩(wěn)定作用；3）  免疫反應(yīng)：最近標(biāo)記量由免疫反應(yīng)需要決定。2.  膠乳微球中加入蛋白后，快速攪拌混合，利于反應(yīng)均衡。反應(yīng)體積是1ml時(shí)，可用移液器吸取蛋白加入微球中，并吹打數(shù)次。如果反應(yīng)體積較大時(shí)，用燒杯，邊攪拌邊加入蛋白，

4、3.  儲(chǔ)存緩沖液和反應(yīng)緩沖液不同時(shí)，抗體有脫落的可能；4.  表面活性劑能使得抗體從膠乳中脫落，所以應(yīng)避免加入。微球共價(jià)結(jié)合抗體方法：一、一步法1.  準(zhǔn)備50mM pH 6.0的reaction buffer，醋酸或MES buffer更合適2.  用reaction buffer溶解抗體，使其濃度為1mg/mL。3.  用reaction buffer 懸浮微球，使其濃度為1% w/v4.  邊攪拌邊將一倍體積的抗體溶液加入到10倍體積的微球懸液中，室溫下持續(xù)攪拌20分

5、鐘5.  準(zhǔn)備濃度為10mg/ml（52umol/mL）的EDC溶液，用前準(zhǔn)備，現(xiàn)配現(xiàn)用。6.  將計(jì)算需求量的EDC溶液加入到上述微球懸液中。(Note 6).7.  室溫下，立即調(diào)節(jié)pH (Note 7).8.  移除未結(jié)合的蛋白，并將包被微球用storage buffer重懸。(Note 3 and 4)B. 兩步法為了避免EDC將相鄰微球之間的蛋白偶聯(lián)導(dǎo)致微球聚集或者蛋白之間交流，兩步法偶聯(lián)抗體更合適。兩步法中，在蛋白加入之前，多余的EDC被移除。兩步法中，蛋白也可以使用更高pH的buffer來(lái)溶解，從蛋白

6、的穩(wěn)定性方面和加速蛋白和活化微球之間的交聯(lián)速度方便考慮，是非常有利的。B1 簡(jiǎn)單一步法：1.  準(zhǔn)備50mM pH 6.0的活化 buffer，醋酸或MES buffer更合適；用活化 buffer 懸浮微球，使其濃度為1% w/v2.  每ml微球懸液加入20mg的EDC，室溫孵育20分鐘，然后再次加入20mg/mL的EDC，繼續(xù)室溫孵育20分鐘。(Note 7).3.  離心或超濾，用等體積的包被緩沖液清洗兩次微球，最后懸浮在包被緩沖液中。(Note 3).4.  用包被緩沖液溶解抗體到1mg/mL，包被緩沖液

7、pH79，濃度為50mM100mM。(Note 1)5.  將抗體快速加入的攪拌中的微球懸液中，持續(xù)攪拌，室溫孵育25小時(shí)。(Note 2).6.  每ml反應(yīng)溶液中加入2.5ul的乙醇胺，持續(xù)攪拌并室溫孵育10分鐘。(Note 9).7.  離心或超濾，用儲(chǔ)存緩沖液懸浮，重復(fù)兩次，移除未結(jié)合的抗體和乙醇胺。(Note 3 and 4)B2. NHS中間活化酯兩步法在此方法中，在EDAC存在下，NHS通過(guò)與微球上的羧基反應(yīng)形成中間活化酯?；罨ケ菶DC更穩(wěn)定，不易水解。1.  每ml反應(yīng)混合物加入以下成分：?

8、60; 加入DIW，定容最終體積為1ml；?  0.1ml 10X的MES buffer，ph6.06.5（10X的buffer通常用0.5M）；?  0.1ml 10%的微球(終濃度為1%)；?  0.23ml NHS水溶液（50mg/mL）; 11.5mg?  一定體積的19.2mg/ml(100mM)的EDAC水溶液；2.  室溫下攪拌反應(yīng)1530min；（Note7）3.  清洗：MES buffer或DIW清洗 兩次；（Note3）；4. 

9、60;用DIW沖懸浮微球到濃度為1%；5.  同時(shí)，用包被buffer溶解稀釋抗體。buffer一般為ph79，50mM100mM。最終的蛋白濃度1mg/mL;6.  清洗完微球后，立即加入一定體積的抗體溶液。（Note 2）。（注意：此處給出的例子，微球濃度和蛋白濃度和buffer分別為0.5%（w/v），0.5mg/mL，2550mM）;7.  室溫下攪拌孵育2hr；8.  每ml反應(yīng)液中加入2.5ml 乙醇胺，室溫?cái)嚢璺跤?030min；9.  清洗：storage buffer清洗兩次。

10、（Note 3/4）NOTES:1.  reaction buffer的組成根據(jù)蛋白種類(lèi)的不同而改變，常用buffer有醋酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、MES緩沖液。蛋白在等電點(diǎn)附近更易于吸附到微球上，因?yàn)樵诘入婞c(diǎn)附近，蛋白表面會(huì)有更多的疏水位點(diǎn)暴露出來(lái)。在這種情況下，抗體也更緊密，因此需要更多的抗體用于標(biāo)記到微球上。然而，最終 reaction buffer的選擇，需要考慮最終抗體微球復(fù)合物的生物活性，因此，幾個(gè)不同濃度的抗體和不同pH的反應(yīng)buffer應(yīng)該進(jìn)行優(yōu)化選擇。起始實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)buffer的離子強(qiáng)度應(yīng)該在2550mM。2.  蛋白溶液應(yīng)

11、該在快速的攪拌下，快速加入到微球懸液中。小體積的話，可以進(jìn)行斡旋混合。 當(dāng)大體積時(shí)，應(yīng)該在燒瓶或燒杯里攪拌劇烈些，蛋白溶液快速加入到漩渦中間。3.  移除未結(jié)合的化合物或蛋白，如果顆粒直徑大于0.2um，可以通過(guò)離心的方法，微球可以重新懸浮，然后攪拌，接著溫和的超聲分散。離心力不宜過(guò)大，這樣會(huì)導(dǎo)致微球不易分散。也可以用超濾或透析來(lái)純化。當(dāng)用超濾時(shí)，濾膜孔徑應(yīng)該足夠大，使得游離的蛋白能自由的通過(guò)濾膜。用于清洗微球的buffer應(yīng)該和storage buffer一樣。用于清洗的buffer的任何緩沖液成分及pH的改變，都會(huì)引起蛋白的脫落。4.  微球包被抗體

12、后，加入表面活性劑或者去污活性成分，可能會(huì)導(dǎo)致抗體脫落。如果是共價(jià)結(jié)合到微球上，共價(jià)結(jié)合的抗體就不會(huì)有脫落現(xiàn)象發(fā)生。封閉蛋白，像BSA，casein 或gelatin可以用來(lái)封阻任何空余的疏水性位點(diǎn)，防止微球發(fā)生非特異性凝集。但是表面活性劑可以將那些共價(jià)結(jié)合不牢固的抗體洗脫下來(lái)。5.  此試劑和水反應(yīng)，因此，溶解后應(yīng)立刻使用掉。6.  EDC的用量，根據(jù)微球表面羧基濃度來(lái)計(jì)算。根據(jù)計(jì)算所需量，每mol的羧基應(yīng)該再多加23mol的EDC。但是，根據(jù)功能性檢測(cè)結(jié)果，還需要進(jìn)一步的優(yōu)化。7.  此步驟，微球的凝集經(jīng)常能觀察到。因?yàn)榻酉聛?lái)的步

13、驟中，EDC會(huì)將相鄰兩個(gè)微球上的抗體連接起來(lái)從而引起微球凝集或者中和微球表面的羧基或者兩者情況都發(fā)生。調(diào)節(jié)pH到6.5或超過(guò)6.5，優(yōu)化共價(jià)反應(yīng)，對(duì)微球的分散有幫助。如果反應(yīng)結(jié)束后微球凝集現(xiàn)象仍然發(fā)生，用新鮮的buffer清洗除去多余的EDC和游離的蛋白，一般會(huì)使得凝集顆粒再分散。如果在最終的產(chǎn)品中凝集依然發(fā)生，嘗試稀釋微球，一開(kāi)始可以稀釋到原來(lái)的50%濃度。如果稀釋后凝集依然發(fā)生，可以嘗試在所有reaction buffer中加入Tween20或Tergitol NP9等非離子型表面活性劑。這些表面活性劑不會(huì)干擾顆粒的活性或共價(jià)結(jié)合，但是需要注意的是，要確保在這種去污劑存在下微球共價(jià)結(jié)合的抗

14、體的穩(wěn)定。9. 加入乙醇胺，可以和加入蛋白反應(yīng)后多余的羧基位基團(tuán)反應(yīng)。膠乳標(biāo)記過(guò)程中常見(jiàn)問(wèn)題：1）問(wèn)題：蛋白無(wú)法吸附到微球上。解決方法：加入更多的蛋白；去除微球中的表面活性劑，釋放其占據(jù)的蛋白結(jié)合位點(diǎn)；引入中間物，將微球與蛋白相連；改變緩沖液。2）問(wèn)題：標(biāo)記時(shí)加入了大量的蛋白，但是仍然無(wú)活性。解決方法：改變蛋白加入量，從而改變蛋白與微球結(jié)合的空間構(gòu)象；使用表位稀釋物，占據(jù)微球上的部分蛋白結(jié)合位點(diǎn)，防止蛋白靠的太近。3）問(wèn)題：清洗去除未吸附蛋白后，微球聚集。解決方法：增加蛋白標(biāo)記量或封閉劑的用量，防止有空余位點(diǎn)；4）問(wèn)題：標(biāo)記后開(kāi)始活性很好，儲(chǔ)存一段時(shí)間后，活性降低。解決方法：降低儲(chǔ)存溫度到28

15、度；降低儲(chǔ)存液中的封閉劑濃度，防止抗體被替換；確認(rèn)儲(chǔ)存液中無(wú)能與抗體競(jìng)爭(zhēng)的雜質(zhì)，防止長(zhǎng)時(shí)間取代抗體。5）PS微球與蛋白（抗體）交聯(lián)后，當(dāng)時(shí)沒(méi)發(fā)現(xiàn)有凝集，但隔夜后發(fā)現(xiàn)有凝集是偶聯(lián)效率低的原因。當(dāng)體系蛋白不足或是其它原因，使微球表面在交聯(lián)后還空出許多反應(yīng)基團(tuán)時(shí)，由于這些基團(tuán)又可以與相連微球上的蛋白反應(yīng)，結(jié)果是把球又拉在一起了，所以有聚集?？梢约右恍゜locker agents 解決,常見(jiàn)的是BSA，另外，也可提高微球的交聯(lián)率。但為什么是過(guò)一段時(shí)間后才出現(xiàn)凝集呢，這是因?yàn)槲⑶蚺悸?lián)上蛋白后，相互之間由于攜帶同種電荷的關(guān)系，比較穩(wěn)定（所以能以膠體樣存在），只有當(dāng)偶爾相互碰撞，遇上彼此的反應(yīng)基團(tuán)時(shí)才能結(jié)合

16、。6）抗體偶聯(lián)至羧基PS球，即時(shí)檢測(cè)效果很好，但置于37度 2天后，抗體活性似乎下降很大?？赡芄矁r(jià)結(jié)合未成功，如果是這樣，那么最主要的原因是EDAC質(zhì)量差或過(guò)期了。EDAC長(zhǎng)期放在空氣中會(huì)吸潮，水汽會(huì)降低EDAC活性。另一個(gè)可能原因是凝集。觀察膠乳是否有凝集產(chǎn)生。還有，交聯(lián)蛋白前有沒(méi)有清洗？我們提供的膠乳緩沖液中含有表面活性劑，可能干擾抗體的結(jié)合。如果未發(fā)生凝集，而且用前已經(jīng)清洗，那么我們建議換新的EDAC。7）EDC活化羧基乳膠微球后，加蛋白（抗體）即時(shí)有沉淀出現(xiàn)，是什么原因？很多因素可以導(dǎo)致蛋白加入后，微球聚集成塊。通常，蛋白偶聯(lián)前的聚集與緩沖液（電解質(zhì)）有關(guān)?？赡苁囚然鶝](méi)有活化好。EDC質(zhì)量出現(xiàn)問(wèn)題了，請(qǐng)換質(zhì)量好的再嘗試。如果沒(méi)有好的EDC，可以適當(dāng)調(diào)低活化緩沖液的pH值。對(duì)非修飾微球，那么可以從以下方面著手解決：絕大多的微球制備過(guò)程中，加有脂肪酸乳化劑。在聚合時(shí)，它起乳化作用，在聚合后，它起穩(wěn)定劑作用，使微球以膠體樣分布。在堿性pH下，微球表面的COOH，脂肪酸分子上的COOH以及聚苯乙烯多聚鏈末端的硫酸根（SO42-）使微球表面帶負(fù)電荷，親水性增強(qiáng)，從而能形成穩(wěn)定的膠體。由緩沖液導(dǎo)致的聚集可以通過(guò)加蛋白，陰離子乳化劑，非離子乳化劑（如Triton X-100和Tween-20）。下列方法供參考：a)