westernblot操作步驟

1、western blot操作步驟2012版2012-02-03 00:00   來源：丁香園   點擊次數(shù)： 4016 關鍵詞： western blot 操作步驟 分享到： 收藏夾 騰訊微博 新浪微博 開心網(wǎng) 文轉(zhuǎn)載于丁香園站友dlzhangyu的論壇大作，點此查看詳情，感謝dlzhangyu站友的分享。2011年鄙人做western的時候，發(fā)現(xiàn)目前的資料都很老，網(wǎng)上的資料也大多互相傳抄，說法各異，于是綜合了目前網(wǎng)上所能找到的資料和個人實際經(jīng)驗，編輯了這份western blot操作步驟2012版，內(nèi)容包括主要操作步驟和所需要注意的有用的細節(jié)，并附上參考文獻（原諒我無法像

2、Endnote那樣一一注明文獻出處，只能大概標注出引用的參考資料），希望對大家有幫助。鄙人按下文的步驟操作已經(jīng)做出來了穩(wěn)定可重復的、背景干凈的western條帶了，所以相信你也行。為了節(jié)省時間，鄙人總結了一下western blot Quick Guide和一天做出western的具體時間規(guī)劃，附在文末。初次發(fā)這么長的帖子，難免有錯，歡迎批判指正。背景：蛋白質(zhì)印跡的發(fā)明者是斯坦福大學George Stark。Neal Burnette于1981年所著的AnalyticalBiochemistry中首次被稱為Western Blot。最開始做印跡的是一個叫Southern的科學家，但印跡的對象是

3、DNA鏈，他把這種技術稱為Southern blot，后來出現(xiàn)了兩個過程相似，但是對象不同的印跡方法，一個針對RNA，一個對蛋白質(zhì)，人們分別把這兩種技術的稱為Northern和Western，與這兩個技術的發(fā)明人沒有關系了。一、蛋白質(zhì)的樣品制備：由于這一步方法各異，具體步驟請參考試劑盒的說明書即可。蛋白質(zhì)的樣品制備是Western Blotting的第一步，樣品制備是關鍵步驟，要求盡可能的獲得所有蛋白質(zhì)，應注意以下問題:> 在合適的鹽濃度下，應保持蛋白質(zhì)的最大溶解性和可重復性。> 選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價結合的蛋白質(zhì)復合物和共價鍵二硫鍵，使其形成一個各自多肽的溶

4、液。盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子。> 防止蛋白質(zhì)在樣品處理過程中的人為的修飾，制備過程應在低溫下進行，以避免細胞破碎釋放出的各種酶類的修飾（加入合適的蛋白酶抑制劑）。> 樣品建議分裝成合適的量（比如分裝出20ul檢測蛋白質(zhì)定量用），然后保存與-20°或-80中長期保存，但要注意不要反復凍融，因為會使蛋白的抗原特性發(fā)生改變。> 若蛋白提取過程存在問題或蛋白發(fā)生降解則很難進行好之后的實驗，也就很難做出好的結果了。除此之外 loading buffer的作用也不容忽視，切莫使用不新鮮的上樣緩沖液，同時在處理時也應注意將樣品與loading buffer混合均勻。二、

5、蛋白質(zhì)定量如果要定量的話，一般選擇BCA或者Bradford方法，BCA要求檢測波長為562nm，Bradford為595nm。具體方法見各試劑盒說明書。為避免假陽性結果，建議先把lysis buffer加入BCA工作液或考馬G250混合看是否產(chǎn)生顏色。測完蛋白含量后，計算含50100ug蛋白的溶液體積即為上樣量（一般8cm寬的迷你膠每個泳道最大能承載的蛋白質(zhì)量為150ug，所以如果從組織提取蛋白的話上樣量不宜過大）。網(wǎng)上有人喜歡等質(zhì)量上樣（即每個泳道的上樣體積不一但質(zhì)量一定），也有使用等體積上樣（即先把各個樣品稀釋到某一固定濃度，然后等體積等質(zhì)量上樣，計算上樣體積時需包含loading bu

6、ffer的體積）。按分子克隆的說法，還是使用等體積上樣比較好。上樣總體積一般不超過15ul，加樣孔的最大限度可加20ul樣品。上樣前要將樣品置于燒杯內(nèi)，將燒杯置于石棉網(wǎng)上用酒精燈加熱至沸騰，在沸水中煮35min使蛋白充分變性。也可以使用PCR儀95°加熱5min，效果佳，操作方便。之后樣品可以在4冰箱短時間保存，也可在-20°冰箱保存數(shù)月，但是反復凍融會使蛋白質(zhì)的抗原特性改變。三、SDSPAGE電泳1. 清洗玻璃板：蘸點洗潔精輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。若不繼續(xù)使用，需用無水乙醇擦拭后晾干再妥善收起來，玻璃板之間墊玻璃紙隔開。梳子應

7、用水洗干凈，臨用前用無水乙醇擦拭晾干。2. 灌膠與上樣 玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準備灌膠（操作前先往玻璃板間灌水，檢查是否漏）。 按配膠試劑盒說明書選擇合適的分離膠濃度配置，最后加入TEMED，之后搖勻即可灌膠。配制凝膠時要充分混勻，此外應保證試劑的新鮮，特別是過硫酸銨。灌膠時掌握好速度，避免氣泡產(chǎn)生（注意濃度越小的膠含水越多，凝固后膠體積縮小越多）。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快（灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時要很慢，否則膠會被沖變形）。未聚合的丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，

8、操作時應該戴手套防護。梳子插入濃縮膠時，應確保沒有氣泡。注意給積層膠留出足夠的空間（分子克隆推薦長度為插入的梳齒長再加1cm）。 當水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。再等幾分鐘覺得差不多的時候就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。聚合時間由AP以及TEMED決定，通常在30min左右，AP不新鮮會導致聚合變慢，氣溫較低時膠是會凝得慢一些，必要時可適當增加AP以及TEMED的量，但通常不會超過1h，若超過1h甚至更長仍未聚合，應檢查配制的操作有無錯誤。由于TEMED催化APS釋放相關化學基團，再由APS釋放的基團催化Acr/Bis聚合，所以如果APS不新鮮的話加再多的TEMED效果

9、也不佳，這就是為什么推薦APS每周新鮮配置的原因。 按說明書配積層膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時要使梳子保持水平。由于膠凝固時體積會收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固前最好在兩邊補膠至剛剛冒頂。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。 趁積層膠聚合的這段時間，取適當體積樣本混合1X SDS loading buffer（最好事前分裝好，每次從冰箱里取一管即可），95100°加熱5min，若有沉淀可用稍低溫度，比如455

10、5°加熱1h達到變性的目的。我一般習慣分裝20ul到PCR管里，先和loading buffer混合好，臨用前用PCR儀加熱95°C 5min，效果不錯。 膠做好后連同玻璃板一起安裝到電泳槽上，加入電泳緩沖液后開始準備上樣（我們使用的是大連競邁科技公司的MV-III型小型單垂直板電泳槽，電泳液至少要漫過內(nèi)測的小玻璃板，電泳槽下面不用倒太多電泳液）。加樣前可用5ml注射器或加樣器先沖洗一下加樣孔。用微量加樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個樣品時，進樣器需在外

11、槽電泳緩沖液中洗滌3次，以免交叉污染。目前我們做的mini膠上有10個上樣孔，一般在第一個孔加入marker（我用的是Fermentas預染marker），其余9個孔加入樣品，也可在頭尾孔內(nèi)加入marker，中間8個孔加樣品。加樣前樣品應先離心，尤其是長時間放置的樣品。在未加樣的孔中應加入等量的樣品緩沖液。上樣時，小心不要使樣品溢出而污染相臨加樣孔。也可使用10ul的槍頭就行，比用微量加樣器快很多，用槍頭時注意不要插得太深，容易把玻璃板撐開，樣品就落到膠和玻璃板之間的空隙了。3. 電泳電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液沖洗清除黏附在凝膠底部的氣和未聚合的丙烯酰胺，網(wǎng)上有資料建議低電壓短時間的預電泳，清除凝

12、膠內(nèi)的雜質(zhì)，疏通凝膠孔徑以保證電泳過程中電泳的暢通，但是在分子克隆上卻反對這種做法，理由是會破壞緩沖系統(tǒng)pH的不連續(xù)性。請各位按照實際經(jīng)驗來做即可。電泳時間和電壓說法各異。按照各實驗室的慣例或者電泳槽的使用說明來操作。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進行轉(zhuǎn)膜。為減少蛋白質(zhì)條帶的擴散，上樣后應盡快進行電泳，電泳結束后也應直接或者轉(zhuǎn)印。四、轉(zhuǎn)膜我們實驗室使用的是半干轉(zhuǎn)膜電泳槽。對于轉(zhuǎn)印90kd以下的蛋白，轉(zhuǎn)膜液都不用加SDS，如果是蛋白分子量大的話可以加入0.037%的SDS。1. 在電泳結束前20min開始準備轉(zhuǎn)膜所需的東西。轉(zhuǎn)一張膜需準備6張的濾紙（長一般為8.18.3cm，寬度根據(jù)裁的膠大小

13、實際測量，但膠一般會縮水，所以裁8cm就行）和1張PVDF膜。切濾紙和膜時一定要戴干凈手套，因為手上的蛋白會污染膜。PVDF膜使用前用無水甲醇中浸泡1min2min。目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質(zhì)結合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時多加甲醇也是這個目的。2. 將玻璃板撬開才可剝膠，撬的時候動作要輕，要在兩個邊上輕輕的反復撬。撬一會兒玻璃板便開始松動，直到撬去玻板（撬時一定要小心，玻板很脆弱，我用的是冰箱里附帶的塑料除霜鏟，效果出奇的好）。除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去，要避免把分離膠刮破。也可取10ml注射器吸滿轉(zhuǎn)印緩沖液，往玻璃板與凝膠之間注水，使液體的壓力將兩者

14、自然分開。取出凝膠后應注意分清上下，可以在右上角裁一個小角。之后有兩種方法供選擇，一是按照marker指示，把含有自己感興趣的蛋白的膠裁下來，二是把整張膠轉(zhuǎn)膜，前一種方法更加節(jié)約材料，但操作稍微麻煩了一點。在加有轉(zhuǎn)移液的培養(yǎng)皿里放入裁好的膠、浸過甲醇的PVDF膜和濾紙，平衡10min左右，也是為了除去濾紙和轉(zhuǎn)移膜中的氣泡以及膠上多余的SDS。3. 帶上手套，平放轉(zhuǎn)移槽的底座，依次在石墨電極上疊放3張浸泡過緩沖液的濾紙、PVDF膜（此時可在PVDF右上角減去一個角，以辨明轉(zhuǎn)膜后的蛋白面與非蛋白面）、剛剛完成電泳的凝膠和另外3張浸泡過緩沖液的濾紙。用槍頭或移液管在疊層的濾紙上滾動，除去氣泡。注意每

15、疊一層就要用玻璃棒或圓筒試管趕去氣泡，因為一個氣泡的厚度對于蛋白來說都是十萬八千里的。用干凈紗布將疊層上面和周圍的多余緩沖液吸干（這一步很重要，寧可太干也不能太濕，太干容易燒胡，太濕的話多余的緩沖液會導致電流短路，大大降低轉(zhuǎn)移效率，如果同時轉(zhuǎn)好幾條膠的時候更要小心，有一個膠短路就會影響整體的轉(zhuǎn)移效率）。最后將轉(zhuǎn)移槽的上蓋扣上，接通電源開始轉(zhuǎn)膜。由于設備昂貴，第一次操作應向熟手請教，否則短路可能燒壞設備！轉(zhuǎn)完后立即清洗設備，特別是金屬上蓋，轉(zhuǎn)膜液特別容易在金屬上蓋上形成結痂，影響設備的正常使用，我們實驗室今年做western的同志因為忽略這一點，轉(zhuǎn)膜儀燒壞了好幾次。4. 依據(jù)分子量大小電泳156

16、0min。如果初次轉(zhuǎn)膜，可以根據(jù)一般經(jīng)驗，即多少kD的蛋白就轉(zhuǎn)多少分鐘，再根據(jù)結果調(diào)整時間。之后斷開電源，取出轉(zhuǎn)移膜進行后繼實驗。5. 為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，最好使用預染。傳統(tǒng)方法是將膜用1×麗春紅染液染5min（于脫色搖床上搖）。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。實際上更常用且簡便的方法是先將膜晾干，然后浸入20%的甲醇，待完全浸濕后取出透光觀察即可看到蛋白條帶（此方法僅僅適合PVDF膜）。將膜晾干備用。使用預染marker話可以看見marker的顏色轉(zhuǎn)印到了膜上，但是憑借這個顏色來判斷是否轉(zhuǎn)印完全或轉(zhuǎn)印過頭是不可靠的。五、免疫雜交反應

17、1. 將膜移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉1h即可。如果是自己配置的封閉液，最好過濾一下以消除固體雜質(zhì)。實際經(jīng)驗表明與其封閉過夜，不如一抗孵育過夜，具體原因可以參考這個帖子：2. 將一抗用封閉液稀釋（一般用封閉液稀釋即可，如果背景不高用TBST稀釋也可以，當然熟練后還可以自由發(fā)揮，配制一些自己的復方稀釋液）至適當濃度（可以在1.5mlEP管中配置工作液，常用稀釋倍數(shù)為1:200，1:500，1:1000，具體需要預實驗進行摸索，用后可回收重復用23次，但回收重復利用的效果如何就要看抗體的質(zhì)量，分裝的抗體不推薦回收。稀釋后應在23天內(nèi)使用，4度保存，避免反復凍融。）；撕下適當大小

18、的一塊兒保鮮膜鋪于實驗臺面上，四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整；將抗體溶液加到保鮮膜上；從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動膜四角以趕出殘留氣泡（也可使用手術室的病理袋，質(zhì)量不錯，減去下面的折疊部分，用封口器（4080元一個）封上，不漏液即可）。37°孵育1h之后轉(zhuǎn)移到室溫下再孵育1h（或者4°孵育過夜），用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。也可以多洗幾次，比如4次，每次5min。3. 在培養(yǎng)皿內(nèi)加入二抗稀釋液（10ml足夠了，一般1:1000甚至1:10000用TBST稀釋），放在搖床上，室溫

19、下孵育12h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，進行化學發(fā)光反應。選擇好一個合適的條件不要輕易改變，另外相比一抗，二抗作用的時間應嚴格控制，實踐證明一抗時間長點可能沒什么關系，而二抗時間若過長過短都將會直接影響結果。二抗孵育之后還要注意好好洗滌，否則顯影是背景可能臟。六、化學發(fā)光（ECL），顯影，定影1. 現(xiàn)在工作臺上鋪一張保鮮膜，將PVDF膜放在保鮮膜上。將ECL的A和B兩種試劑在EP管內(nèi)等體積混合（注意吸完A試劑后吸B試劑前要患槍頭），然后均勻滴在PVDF膜的蛋白面，反應12min后，將PVDF膜上多余的ECL工作液吸干，之后轉(zhuǎn)移到在X片夾

20、中預先鋪好的保鮮膜上一側，把另一側翻過來蓋在其上。用透明膠把保鮮膜固定在片夾上。2. 在暗室中，將1×顯影液和定影液分別到入塑料盤中；在紅燈下取出X光片，用切紙刀剪裁適當大?。ū饶さ拈L和寬均需大1cm）；打開X-光片夾，把X光片放在膜上，一旦放上，便不能移動，關上X-光片夾，開始計時；根據(jù)信號的強弱適當調(diào)整曝光時間，一般為1min到2min，也可選擇不同時間多次壓片，以達最佳效果（也有人重疊壓好幾張片，固定曝光510分鐘，從這好幾張片中選出最合適的底片）；曝光完成后，打開X-光片夾，取出X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影時間一般為12min（2025

21、），溫度過低時（低于16）需適當延長顯影時間；顯影結束后，馬上把X-光片浸入定影液中，定影時間一般為510min，以膠片透明為止；用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干（注意：顯影和定影需移動膠片時，盡量拿膠片一角，手指甲不要劃傷膠片，否則會對結果產(chǎn)生影響）。X光片一般選用柯達原裝的生物實驗專用柯達X-OMATBT膠片 。顯影液和定影液最好每周配置一次，避光室溫保存，顯影和定影液是最便宜的試劑了，千萬不要因為它而影響了整個結果。七、凝膠圖象分析將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標帶的分子量和凈光密度值，比如bio-rad的Quantity One。如何使用請看這里。主要參考資料：1

22、、WB實戰(zhàn)指南+正確使用Quantity One定量 by jacqueslm2001 2、Abcam的western新手指南 3、土豆網(wǎng)的western blot視頻 上海交大出品 4、分子克隆實驗指南精編版 化學工業(yè)出版社5、抗體技術實驗指南科學技術出版社6、milipore的western blot的優(yōu)化方案 7、Western blot步步看(網(wǎng)絡流傳最廣的資料) 作者不詳 8、Bio-rad 蛋白印跡手冊 9、窮人的勞斯萊斯-我的五年western blot體會 by seagate 附：Western Blot Quick Guide（以及一天跑完Western的時間規(guī)劃）前期準備

23、：蛋白已經(jīng)定量，各樣本已經(jīng)稀釋到某固定濃度，已經(jīng)和SDS loading buffer混合，已經(jīng)分裝好，保存與-20°。頭天下午或晚上配膠，分離膠和濃縮膠一起配好，帶上梳子，放入潮濕的自封袋內(nèi)放入4°冰箱備用。8:00 從冰箱里取出蛋白樣品，用PCR儀95度加熱5min?；旌暇鶆虿㈦x心。8:30 取出昨晚配好的膠，組合，加電泳液。在電泳液里拔梳子能稍微容易一些。用10ul的槍加樣。9:00 開始電泳。恒流30mA一般1個小時足夠了。9:30 開始準備轉(zhuǎn)膜用的濾紙和PVDF膜，PVDF膜泡甲醇。一般8cm的寬是固定的，所以如果要裁膠的話可以先大概估計一下。10:10 電泳結束

24、（假設電泳用了70分鐘），起開玻璃板，裁出膠上所要的條帶，如果整塊膠轉(zhuǎn)就更方便了。把膠放在盛有轉(zhuǎn)膜緩沖液的培養(yǎng)皿里。11:00 轉(zhuǎn)膜開始（這里裁紙和鋪三明治還是比較費時間的，我一般要用30分鐘到50min，所以這里要抓緊時間）。12:00 轉(zhuǎn)膜結束（這里按60min的半干轉(zhuǎn)的時間來計算）。開始封閉1h。13:00 封閉結束，開始孵育一抗（在這里你可以選擇一抗孵育過夜，如果不過夜的那一天就能結束），如果不過夜的話我一般選擇37° 1h然后在室溫（23°左右）再1h。15:00 一抗孵育結束。TBST洗滌3*10min或者5*6min。15:30 開始孵育二抗。室溫1h足夠了。

25、16:30 二抗孵育結束。TBST洗滌3*10min或者5*6min，這里推薦采用5*6min。17:00 ECL發(fā)光，壓片10min，顯影1min，定影10min，那么在18:00之前你就能看到結果了，呵呵，如果結果不好還有后招，用stripping（一抗二抗洗脫液）洗滌，我用的是碧云天的堿性一抗二抗洗脫液，按照說明書來一般20min就行，然后洗滌幾次，重新封閉1h，然后一抗過夜，明日在繼續(xù)戰(zhàn)斗。這樣的話18:30之前也能結束戰(zhàn)斗了。 Western Blot(免疫印跡法)（圖）主要包括以下 4 個基本步驟：樣品制備；電泳分離；蛋白的膜轉(zhuǎn)移；免疫雜交與顯色蛋白檢測。溶液和試劑1.

26、1X 磷酸鹽緩沖液(PBS)2. ModifiedRIPAbuffer：Tris-HCl:50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA:1 mM ;PMSF: 1 mM;Aprotinin,leupeptin,pepstatin:1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM;NaF: 1 mM3. 1X SDS 樣品緩沖液：62.5 mMTris-HCl(pH 6.8 于 25° C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mMDTT, 0.01% w/v溴酚藍4

27、. 轉(zhuǎn)移緩沖液：25 mM Trisbase, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇 (pH 8.3)5. 10X Tris緩沖鹽 (TBS)：準備1L 10X TBS：24.2 g Trisbase, 80 g NaCl；用1N HCl調(diào)pH為 7.67. 甲醇8. TBS/T緩沖液：1X TBS, 0.1% Tween-209. 封閉緩沖液（TBS/T）：1X TBS,0.1% Tween-20加5% w/v脫脂奶粉或BSA10. 一抗的稀釋：1X TBS,0.1% Tween-20 加 5% BSA ( 多抗) 或 5%脫脂奶粉( 單抗)。Note： 一般來說，BSA被推薦用于多克隆抗體，脫

28、脂奶粉用于單克隆抗體，這樣可得到較高的信噪比。預染的蛋白質(zhì)Marker，可用于監(jiān)測轉(zhuǎn)膜的效率。樣品制備原始樣品可為細胞、組織、培養(yǎng)上清、免疫沉淀或親和純化的蛋白，以下為 定性檢測目的蛋白時細胞樣品的處理方法，其余的樣品制備方法參閱相關文獻。1培養(yǎng)細胞或藥物處理。2棄培養(yǎng)基，用1X PBS漂洗細胞2次，去盡殘留培養(yǎng)基。3加入1X SDS樣品緩沖液(6-well plate,100l /w或 75 cm2 plate,500- 1000l/瓶) ，刮落細胞，轉(zhuǎn)移到Ep管。注意：冰上操作。4超聲 1015秒剪切DNA以減低樣品粘性。5煮沸樣品5 minutes。6離心12000g，5 min，取上清

29、。7電泳分離：上樣15l20l 至 SDS-PAGE 膠 (10 cm x 10 cm)電泳。 如要定量檢測某蛋白的表達水平， 應用RIPA裂解液(1 ml per 107 cells/100 mm dish/150cm2  flask)裂解細胞， 收集裂解液至離心管中，在振蕩器上混勻415min，14000g離心15min（4），棄沉淀，用Bradford法或其它蛋白質(zhì)測定方法測定上清中蛋白濃度以調(diào)整上樣體積和上樣量，進行Western雜交時還需設置內(nèi)或外參照，通常用beta-actin。注意：一般上樣2030 g已足夠，如待檢蛋白為低豐度蛋白，可加大上樣量 至100g，但電泳條帶

30、易拖尾，可制備亞細胞組份或采用更敏感的檢測方法。電泳分離（參照SDS-PAGE電泳方法） 轉(zhuǎn)膜雜交膜的選擇是決定 Western blot成敗的重要環(huán)節(jié)。應根據(jù)雜交方案、被轉(zhuǎn) 移蛋白的特性以及分子大小等因素，選擇合適材質(zhì)、孔徑和規(guī)格的雜交膜。用于Western blot的膜主要有兩種：硝酸纖維素膜(NC) 和 PVDF 膜。NC 膜是蛋白印跡實驗的標準固相支持物，在低離子轉(zhuǎn)移緩沖液的環(huán)境下，大多數(shù)帶負電荷的蛋白質(zhì)會與膜發(fā)生疏水作用而高親和力的結合在一起， 但在非離子型的去污劑作用 下，結合的蛋白還可以被洗脫下來。根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，選擇不同孔 徑的 NC 膜。因為隨著膜孔徑的不斷減小，

31、膜對低分子量蛋白的結合就越牢固。 通常用 0.45 m 和 0.2m 兩種規(guī)格的 NC 膜。 大于20kD 的蛋白可用 0.45m 的膜， 小于 20kD的蛋白就要用 0.2  m 的膜了， 如用0.45 m 的膜就會發(fā)生“Blowthrough”的現(xiàn)象。PVDF 膜靈敏度、分辨率和蛋白親和力比常規(guī)的膜要高，非常適合于低 分子量蛋白的檢測。但 PVDF 膜在使用之前必需用純甲醇浸泡飽和 1-5 秒鐘。蛋白質(zhì)常用的轉(zhuǎn)移方法主要有兩種：槽式濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)移。前者操作容易， 轉(zhuǎn)移效率高；而后者適用于大膠的蛋白轉(zhuǎn)移，所用緩沖液少。以下為槽式濕轉(zhuǎn)的 操作步驟。1. 將膠浸于轉(zhuǎn)

32、移緩沖液中平衡 10min。 注意：如檢測小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易擴散出膠。2. 依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6 片， 放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10min。 如用P VDF 膜需用純甲醇浸泡飽和 3-5 秒鐘。3. 裝配轉(zhuǎn)移三明治： 海綿 3 層濾紙 膠 膜 3 層濾紙 海綿， 每層放好后， 用試管趕去氣泡。切記：膠放于負極面（黑色面）。4. 將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面對黑色面），加轉(zhuǎn)移緩沖液， 插上電極，100V，1h（電流約為 0.3A）。注意：應再次檢查三明治和電極是否裝配正確，電源是否接通。5. 轉(zhuǎn)膜結束后，切斷電源，取出雜交膜免疫雜交與顯色1用25 ml TBS

33、洗膜5min，室溫，搖動。2置膜于25 ml 封閉緩沖液中1h, 室溫，搖動。315mlTBS/T洗3次（5 min/T）。4加入合適稀釋度的一抗，室溫孵育1-2h或4°C過夜，緩慢搖動。515 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。6加入合適稀釋度的堿性磷酸酶（AP）或辣根過氧化酶（HRP）標記的二 抗，室溫孵育1h，緩慢搖動。715 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。815 ml TBS洗1次。9蛋白檢測( 顯色法或發(fā)光法，按相應試劑說明操作) 。注意事項：1操作中戴手套，不要用手觸膜。2PVDF膜在甲醇中浸泡時間不要超過5秒。3如檢測小于20kD的蛋白應用0.2m的

34、膜，并可省略轉(zhuǎn)移時的平衡步驟。4某些抗原和抗體可被Tween-20 洗脫，此時可用1.0% BSA代替Tween-20。5關于封閉劑的選擇：5%脫脂奶/TBSor PBS: 能和某些抗原相互作用，掩蓋抗體結合能力；0.33% BSA in PBS：低的內(nèi)源性交叉反應性。6如用0. 1% Tween20、0.02% NaN3 in PBSor TBS作封閉劑和抗體稀釋液，抗體檢測后可進行蛋白染色。7如要同時檢測大分子量和小分子蛋白，最好用梯度膠分離蛋白。Western Blot免疫印跡實驗操作規(guī)程Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知

35、表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測。一、原理與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平

36、的表達。二、試劑準備1. SDS-PAGE試劑:見電泳實驗。2. 勻漿緩沖液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.0ml；10%SDS 6.0ml；-巰基乙醇 0.2ml；ddH2O 2.8ml。3. 轉(zhuǎn)膜緩沖液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。4. 0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4  0.24g；加ddH2O至1000ml。5. 膜染色液：考馬斯亮蘭 0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml。包被液（5

37、%脫脂奶粉，現(xiàn)配）：脫脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中。6. 顯色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸鎳胺 0.1ml；H2O2 1.0l。三、操作步驟1. 蛋白質(zhì)樣品獲得：細菌誘導表達后，可通過電泳上樣緩沖液直接裂解細胞，真核細胞加勻漿緩沖液，機械或超聲波室溫勻漿0.5-1min。然后4，13,000g離心15min。取上清液作為樣品。2. 電泳：制備電泳凝膠，進行SDS-PAGE。3. 轉(zhuǎn)移：（半干式轉(zhuǎn)移） 電泳結束后將膠條割至合適大小，用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡，5min×3次。 膜處理：預先裁好與膠條同樣大小的濾紙和NC膜，浸入轉(zhuǎn)膜

38、緩沖液中10min。 轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按陽極碳板、24層濾紙、NC膜、凝膠、24層濾紙、陰極碳板的順序放好，濾紙、凝膠、NC膜精確對齊，每一步去除氣泡，上壓500g重物，將碳板上多余的液體吸干。接通電源,恒流1mA/cm2 ，轉(zhuǎn)移1.5hr。轉(zhuǎn)移結束后，斷開電源將膜取出,割取待測膜條做免疫印跡。將有蛋白標準的條帶染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脫色，至背景清晰，然后用雙蒸水洗，風干夾于兩層濾紙中保存，留與顯色結果作對比。四、免疫反應：1. 用0.01M PBS洗膜，5min ×3次。2. 加入包被液，平穩(wěn)搖動，室溫2hr。3. 棄包被液，用0.01

39、M PBS洗膜，5min×3次。4. 加入一抗（按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋，液體必須覆蓋膜的全部），4 放置12hr以上。陰性對照，以1%BSA取代一抗，其余步驟與實驗組相同。5. 棄一抗和1%BSA，用0.01M PBS分別洗膜，5min×4次。6. 加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（按合適稀釋比例用0.01M  PBS稀釋），平穩(wěn)搖動，室溫2hr。7. 棄二抗，用0.01M PBS洗膜，5min×4次。8. 加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時放入雙蒸水中終止反應。四、注意事項1、一抗、二抗的稀釋度、作用時間和溫度對不同的蛋白要經(jīng)過預實驗確定最佳條件。2、顯色液必須新鮮配置使用，最后加入H2O2。3、DAB有致癌的潛在可能，操作時要小心仔細。檢測任何目的靶蛋白都有不止一種抗體可供選擇，在同一個抗體公司，可能會有好幾種，甚至好幾十種；在不同的抗體公司，那就更多了。那怎樣在琳瑯滿目的抗體中，選擇自己實驗需要的抗體呢？主要考慮如下幾種因素：分析自己實驗應用的實驗方法是哪種？分析自己實驗中標本的種屬是哪種動物或人的？分析樣本中的蛋白質(zhì)的結構性質(zhì)，分析抗體的標記和檢測，分析抗體的宿主來源種屬