基因診斷在遺傳病檢測中應用

1、基因診斷在遺傳病監(jiān)測中的應用目前發(fā)現(xiàn)人類遺傳性疾病有3000多種,如果僅依靠以往的染色體分析技術(shù)或?qū)虍a(chǎn)物與代謝物的測定,我們只能對其中為數(shù)極少的一局部疾病在發(fā)病前或產(chǎn)前進行診斷.由于許多基因的表達有時相性和組織特異性如有些基因在胎兒早期并不表達、苯丙氨酸羥化酶只在肝組織中表達.用常規(guī)的方法采集的胎兒標本或其他人體材料,常常不能測出這些基因的產(chǎn)物或代謝產(chǎn)物.然而,作為構(gòu)成機體根本單位的細胞,無論其來自何種器官或組織,它們的基因組成卻是完全一致的；雖然在某些特異化的組織細胞中某些基因并不表達,但那些基因的突變卻存在于一切細胞之中.如果采用基因分析的方法進行監(jiān)測,在個體發(fā)育的任何階段,以任何一種

2、有核細胞為檢材,基因的缺陷都能被監(jiān)測出來.這就是近十幾年來飛速開展的重組DNA技術(shù)給遺傳病的早期病癥前和出生前診斷帶來的福音.重組DNA技術(shù)不僅極大地豐富了我們對人類遺傳病分子病理學的知識,而且同時也提供了從DNA/K平對遺傳病進行基因診斷的手段.自從1978年發(fā)現(xiàn)第一個限制酶切位點多態(tài)性并應用于遺傳病鐮形細胞貧血的基因診斷以后,能夠進行基因診斷的病種不斷增加,方法和途徑越來越多.一、基因突變的類型造成基因突變的原因很多,有自發(fā)的也有外界理化因素的影響.從DNA列改變的角度來看,不外乎單核昔酸的取代和DNA片段的插入或缺失兩大類型.所產(chǎn)生的后果取決于突變發(fā)生的位置和性質(zhì),只要影響了基因表達過程

3、中的任何一個環(huán)節(jié),都會導致遺傳性疾病.歸納起來如表1所示表1基因突變及效應一覽表DNA列的改變突變發(fā)生的部位mRNAK平的表現(xiàn)基因產(chǎn)物的改變舉例1 .大片段缺失或插入整個基因缺如缺如a地中海盆血基因片段異常功能缺陷DMDBMD2 .少數(shù)核昔酸的缺失或插入外顯子與內(nèi)含子接界拼接異常缺如3的整數(shù)倍外顯子縮短或延長異常氨基酸缺失或插入HbLeiden非3的整數(shù)倍外顯子縮短或延長異常移碼突變0地中海盆血3 .單核昔酸取代啟動子減少減少0地中海盆血剪接信號剪接異常缺如0地中海盆血PolyA信號不穩(wěn)定減少0地中海盆血密碼子中性突變正常密碼子錯義突變氨基酸取代異常血紅蛋白密碼子或內(nèi)含子剪接異常缺如或移碼突變

4、0地中海盆血0地中海盆血HbCanstantspring0地中海盆血密碼子無義突變肽鏈提前終止終止密碼肽鏈延長,量減少起始密碼0地中海盆血缺如二、遺傳病基因診斷的途徑在了解了基因突變的各種類型之后,對應用何種方法來診斷它們便很容易理解了.例如某種遺傳病是由于基因缺失造成的,可通過監(jiān)測受檢者是否缺失該基因來直接判斷其基因型.如果某遺傳病是核昔酸取代造成的點突變,便可以通過監(jiān)測該突變的方法ASOf針或酶切位點監(jiān)測來進行診斷.如果致病突變或病因還不清楚,但有相關(guān)的基因探針或其與某位點的RFLP緊密連鎖,便可進行家系分析,通過該位點狀態(tài)的連鎖分析進行監(jiān)測.下面根據(jù)不同的情況,舉例說明基因診斷中常用的方

5、法.1 .直接監(jiān)測1應用基因探針或PCR進行缺失型基因監(jiān)測局部a地中海貧血和三分之二以上的杜氏及貝氏進行性肌營養(yǎng)不良DM吸BMD是整個基因或基因片段的缺失造成的.應用基因探針基因組DNA或cDNA探針進行Southern印跡雜交,如果某些雜交片段消失或片段長度改變不是由于限制酶識別位點的改變造成的RFLR,即可判定受檢者有基因缺失.應用近年來開展起來的PCR技術(shù),也可進行缺失基因的監(jiān)測.根據(jù)缺失發(fā)生區(qū)域的DNA序列,合成一對引物進行基因擴增反響體系中必須包含有另一無關(guān)DNA片段的擴增引物,作為反響是否成功的內(nèi)對照,通過凝膠電泳檢查,如果沒有擴增片段,便說明該基因或該DNA片段缺失,對a地中海盆

6、血中的HbBart水腫胎兒的產(chǎn)前診斷和DMD/BMDJ產(chǎn)前基因診斷都是應用此法進行.2造成特異限制酶切位點改變的突變基因的監(jiān)測有時,某些“點突變一般為單個核昔酸的取代或少數(shù)幾個核昔酸的缺失或插入正好影響了某種限制酶的識別位點喪失或增加,對這些與基因突變相關(guān)的酶切位點的改變,可用來進行突變基因的直接監(jiān)測.例如0珠蛋白基因密碼子6處有一MstU的識另J位點CGTGAGG,而在HbS病人的0珠蛋白基因,因其密碼子6由GAG谷氨酸突變?yōu)镚TG繳氨酸,破壞了MstU的識別序列.使得正常的兩個雜交片段1.15kb,0.2kb消失,而出現(xiàn)一個異常的1.35kb1.15+0.2=1.35片段.許多實驗室應用0

7、-S基因的這個特異標志,直接用MstU酶解0珠蛋白基因相應區(qū)域的PCR產(chǎn)物進行HbS病的產(chǎn)前基因診斷.3突變位點特異性監(jiān)測一一ASOf針斑點雜交絕大多數(shù)“點突變不改變酶的識別位點,但經(jīng)DNA序列分析明確基因的突變的細節(jié)之后,可人工合成針對突變位點的特異寡核昔酸allelespecificoligonucleotide,ASO探針,進行突變基因的直接監(jiān)測.ASC探針的長度一般為19個堿基,分別與被測定的突變所在區(qū)域的正常和異常DNAf列互補.在一定的雜交和洗脫條件下,只要有一個堿基不匹配,就不能形成穩(wěn)定的雜交鏈,正常探針只能與正常基因序列雜交而不能與突變基因的序列雜交,反之亦然.1983年Con

8、ner等首先應用ASO探針進行鐮形細胞貧血的基因監(jiān)測,現(xiàn)在已廣泛應用于0地中海貧血及其他遺傳性疾病的基因診斷.PC做術(shù)的創(chuàng)造使ASOf針的使用更加快速簡便.用PCR產(chǎn)物進行斑點雜交,不僅降低了同源序列的背景干擾,而且降低了對探針放射強度的要求.可以用非放射性物質(zhì)進行探針標記,操作平安,并且不受同位素半衰期的限制.目前對0地中海貧血、經(jīng)典型PKU?基因的診斷,都是應用此途徑.2.間接分析監(jiān)測致病基因一一RFLPs連鎖分析進行限制酶切片段長度多態(tài)性RFLP連鎖分析,目前還是施行基因診斷的主要手段.對于遺傳性疾病,目前了解其病因的只是其中的一小局部.即使對那些已經(jīng)知道了結(jié)構(gòu)基因的遺傳病,由于其致病突

9、變的細節(jié)即核昔酸序列的改變一時還不了解,還不能合成相應的寡核昔酸探針進行PCR/AS愧測.更不用說那些目前連其遺傳缺陷的生化機理尚不明確的遺傳性疾病了.對于這一類基因缺陷的監(jiān)測,只能通過間接的途徑,即應用RFLP連鎖分析進行基因診斷.一般說來RFLP分析所監(jiān)測到的DNA多態(tài)性通常是中性突變,與基因的致病突變之間不存在連鎖不平衡性,因此一個多態(tài)位點存在與否并不說明基因是否異常.只有在特定的家系中才具有一一對應的關(guān)系.多態(tài)性位點在基因連鎖分析中的應用價值,除了它與致病突變之間連鎖的緊密程度以外,還與它的雜合頻率有關(guān).連鎖越緊密所得結(jié)果越可靠；雜合頻率越高應用價值越大.我們用多態(tài)性信息量polymo

10、rphisminformationcontents,PIC來衡量,PIC是指某一家系可以利用RFLP作為遺傳標志進行基因連鎖分析的概率；就整個群體而言,它是指在群體中利用這些RFLP進行基因診斷的診斷率.有時單單分析一個多態(tài)性位點,還不能將某一家系中的致病基因所在染色體與正常染色體區(qū)分開來,必須分析多個位點的狀態(tài),綜合起來才能獲足夠的信息.我們將一條染色體上兩個或兩個以上與致病基因密切連鎖的多態(tài)性位點狀態(tài)的組合叫作染色體單倍體型haplotype.無論是何種遺傳性疾病,只要有與之密切連鎖的RFLP位點基因本身或鄰近的DNA序列,便可應用核心家系成員先證者及父母的DNA進彳fRFLP分析,確立致

11、病基因所在染色體與RFLP位點狀態(tài)的連鎖關(guān)系.但只有在那些連鎖關(guān)系明確、正常與異常染色體能夠區(qū)別的家系中,才能對家系成員進行病癥前或產(chǎn)前基因診斷.1應用基因探針進行RFLPs分析應用基因探針基因組DNA或cDNA探針所監(jiān)測到的RFLP位點在基因的內(nèi)部或基因附近,它與基因突變位點之間連鎖非常緊密,通常情況下很少發(fā)生重組除非基因本身非常龐大,如抗肌萎縮蛋白基因,2300kb,因此非?？煽?DN峙列已經(jīng)明確的基因內(nèi)或旁側(cè)序列中的酶切位點的多態(tài)性狀況還可以用PCRTT法來監(jiān)測.PCR擴增后用相應的限制酶來酶解擴增產(chǎn)物,通過瓊脂糖凝膠電泳確定DNA>t段是否被酶解成小片段；或者將PCRT增產(chǎn)物進行

12、ASO斑點雜交判斷基因座的狀態(tài).用基因探針直接和間接分析法可診斷的遺傳病見表2和表3.表2用RFLPs直接分析法可診斷的遺傳病不完全統(tǒng)計遺傳病基因探針軟骨發(fā)育不全II型膠原蛋白腎上腺皮質(zhì)增生癥類固醇21羥化酶淀粉樣多發(fā)神經(jīng)病變前白蛋白抗凝血酶W缺乏癥抗凝血酶WEhlers-Danlos綜合征a11膠原蛋白第10因子缺乏癥第10因子A型血友病第8因子及合成寡核昔酸B型血友病第9因子高膽固醇血癥低密度脂蛋白受體HPR礎(chǔ)乏癥HPRT免疫球蛋白k鏈缺乏癥免疫球蛋白CkLesch-Nyhan綜合征HPRTMarfan綜合征微纖維元基因FN1II型成骨不全原“11膠原蛋白地中海貧血a珠蛋白0珠蛋白合成寡核

13、昔酸抗胰蛋白酶缺乏癥合成寡核昔酸DMDBMD抗肌萎縮蛋白基因表3用RELPs間接分析法可診斷的遺傳病不完全統(tǒng)計遺傳病基因探針淀粉樣變性前白蛋白a1抗胰蛋白酶缺乏癥a1抗胰蛋白酶載脂蛋白CII缺乏癥載脂蛋白CU動脈粥樣化載脂蛋白AII型生長激素缺乏癥生長激素A型血友病第8因子B型血友病第9因子甲狀腺機能低下甲狀腺球蛋白高膽固醇血癥低密度脂蛋白受體基因身脂血癥載脂蛋白AI高甘油三酯血癥載脂蛋白AILesch-Nyhan綜合征HPRT苯丙酮尿癥苯丙氨酸羥化酶0地中海貧血0珠蛋白血栓形成抗凝血酶WDMDBMDPERT87-8P20(2)應用染色體DNA片段作探針進行RFLPs分析除了基因探針之外,還有

14、一些探針是基因組DNA片段.這些從基因組文庫中別離獲得的DNA片段,在確定了其能監(jiān)測出某些限制酶的RFLP后,便可用作探針的候選者.經(jīng)過染色體定位,大致判定其是否與目前已知的遺傳性疾病有連鎖關(guān)系,然后再通過對此遺傳性疾病家系的RFLP連鎖分析和優(yōu)勢對數(shù)計分(Lodscore),確定是否密切連鎖.如是,便可用作基因分析以至基因診斷的探針,如a-3/HVRf歹U用于APKD的基因分析(表4).表4用DNA>t段為探針監(jiān)測的遺傳病(不完全統(tǒng)計)遺傳病基因探針腎上腺白質(zhì)營養(yǎng)不良(adrenoleukodystrophy)Stl4成人型多囊腎a珠蛋白遺傳性腎炎DXS3DSS1纖維囊性變LAM4-9

15、17脆X綜合征第9因子5q-綜合征C-fmsBechwith-Wiedmann綜合征第11號染色體DNA>t段貓叫綜合征第5號染色體DNA片段成視網(wǎng)膜細胞瘤綜合征第13號染色體DNA片段Wilms瘤第11號染色體DNA>t段Wolf-Hirschhorn綜合征第4號染色體DNA片段Huntington舞蹈病G8通過RFLP連鎖分析,還可進行反向遺傳學的研究,即尋找那些目前尚未獲得的致病基因的DNA列及其基因產(chǎn)物.某些遺傳病的致病基因(進而正?；?就是通過這個途徑被揭示出來的,如DMD/BMD囊性纖維變.PCR/AS份析方法與RFLP連鎖分析比擬,它具有直接、簡化、快速、不需家系分

16、析、用材少等優(yōu)點,更適用于產(chǎn)前基因診斷.但要對一種遺傳病的診斷到達如此的地步,要經(jīng)過一段漫長而曲折的路.對于遺傳病的基因分析,總是先從臨床家系分析入手,了解它的遺傳規(guī)律,通過與其他遺傳標志的連鎖關(guān)系或伴隨發(fā)生的染色體缺陷,進行基因的染色體定位,再從染色體基因圖上尋找適宜的連鎖的RFLP探針,進行染色體步行(chromosomewalking)或染色體跳躍(chromosomejumping),獲得新的連鎖更緊密的RFLP探針,最后獲得基因DNA片段本身.隨后再進行DNAIU目應的cDNA列分析,明確基因的細微結(jié)構(gòu)及突變基因的致病突變細節(jié),到此才有可能合成相應的PCR引物和ASOW針(或者監(jiān)測基

17、因內(nèi)或近旁的RFLP位點用的PCR引物及探針).才有可能簡化基因分析的程序.三、血友病的產(chǎn)前基因診斷舉例血友病是遺傳性凝血疾患中最為常見的一種,是由凝血因子的缺陷引起的.為X-連鎖隱性遺傳.根據(jù)因子缺陷的類型不同,血友病主要有甲、乙兩型.甲型血友病系由血漿中凝血因子皿ffl活性缺陷所致,約占全部遺傳性凝血疾病的75%乙型血友病是因凝血因子IXFIX缺陷所致,發(fā)病率約為甲型的20%也有ffl、FIX同時缺陷的,但不常見,稱為甲乙混合型血友病.1 .血友病甲的臨床表現(xiàn)血友病甲又稱經(jīng)典型血友病,發(fā)病率約為1/10000男性.女性患者極為少見.血友病患者多有家族史,新生突變者大約占20%-30%甲型血

18、友病臨床表現(xiàn)為凝血困難及自發(fā)性出血傾向,如頻發(fā)的關(guān)節(jié)及軟組織出血,以大關(guān)節(jié)、下肢關(guān)節(jié)及其附帶肌群出血為常見.患者發(fā)病早,自兒童期即有表現(xiàn),出血頻度及嚴重程度與血漿中F皿活性水平相平行,50%!者血漿F皿活性水平僅為正常人的135%臨床表現(xiàn)較嚴重.其余患者的F皿活性浮動于正常值的5%-20g間,表現(xiàn)較輕.有些患者,其F皿水平可達正常的25%-50%幾乎沒有臨床病癥,只是在外傷或手術(shù)時才發(fā)現(xiàn)有凝血障礙.這種異質(zhì)性可能與基因的缺陷類型不同有關(guān).對于血友病的治療主要靠輸血療法.長期反復的輸入全血或凝血因子,經(jīng)濟上是一筆可觀的負擔；同時輸血反響也是不可無視的副作用,如免疫反響、特別是目前引人注目的血源性

19、病毒感染如AID&乙肝等疾病.此外遙遠地區(qū)有限的醫(yī)療條件或突發(fā)無援的創(chuàng)傷所造成的對生命的威脅,亦使人們?nèi)ふ倚碌挠行緩絹硎┬挟a(chǎn)前基因診斷,配合選擇性人工流產(chǎn)以限制患兒出生.曾經(jīng)采用血液學和免疫生物學指標進行患者診斷、攜帶者的檢出,及應用胎兒鏡采集胎兒血進行F皿的分析進行產(chǎn)前診斷.但這些方法或是準確性差或是取血風險大,已經(jīng)被淘汰.1984年,國際上首次報告了應用DNARFLP分析方法進行甲型血友病的基因診斷.此法除可進行胎兒的產(chǎn)前基因診斷外還可進行基因攜帶者的監(jiān)測,風險小、準確率高,因此迅速被人們廣泛采用.2 .凝血因子皿的基因缺陷F皿基因位于Xq28,在Deuteran色盲基因和G6

20、PD1因W近.R1基因全長約186kb,由26個外顯子和25個內(nèi)含子組成.其外顯子長度從69bp到310bp不等,內(nèi)含子長度變化于207bp32.4kb之間.FWmRNA約長9kb,cDNA長9009bp,5/非譯區(qū)長150bp,3/非譯區(qū)長1806bp.產(chǎn)物由2351個氨基酸組成,N端19個氨基酸為信號肽.成熟的ffl含2332個氨基酸,分子量為264763.分子可分成三個不同的結(jié)構(gòu)域A,B,C:A1-A2-B-A3-Cl-C2.因子活化時,B結(jié)構(gòu)被水解.通過DNA列分析,發(fā)現(xiàn)了不同類型的點突變表5,這些突變基因的產(chǎn)物可能是不完整的、無活性的或不穩(wěn)定的R1肽鏈,因而臨床表現(xiàn)為輕重不一.表5F

21、皿基因的點突變類型mRNAl口工信號突變IVS-2CT,TfCIVS-252G無義突變1941ArgfTermCGAUGA2209ArgfTermGGAUGA2166ArgfTermfUGA2307ArgfTermfUGA錯義突變291GlufGlyGAA>GGA2228ArgfGlnCGACAA此外還有些致病基因是基因片段缺失的結(jié)果但是大局部甲型血友病基因的突變細節(jié)仍不清楚,對這些基因的產(chǎn)前診斷只能靠RFLPs連鎖分析3 .甲型血友病的產(chǎn)前基因診斷應用印跡雜交技術(shù)進行RFLPs連鎖分析在F皿基因內(nèi)及其旁側(cè)有多組RFLPs位點可供產(chǎn)前診斷表6.國內(nèi)沈巖等人應用一系列探針表7對中國人F皿基

22、因進行了RFLPs分析表8,發(fā)現(xiàn)了一組新的Stl4/BctI多態(tài)性位點,并成功地進行了甲型血友病的產(chǎn)前基因診斷.表6F皿基因內(nèi)及其旁側(cè)的RFLPs限制酶位點探針片段長度kb及頻率BclIe18P114.120.88(0.71)/1.77(0.29)BglIe26P1.85(0.74)/20(0.26)HindWIVS-192.6(0.30)/2.7(0.70)MspIe26下游7.5(0.68)/4.3+3.2(0.32)XbalIVS-19BglnDXS15TaqlDXS52P482.64.8(0.59)/9.6(0.41)DX132.8(0.5)/5.8(0.5)St14-16.6(0.0

23、05)/5.4,5.2(0.045)4.8(0.12)/4.5(0.36)/4.1,4.0(0.205)3.9(1.105)/3.6(0.005)/3.4(0.155)表7進行甲型血友病基因分析所用的探針質(zhì)粒名稱抗性宿主菌載體插入位點插入片段kb探針片段長度kbp114.12AmpJM101pUC12StuI/SacI0.65BamH/SacI0.65p482.6AmpHB101pUC8EcoRI9.6EcoRI/SacI1.1St14-1Amp,TetHB101pBR322EcoR3.0EcoR3.0DX13AmpHB101pSP64EcoRI2.2EcoRI2.214-E18AmpJM10

24、1pUC18SmaE/HincU0.65/0.8EcoRI/Hindm1.45pY3.4Amp,TetHB101pBR322EcoRI3.4EcoRI3.4位點探針限制酶RFLPs(kb)PIC外顯子18p114.12BclI1.2(0.25)/0.9(0.75)0.38內(nèi)含子22p482.6Xba9.6(0.44)/4.8(0.56)049DXS52St14-1TaqlBclI4.0(0.09)/3.3(0.12)/3.0(0.44)/2.3(0.35)6.6(0.01)/5.3(0.12)表8中國人F皿基因內(nèi)及其旁側(cè)RFLPs4.8(0.17)/4.5(0.06)/4.1,4.0(0.02

25、)0.663.9(0.15)/3.3(0.31)3.0(0.44)/2.3(0.35)0.81DXS15DX13BglI5.8(0.19)/2.8(0.8)0.31在中國人中,RI基因內(nèi)部的RFLPs與國外的報道根本一致,而基因外RFLPs那么有很大差異如白種人中DX13位點BglII的頻率為0.5,而中國人高達0.81;歐美人群的St14/TaqI片段4.5kb和4.1kb出現(xiàn)頻率較高,而3.6kb較低,在中國人中正好相反.說明結(jié)構(gòu)基因內(nèi)多態(tài)性位點具有較高的保守性,而基因外DNA序列變異較大,存在著群體差異.因此在應用RFLPs進行連鎖分析時,應注意本民族本地區(qū)人群的RFLPs特點.此外,在進行RFLPs連鎖分析診斷血友病時,應該遵循以下三點：其一,首先確定攜帶者的基因型,尋找雜合的RF