升降散治療急性肺損傷作用的實驗研究

1、    升降散治療急性肺損傷作用的實驗研究作者：常加松 ,魏凱峰, 潘云    作者單位：南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江蘇南京210029【摘要】  【目的】探討升降散治療急性肺損傷的作用機理?！痉椒ā?0只雄性SD大鼠，隨機分為正常組、模型組、升降散組（劑量為2g/kg)。給藥6d后，舌下靜脈注射脂多糖（LPS）復(fù)制急性肺損傷模型，取肺組織切片，免疫組化檢測;采集圖像，分析微血管內(nèi)皮細胞核的平均灰度。【結(jié)果】升降散組與模型組比較，能顯著性抑制微血管內(nèi)皮細胞核中核因子B（NFB）的表達（）?！窘Y(jié)論】升降散可通過抑制肺

2、微血管內(nèi)皮細胞NFB的表達，抑制炎癥反應(yīng)對肺組織造成的急性損傷，對急性肺損傷起到防治作用?！娟P(guān)鍵詞】  升降散/藥理學(xué)；急性肺損傷/中藥療法;肺組織/病理學(xué);疾病模型，動物;大鼠    核因子B（NFB）是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，參與多種炎癥介質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄與表達，參與了急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展全過程，調(diào)控NFB的藥物有可能成為治療急性肺損傷的重要手段之一1。本實驗通過觀察在急性肺損傷后肺微血管內(nèi)皮細胞中NFB的表達及升降散對其表達的影響，以探討升降散對急性肺損傷的治療作用機理?，F(xiàn)報道如下。1材料與方法    11動物及分組雄性SD大

3、鼠40只，體質(zhì)量（160±20）g，購于南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，合格證號為syxk(蘇)20020123，清潔級。所有大鼠隨機分為3組：正常組、模型組、升降散組。    12藥物升降散由僵蠶、蟬蛻、大黃、姜黃按質(zhì)量比63121比例組成。將上藥在粉碎機上分別粉碎后，過200目細篩，置干燥處備用。    13試劑及儀器NFB p65兔抗人、大鼠、小鼠抗體，即用型鏈酶親和素生物素過氧化物酶復(fù)合物（SABC）試劑盒（一抗稀釋：1100），二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑均購自武漢博士德公司;脂多糖（LPS）購自Sigma公司；其他試

4、劑為進口或國產(chǎn)分析純。Olympus DP70 CCD圖像獲取系統(tǒng)；北航病理圖像分析系統(tǒng)。    14給藥與造模1升降散組灌胃劑量為2g/kg，濃度為50g/L，每天灌胃2次，兩次間隔時間為4h，連續(xù)灌胃6d，正常組及模型組灌服等容積的蒸餾水。末次灌胃1h后，用20g/L戊巴比妥鈉(40/kg)腹腔注射麻醉動物。正常組舌下靜脈注射生理鹽水2mL/kg。模型組及升降散組舌下靜脈注射LPS（用生理鹽水配制，濃度為25mg/mL，劑量為5mg/kg）復(fù)制急性肺損傷模型。各組于注射2h后采集標(biāo)本。    15取材及切片各組于注射2h后，完整取

5、出左、右肺，取右下肺葉浸泡于40g/L多聚甲醛中固定，1周后常規(guī)石蠟包埋，切片，片厚5m，置56溫箱中烤12h。    16免疫組化檢測切片脫蠟至水，置于體積分數(shù)3%H2O2中，室溫7min，消除內(nèi)源性酶；pH 60枸椽酸鹽緩沖液高壓修復(fù)抗原，以下步驟按照試劑盒中說明書操作。    17圖像觀察及分析每只大鼠選1張結(jié)構(gòu)完整的切片，在40倍顯微鏡下觀察，每張切片隨機選58支肺微血管，每支肺微血管鏡下取46個內(nèi)皮細胞，采集圖像后用北航病理圖像分析系統(tǒng)，分析內(nèi)皮細胞核的平均灰度。    18統(tǒng)計學(xué)方法對所獲取圖

6、像的平均灰度及平均光密度值，用SPSS 110軟件行單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett T3檢驗。    2結(jié)果    21升降散對急性肺損傷大鼠肺組織微血管內(nèi)皮細胞NFB表達的影響結(jié)果見表1、圖1。表1各組急性肺損傷大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞NFB表達組別ND正常組13105843±13649模型組1352451±9909升降散組1481512±106761，與正常組比較；1，與模型組比較表1結(jié)果顯示，平均灰度的數(shù)值由低到高分別為模型組、升降散組、正常組，平均灰度的數(shù)值越低內(nèi)皮細胞NFB表達越顯著

7、。模型組與正常組比較差異有顯著性意義（1），升降散組與模型組比較差異有顯著性意義（1)。圖1結(jié)果顯示，正常組肺微血管內(nèi)皮細胞NFB表達染色后，胞核呈淡藍色；模型組肺微血管內(nèi)皮細胞NFB表達染色后，胞核呈棕褐色；升降散組肺微血管內(nèi)皮細胞NFB表達染色后，胞核呈棕色。肺微血管內(nèi)皮細胞NFB表達越顯著，染色越深，未表達胞核染色后呈藍色。    3討論急性肺損傷的發(fā)病機理主要是致病因子對肺血管內(nèi)皮細胞的直接損傷和全身的炎癥反應(yīng)。全身炎癥反應(yīng)主要涉及到中性粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞和腫瘤壞死因子，白介素1、 8等炎癥介質(zhì)，以及它們與血管內(nèi)皮細胞的相互作用, NFB的活化有調(diào)

8、節(jié)細胞凋亡的作用，能夠抑制中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等炎性細胞的凋亡，導(dǎo)致炎性細胞的數(shù)量異常增多，釋放大量的炎性介質(zhì)。而抑制內(nèi)皮細胞NFB的表達有減輕或治療急性肺損傷的作用。升降散出于清代楊栗山傷寒溫疫條辨，主要由僵蠶、蟬衣、姜黃、大黃組成，是治療瘟疫火毒內(nèi)郁三焦，氣機不暢等病證的主要方劑，具有升清降濁、宣郁清熱等功效?，F(xiàn)代臨床及實驗研究發(fā)現(xiàn)，本方具有較好地退熱、抗炎以及保護肺組織作用3-5。本實驗結(jié)果表明，升降散治療組可以顯著性抑制造模后大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞NFB表達，結(jié)果與模型組比較有顯著性差異（1）。升降散對急性肺損傷的治療作用可能是通過抑制肺微血管內(nèi)皮細胞NFB的表達，從而抑制炎癥

9、反應(yīng)的放大，對抗細胞凋亡，起到組織保護的目的?！緟⒖嘉墨I】1Duffey D C，Chen Z, Dong G, et al. Expression of a dominant negative mutant inhibitorkappa B of nuclear factorkappa B in human head and neck syuamous cell carcinoma inhibits survival proinflammatory, cytokine expression and tumor growth in vivoJ. Cancer Res, 1999, 59 (14):3468.2謝蓉，董文核因子B的活化及其在急性肺損傷中的作用機制J福建醫(yī)藥雜志，2004，26（1）：112.3劉建軍