ALK基因突變與對應(yīng)的靶向藥物

1、間變性淋巴瘤激酶（ALK）突變的形式有過量表達、與其他基因形成融合基因，發(fā)生點突變等等。ALK基因融合突變是非小細胞肺癌（NSCLC）常見的一種驅(qū)動基因，中國非小細胞肺腺癌中ALK融合突變陽性的比例為5.3%,在非小細胞肺腺癌、年輕患者（小于60歲）以及不吸煙的人群中發(fā)生率較高，ALK陽性的非小細胞肺癌被認為是一種分子亞型，相對應(yīng)的靶向藥物與EGFR分子亞型完全不同。ALK融合基因突變主要在肺腺癌里常見，一般肺鱗癌患者ALK融合基因突變概率很低，有報道說1400個肺鱗癌患者里ALK融合基因的發(fā)生率為1.3%。考慮到ALK總體突變頻率僅有5%,所以對于鱗癌患者也是可以做一下ALK檢測的。由于非小

2、細胞肺癌里的驅(qū)動基因突變一般是互相排斥的，或者說一山不容二虎，癌細胞也沒有必要搞兩個驅(qū)動突變。有研究說亞裔的EGFR、KRAS野生型的腺癌患者，ALK陽性比例高達30%-42%,因此如果發(fā)現(xiàn)EGFR和KRAS是野生型，是更有必要測下ALK基因的。一、ALK融合突變的檢測1VI£ML4V2EML4EMLfl74EML4)V5n/bIEML4V6|EML4V7EML4V411EML4"V5'11TFGKIF6BIki.nI圖1:非小細胞肺癌中ALK的重排形式據(jù)報道，目前已發(fā)現(xiàn)21種EML4-ALK的融合形式，另外ALK還可能與TFG、KIF5B、KLC1、PTPN3、S

3、TRN等基因發(fā)生融合，因此ALK融合突變的診斷是存在一定難度的。下表是關(guān)于ALK融合突變的診斷方法，及其相應(yīng)的特點。檢演I方法免疫組化IHC）VentanaIHC槍測匚原理和優(yōu)缺點原理：通過抗原和抗體的結(jié)合反應(yīng)，配合信號領(lǐng)聯(lián)放大來檢測.羅氏公司的VentanaIHC試劑盒可以達到與R5H檢測結(jié)果的%100%的一致率.判讀標準是腫痛細胞胞漿出現(xiàn)旗狀棕黃色強染色顆粒.胞膜著色則為陰性.歐盥和中國都已經(jīng)批準VentanaIHC用于檢測ALK重排w缺點：由于腫瘤異質(zhì)性，靶蛋白的表達強度不均一.由于存在番白或RNA降解的可能，F(xiàn)FPE切片存儲大于3個月的不建議熒光原位雜交（FISH）反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-

4、FCR）高通量測序票理二分離探針的FISH方法,設(shè)計紅與綠兩個探針，分別標記ALK基因的兩端,一旦ALK基因發(fā)生斷裂重耳域倒轉(zhuǎn)，3C綠信號便出現(xiàn)分離r而沒有發(fā)生斷裂的則呈現(xiàn)為黃巨黃光信號.判讀標準為單個視野中計數(shù)5。個腫瘤細胞，下5燃的細胞出現(xiàn)分離信號則判讀為陽性，如1。細胞出現(xiàn)分離信號則判讀為陰性.如S4小三六二、二W建言.二三次三亡SC"中莓朝三看計數(shù)100個細胞，看是否有15%的細胞出現(xiàn)分禽信號（僅屬用于雅培的分離換卦試粕盤）缺點：無法判斷ALK的融合型，必須主經(jīng)勉豐富的病理科醫(yī)師來完成，15%的位界值存在一定爭議，由于腫椅并立性、取樣偏差等問題，存在俘國性的可能，即漏檢ALK

5、突變13性患者.原理：通過篆先設(shè)計好的引物對樣本的RNA遂行逆轉(zhuǎn)錄來檢測骷合突變,簡便可行，并可以確定ALK的融合型口缺點+需要高質(zhì)量的RNA樣本，臨床大部分是石蠟樣本，RNA降解嚴重,患哺檢出率，導(dǎo)致假陰性的結(jié)果，大于2年的標本不建議使用RT-PCR秒測I,推茬芽鮮腫瘤細織樣五.道過PCR引物只能檢測己知的融合基因型，無法囊括所有的融合型.后角己斐任實使用二弋弧序受犬槍汜基因干墻、基因重排是可行的,而且高通曼/中有勁于發(fā)琰AUC新的處合突變序而且佞需要少量譯本即可檢測多科基因的突變情況.獲點：價格較高，判讀標準及虧裝驗證等亟待解在.表1:ALK基因檢測的方法需要注意，臨床常用的三種方法是FI

6、SH、VentanaIHC及RT-PCR,三種方法FISH的靈敏度最低。因此，如果是胸腔積液、細針穿刺取到的細胞學(xué)樣本做成的蠟塊，不建議使用FISH,避免假陰性。另外通過抽血檢測循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）,循環(huán)腫瘤細胞（CTC）也正在發(fā)展起來?？傊诿鎸LK檢測結(jié)果模棱兩可的時候，一定要換一個檢測方法去驗證，也沒有哪一種方法靈敏度和特異性都是100%。、ALK的靶向藥物ALK融合突變陽性的患者使用克陛替尼可以獲益，克陛替尼具有ALK、c-MET、ROS1三個靶點?？吮萏婺嶂委烝LK陽性的非小細胞肺癌客觀緩解率達60%,無進展生存期為8-10個月，顯著改善并延長的總生存期。需要注意的是，克陛

7、替尼的贈藥政策與其他靶向藥物不同，第一年買四個月贈八個月，第二年仍需要買四個月，才能終身獲贈，合計下來得幾十萬，價格相對較高，所以使用之前一定明確是ALK突變才行。«>AJns4u口JgwoeksaftertroatmontinitiationDoGQtexehn=9Crizotlnib;n=8Pemetrexed;n=B圖2:相比多西他賽、陪美曲塞，ALK陽性的肺癌患者使用克陛替尼獲益明顯。不管如何，靶向藥物都有一個短板就是耐藥，使用克陛替尼的患者往往在1-2年內(nèi)出現(xiàn)對克陛替尼的耐藥，以中樞神經(jīng)系統(tǒng)的復(fù)發(fā)進展較為常見。耐藥的原理應(yīng)對第略ALK繼發(fā)性耐藥突變的占ALK陽性HSC

8、LC施藥的37%,可分為ALK激酷區(qū)突變1龍外）和ALK后臺基因拷貝數(shù)擴增（9%）.敷酹區(qū)突變包括！L1196M,L1152R.G1202R.G1269A.USlTins.S120&Y.C1156Y、Fil74c和D12O3N,L1198P,其中LH96M頻率稍微高一些,也被稱為守門員突變.ALK占優(yōu)勢耐藥，ALK信號通路往往被保留，可以使用后續(xù)更有效的二代ALK、或者三代ALK靶向抑制劑來控制.如色瑞替尼、艾樂替尼等等存在L1198F的患者可能重新用回克哇替尼.朝基因轉(zhuǎn)換腫瘤的異屬性腫瘤通過另外一些機制來激活其他信號通路，取代對ALK及下游信號的依賴.如EGFR突變或袋酸化、KRAS

9、突變和C-KIT擴增等n不同時間和不同空間腫瘤細胞存在不同的驅(qū)動基因.三于錄樣偏差的問題，是的基于單次基因檢測的結(jié)果無,法了解腫虐基因突變的全貌根據(jù)旁路激活的基因倩況,考慮使用聯(lián)合靶向藥物治疔。多次撿測丁使月新一弋基因檢測技術(shù)加大測序深度，盡量全面地了解腫搐基因突變信息.表2:ALK耐藥的原因和應(yīng)對策略克陛替尼耐藥后，后續(xù)還有二代，三代的ALK抑制劑，最近的發(fā)現(xiàn)三代ALK抑制劑勞拉替尼（3922）耐藥后，患者如果是存在L1198F導(dǎo)致的耐藥，可以可以重新用回克陛替尼。幾種二代、三代ALK靶向藥物的簡介如下；1、艾樂替尼（Alectinib，代號CH5424802）,效率比克陛替尼強10倍，可對

10、抗大多數(shù)的ALK激酶區(qū)突變，且對腦病灶控制較好。日本的一項臨床研究使用的計量為每次300mg、每日兩次，46名患者的43名獲得客觀緩解（客觀緩解率達93.5%）,日本已經(jīng)批準了該藥使用，美國FDA也已經(jīng)批準該藥用于克陛替尼治療后耐藥的患者。2016年ASCO會議上報道了一項研究，艾樂替尼一線治療ALK陽性非小細胞肺癌中的無進展（PFS）顯著優(yōu)于克陛替尼?？吮萏婺岬闹形籔FS為10.2個月，而艾樂替尼的中位PFS要大于20.3個月。相比克陛替尼，艾樂替尼使得疾病惡化或死亡風險顯著降低66%。2、色瑞替尼（Ceritinib,LDK378）,對C1156Y具有良好的活性，該藥的最大耐受計量為每天7

11、50mg,亞裔人的耐受計量可能到不了那么高，又說600mg的。79例克陛替尼耐藥的ALK陽性非小細胞肺癌使用該藥后，ORR為57%。一項涵蓋114名患者的臨床表明色瑞替尼的中位PFS為8.6個月。最常見的副作用是惡心、腹瀉、嘔吐和乏力。有患者反映色瑞替尼的副作用非常大，很少有人耐受，但是如果撐過去了則可能獲益期較長。3、Brigatinib(AP26113),一種新型的ALK和EGFR雙重抑制劑，可強效抑制ALK的L1196M突變和EGFR的T790M突變。2016年ASCO會議上公布的一項研究結(jié)果，即將患者1:1隨機分為兩組，A組患者每天口服Brigatinib藥物90mg,B組患者前7天每

12、天口服Brigatinib藥物90mg,后面加量到180mg,兩組人群的ORR分別為46%/54%,A組有一例證實的完全緩解，B組有五例證實的完全緩解，中位PFS分別為8.8個月/11.1個月。證明了該藥良好獲益。4、勞拉替尼(Lorlatinib,PF06463922),該藥應(yīng)該算是第三代ALK抑制劑，可抑制克陛替尼耐藥的9種突變，具有較強的血腦屏障透過能力，入腦效果較強，特別適合對其他ALK耐藥的晚期NSCLC患者。2016年6月5日，輝瑞在ASCO會議上公布了該藥的I/II期臨床研究數(shù)據(jù)，入組的54例患者有41例為ALK陽性，12例為ROS陽性，其中39例有腦轉(zhuǎn)移。該臨床試驗最終確定的給

13、藥方案為每日1次100mg，患者的總應(yīng)答率為46%,3例實現(xiàn)完全應(yīng)答，16例實現(xiàn)部分應(yīng)答，中位PFS為11.4個月，另外還顯示出縮小轉(zhuǎn)移性的腦部腫瘤體積的效果。另外還有幾個藥物如X-396,ASP3026等，其相應(yīng)的靶點和相關(guān)數(shù)據(jù)見下圖，如有興趣的可以追溯相關(guān)參考文獻進行延伸閱讀?！癮ecMl-gBmAFNWxhALK>nhibiEor.Df呻largedMhtrarrmc曰婀mlm艱in馴AcirYiqr通ainstoiIwLickQfacirvrtyIhanjAlKL119MCliBtr士nwlmib*陵usinmHaimlre&itiarH*-ntsiMMC鼾mutadns

14、mutatnnmulart3muLHiOflmuUttontCfrilirifhiQr-RUhiR.YghdMoC12A9A.lir'lT.GI2Q2R51鶴L11通F11ITLV11WLFl17死AiAntimbLTKGAKTgNoGl?4W.512Q6r.G120?RL11S2R.FI17AL哂甌HGiT-hm.grigMin港ROGI.EGFRft1W*YmG12£1劉行一HSlTnis.FH?nnir.di2osnEtflOK.Fl21ECNATrkA,TrtB.TrkCpfSOSlY«MA冊NAPF&il加之口¥«NAY

15、1;G1264ANATSR-0J1IrXA.Trk0PTrtftY»sNANANAASP3024.RCSLACKVetNAMAFintLNAMETVts剛附出CEP-37UQFAXNA.KAMAMANAW_Kb同hjsrFiphOm-j«Bii；心（tnitavMlaUA.圖3:ALK新一代抑制劑的特點，最后兩列為可以克服的克陛替尼耐藥位點，以及無能為力的位點。三、HSP90抑制劑與ALK耐藥聯(lián)合熱休克蛋白(HSP90)是一類稱為“分子伴侶”的蛋白質(zhì)，可幫助新合成的蛋白質(zhì)形成發(fā)揮他們特定生物學(xué)功能的正確形狀。體外細胞系研究發(fā)現(xiàn)HSP90抑制劑Ganetespib對ALK陽性

16、的細胞系有活性，且不管是否經(jīng)過克陛替尼處理都是如此（見下圖）。我們可以看到突變的EML4-ALK和HSP90是需要相互結(jié)合白勺。目前有關(guān)HSP90抑制劑Ganetespib的臨床試驗正在進行中。另一種HSP90抑制劑是AUY922,目前正在進行ALK陽性的NSCLC的II期臨床試驗，每周計量70mg/平米。疾病控制率為59%（未經(jīng)克陛替尼治療的控制率為100%,克陛替尼耐藥組的為36%）。TgLMU-irllMEpAKTmTORAuOfJiAUndjeOdinUI,Ejndmstjcrt1JTK癡mWt1口出覆際hrrteins，舌qEGFRIigj-netjDKA-flcsEGFW|w-AR

17、EGEM.L4HSP90ERKL?Ewr.-Hmui圖4:ALK陽性NSCLC的靶向治療機制四、EGFR和ALK雙突變患者普遍認為，ALK和EGFR基因是互斥的，因為腫瘤其實沒有必要制造兩個驅(qū)動基因。但是對于后期經(jīng)過多種治療后，反復(fù)耐藥的患者。EGFR和ALK共存的概率也不容忽視。對于這一部分患者，聯(lián)合使用EGFR和ALK的抑制劑較好，比單獨使用一種起到更好的控制作用，但是聯(lián)合治療副作用會較大，也需要看患者的耐受情況。目前關(guān)于兩類靶向藥物聯(lián)用效果、副作用等還缺乏數(shù)據(jù)。當然這部分患者可以考慮下Brigatinib(AP26113),該藥是ALK和EGFR雙靶點的抑制劑，可以考慮參加入組試驗等。但

18、問題是該藥可以抑制EGFR和ALK守門員突變(T790M,L1196M),如最開始就使用Brigatinib,這可能是把最后一張牌給打了。筆者曾見過一個原發(fā)性雙突變的患者，同時具有EGFR和ALK陽性，該患者的治療情況也將及時追蹤，后續(xù)再和大家呈報。五、什么時候停藥即便是出現(xiàn)局部進展，也不是立刻停止克哇替尼等靶向藥物的理由，因為可能還有很多癌細胞被藥物所抑制。立即停止靶向藥物，會導(dǎo)致腫瘤的爆發(fā)性進展。一項關(guān)于使用克吵替尼抑制ALK陽性非小細胞肺癌的研究發(fā)現(xiàn)，克哇替尼治療進展后，繼續(xù)使用克哇替尼相比停止克哇替尼的患者獲益更好。6個月總生存率為76.3%vs31.2%,1年總生存率為64.7%vs

19、32.9%,OS為16.4個月vs3.9個月。也有部分患者使用克睫替尼后，腫瘤病灶快速消失掉了，于是患者把藥給停止了，后來導(dǎo)致報復(fù)性的復(fù)發(fā)，有些患者再用克哇替尼也控制不了，即是一種脫靶效應(yīng)，雖然這其中的機理不知道，但是確實是存在的。這些現(xiàn)象是某些患者的血淚教訓(xùn)，雖然沒有臨床數(shù)據(jù)，但值得警惕。因為CT看不到腫瘤了，不代表腫瘤細胞完全被殺滅干凈了。停藥是一個非常謹慎的事情，望廣大患者和家屬慎之再慎。六、完美的閉環(huán)?勞拉替尼(Lorlatinib,PF06463922)被作為ALK靶點的最后一張王牌，因為克哇替尼耐藥的所有位點該藥似乎都能克服。直到出現(xiàn)了L1198F。新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志報道了一名患者治療經(jīng)過(見下圖)。該患者首先使用克哇替尼，耐藥后檢測發(fā)現(xiàn)了C1156Y，但是這個患者對二代ALK抑制劑沒有應(yīng)答，不得已使用勞拉替尼，但是后面新出現(xiàn)的L1198F導(dǎo)致對勞拉替尼耐藥，看似山窮水盡，卻不曾想L1198F突變導(dǎo)致了與克吵替尼結(jié)合更好，逆轉(zhuǎn)了C1156Y的作用，患者對克哇替尼重新復(fù)敏。aim，pShllh.p席ini匚IgRHEJ帆“的l?T.pUCN，圖5:L1198F導(dǎo)致的勞拉替尼耐藥對克陛替尼重新復(fù)敏這是一個非常有意思的發(fā)現(xiàn)，即勞拉替尼這個藥物也不是最后的一張牌，這個藥物耐藥了，也許之前被放棄的藥物仍可以有效。所以也有說法ALK是一種鉆石突變