提取紫杉醇初分離工藝的研究

1、紫杉醇（paclitaxel，商品名Taxol）是當(dāng)今一種重要的抗癌新藥。早在1971年，Wani等就從紅豆杉樹皮中發(fā)現(xiàn)并分離出了這種物質(zhì)。由于它特異的臨床抗癌療效，1992年被美國(guó)FAD批準(zhǔn)為治療晚期乳腺癌的特效藥而上市。然而，在實(shí)際藥物生產(chǎn)中，紫杉醇的大規(guī)模制備仍存在許多問(wèn)題。首先，紫杉醇來(lái)源匱乏，其主要存在于紅豆杉樹皮和針葉中，其次，紫杉醇在植物中含量極低，大約為0.010%0.013%，而紫杉醇與其它紫杉烷化合物在化學(xué)結(jié)構(gòu)和極性等方面又極為相似，要將它們完全分離困難很大。關(guān)于紫杉醇提取分離方法，已有過(guò)不少的研究。其中以液-液萃取應(yīng)用最為廣泛，在文獻(xiàn)報(bào)道的每一種工藝中，幾乎都采用過(guò)它。W

2、illey等和Mattina等在測(cè)定樣品中紫杉醇濃度時(shí)，選擇了固相萃取作為HPLC分析的預(yù)處理。以分子間吸附為機(jī)理的硅膠柱層析，是制備紫杉醇最常用的方法之一。1984年，Senilh等曾采用氧化鋁柱層析處理紅豆杉浸膏，但所報(bào)道的分離效果不是太理想。1995年，Matysik等曾用制備薄層層析來(lái)少量獲取紫杉醇。本研究的目的，在于尋找一條切實(shí)可行的工藝路線，最大程度地提高紫杉醇的回收率，以充分利用有限的紅豆杉資源；采用一些高效、經(jīng)濟(jì)的提取分離方法，減少過(guò)程步驟，快速、簡(jiǎn)捷地提取出紫杉醇。1 材料方法1.1 材料紅豆杉樹皮提取浸膏，云南張峰植物加工廠；紫杉醇對(duì)照品，純度大于95%，Sigma；固相萃

3、取柱（C18填料，10ml），大連化學(xué)物理研究所；GF254硅膠和粗孔硅膠（100140目），青島海洋化工廠；層析氧化鋁（200300目），上海新誠(chéng)精細(xì)化學(xué)品有限公司。DU-7紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)及FL-750HPLC儀，Beckman公司；XZ-6A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，北京科龍儀器公司；常壓層析系統(tǒng)，Pharmacia公司。1.2 方法1.2.1 液-液萃取 稱取紅豆杉樹皮浸膏于錐形瓶中，加CH2Cl2（浸膏CH2Cl2的重量比為1：50），充分溶解，再加入與CH2Cl2等量的水，充分混合后靜置分層，分液回收有機(jī)相，棄水相。有機(jī)相再加水萃取，重復(fù)三次。將有機(jī)相中的CH2Cl2減壓 蒸出回收，所得固相

4、物溶解于甲醇中，用HPLC作定性定量分析。1.2.2 固相萃取 固相萃取過(guò)程包括四個(gè)步驟，即固定相活化、樣品上柱、淋洗、樣品的洗脫。全過(guò)程將速度穩(wěn)定控制在58ml/min。固定相活化：取乙酸乙酯10ml加入柱中，抽空。依資助加入甲醇10ml和0.01mol/L(pH5.0)的乙酸銨緩沖液10ml（乙酸銨水溶液），將液面維持在膠層上12mm。上樣及淋洗：將樣品溶于80%90%的甲醇乙酸銨溶液中，取0.5ml加入柱中，抽空。依次用0.01mol/L的乙酸銨溶液10ml、50%的甲醇乙酸銨溶液淋洗，抽空。紫杉醇的洗脫：在淋洗好的柱子中加入80%的甲醇乙酸銨溶液10ml，收集洗脫液，減壓蒸發(fā)。從洗脫液

5、蒸發(fā)所得的固體物中取樣，溶解于甲醇，作HPLC定性定量分析。1.2.3 硅膠柱層析 硅膠用CHCl2浸泡，超聲波脫氣5min，重力沉降法裝柱（15mm-×260mm），用CHCl2充分洗出硅膠中的雜質(zhì)至柱床透明。樣品溶解于CHCl3后上柱，再用CHCl3充分洗去未被吸附的雜質(zhì)，然后用3：97（v/v）的CH3OH：CHCl3進(jìn)一步洗脫，收集洗脫峰，HPLC測(cè)定紫杉醇的濃度和純度。柱層析過(guò)程在常溫常壓下操作。1.2.4 氧化鋁柱層析 CH3OH、CHCl3用分子篩脫水，層析用氧化鋁190真空干燥6h后，用脫水CHCl3浸泡，超聲波脫氣5min，裝成15mm×260mm的層析柱

6、。清洗柱后上樣，用CHCl3洗去未被吸附的雜質(zhì)，再用1%的CH3OH、CHCl3（v/v）淋洗，最后用5%的CH3OH溶液洗脫出紫杉醇。HPLC測(cè)定其純度，柱層析過(guò)程在常溫常壓下操作。1.2.5 制備薄層層析 用GF254硅膠自制100mm×200mm層析薄板，105活化0.5h，樣品用CH3OH溶解，配成10mg/ml的溶液。毛細(xì)管點(diǎn)樣，成線狀，每板點(diǎn)樣量在2mg左右。在對(duì)照板中點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，用氯仿-甲醇（95：5）展開，254nm紫外光下確定紫杉醇的Rf值。切割并收集制備板上的紫杉醇帶，用CH3OH洗脫下硅膠上吸附的紫杉醇，HPLC測(cè)定其純度。1.2.6 紫杉醇的定量定性分析

7、采用HPLC對(duì)紫杉醇作定性定量分析：4.6mm×250mm的C18柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為227nm，等梯度洗脫，流動(dòng)相為甲醇-乙腈-水（20：32：48），流速1.0ml/min。以紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，外標(biāo)法作定量分析。2 結(jié)果及分析2.1 液-液萃取以1：1的二氯甲烷-水對(duì)粗品液-液萃取，紫杉醇富集到有機(jī)相。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，有機(jī)相與水相的分層速度慢，并有乳化現(xiàn)象。液-液萃取的紫杉醇回收率為94.6%，紫杉醇含量從0.65%提高到1.23%。液-液萃取的缺點(diǎn)在于產(chǎn)生的廢水較多。2.2 固相萃取用50%的CH3OH洗滌，紫杉醇不會(huì)被洗下，而濃度加大到80%，即可將紫杉醇從萃取柱洗脫。樣品經(jīng)一步固相

8、萃取，紫杉醇濃度可提高8.9倍，回收率為100%。與液-液萃取相比較，固相萃取的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在快速、簡(jiǎn)單、便于自動(dòng)化。同時(shí)，固相萃取的分離效率明顯高于液-液萃取。2.3 硅膠柱層析紫杉醇在硅膠柱上的保留較強(qiáng)，用CHCl3淋洗時(shí)，紫杉醇不被洗出。而用3%的CH3-OH：CHCl3（v/v）洗脫，可分離出兩個(gè)峰。HPLC分析表明，其中的第二個(gè)峰，即圖1中峰1為紫杉醇。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，在層析流動(dòng)相中添加0.05%4 水時(shí)，分離出的紫杉醇純度有所提高，分離速度也能顯著加快。經(jīng)硅膠柱層析，能獲得純化20倍以上、純度大于14%、回收率大于98%的紫杉醇。2.4 氧化鋁柱層析紫杉醇在氧化鋁柱上的保留和分離大致相同

9、。用最佳流動(dòng)相和高活性（即含水量低）的吸附劑分離芳烴異構(gòu)體，氧化鋁柱往往要比硅膠效果好得多。用5%的甲醇洗脫，可將大部分紫杉醇洗出。Carver等認(rèn)為，氧化鋁能使糖基化的紫杉醇轉(zhuǎn)化為紫杉醇，從而增加了紫杉醇的總量，使紫杉醇的回收率可能大于100%。我們的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象，這一現(xiàn)象的確切原因還有待于深入探索。2.5 制備薄層層析硅膠薄層層析（TLC）原理與硅膠柱層析原理一致。TLC可將樣品分離出11條以上的色帶，紫杉醇帶在薄板的中部（Rf0.5），呈現(xiàn)紫紅色。應(yīng)用TLC純化紫杉醇，一步可將紫杉醇含量從0 .65%提高到13.9%，回收率為99.7%。2.6 預(yù)處理的比較各處理步驟比較如表1。

10、表1中數(shù)據(jù)可知，以氧化鋁柱層析純化紫杉醇的效率最高。氧化鋁介質(zhì)便宜，能充分利用有限的紅豆杉原料，是一可行的純化紫杉醇方法。其次是硅膠柱層析，浸泡好的硅膠半透明，在玻璃層析柱上能觀察到層析進(jìn)展情況，操作很直觀。TLC的優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備簡(jiǎn)單、有機(jī)溶劑消耗很少。但TLC處理量較小，工業(yè)放大困難。固相萃取的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在簡(jiǎn)單、便于自動(dòng)化、能顯著減少溶劑的用量。表1  預(yù)處理步驟對(duì)紫杉醇純化效果的比較-步驟             樣品量(mg)   紫杉醇(mg)

11、   純度(%)  回收率(%)  純化倍數(shù)粗品               22.50          0.146       0.65       100    &

12、#160;   1液-液萃取          11.79          0.145       1.23        99.3      1.9固相萃取     

13、       2.27          0.146       6.44       100        9.9硅膠柱層析          0.98 &#

14、160;        0.144       14.63       98.9      22.5氧化鋁柱層析        0.79          0.205   

15、;    26.3       140.5      40.5薄層層析            1.05          0.146       13.91   

16、0;   99.7      21.4-2.7  初分離工藝的提出HPLC分析表明，粗品經(jīng)過(guò)氧化鋁柱層析處理后，極性比紫杉醇弱的物質(zhì)基本被除去，而極性比紫杉醇稍強(qiáng)的雜質(zhì)用正相柱已很難分離。僅經(jīng)一步正相柱層析，樣品中的成分還較復(fù)雜，若直接上HPLC制備，必將影響HPLC柱的使用壽命、進(jìn)料量等。因此，有必要對(duì)樣品作進(jìn)一步的處理。較理想的工藝集成是氧化鋁正相柱層析處理后采用一步反相層析，即采用一步C18固相萃取，以除去極性比紫杉醇稍強(qiáng)的雜質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2，預(yù)處理工藝純化紫杉醇的純化倍數(shù)達(dá)60以上，紫杉醇回收率為135.

17、5%，純度為42.2%。                     表2  預(yù)處理工藝純化紫杉醇結(jié)果-步驟             樣品量(mg)   紫杉醇(mg)   純度(%)  回收率(%)  純化倍數(shù)粗

18、品               85.50          0.555       0.65       100       1氧化鋁柱層析        2.99