14可見分光光度法

1、第六章第六章 儀器分析儀器分析上海市醫(yī)藥學校上海市醫(yī)藥學校Office:Office:藥物分析課題組藥物分析課題組2模塊一模塊一 紫外分光光度法紫外分光光度法第二節(jié)第二節(jié) 分光光度法分光光度法學習內容：學習內容：v 理解比色法和分光光度法的基本原理；理解比色法和分光光度法的基本原理；v了解紫外分光光度計的基本原理了解紫外分光光度計的基本原理 v學會紫外分光光度計的保養(yǎng)；學會紫外分光光度計的保養(yǎng)；工作內容：工作內容：v規(guī)范操作規(guī)范操作722s分光光度計分光光度計v 規(guī)范操作規(guī)范操作755B紫外分光光度計紫外分光光度計3工作任務一工作任務一v使用使用722S722S型分光光度計測定高錳酸鉀的吸收光

2、線型分光光度計測定高錳酸鉀的吸收光線v使用使用722S722S型分光光度計測定高錳酸鉀溶液的濃度型分光光度計測定高錳酸鉀溶液的濃度 繪制標準曲線繪制標準曲線 測定未知樣品的吸光度測定未知樣品的吸光度 求算未知樣品的濃度求算未知樣品的濃度 思考題的討論思考題的討論 完成實訓報告書完成實訓報告書4任務一：任務一： 722S722S型分光光度計的操作步驟型分光光度計的操作步驟v 開機、預熱開機、預熱 v 確定濾光片位置確定濾光片位置 本儀器備有減少雜散光，提高本儀器備有減少雜散光，提高340340380nm380nm波段光度準確性的濾光片，波段光度準確性的濾光片，位于樣品室內側，用一撥桿來改變位置。

3、位于樣品室內側，用一撥桿來改變位置。 當測試波長在當測試波長在340340380nm380nm波段內如作高精度測試可將撥桿推向前，波段內如作高精度測試可將撥桿推向前， 通常可不使用此濾光片，可將撥桿置在通常可不使用此濾光片，可將撥桿置在4004001000nm1000nm位置。位置。5v 調整波長調整波長 使用儀器上波長調節(jié)旋鈕，即可方便地調整儀器當前測試波長，使用儀器上波長調節(jié)旋鈕，即可方便地調整儀器當前測試波長，具體波長由旋鈕左側的顯示窗顯示，讀波長數時目光垂直觀察。具體波長由旋鈕左側的顯示窗顯示，讀波長數時目光垂直觀察。v 調整功能鍵調整功能鍵 TRANS.TRANS.透射比透射比 AB

4、S.ABS.吸光度吸光度 FACT.FACT.濃度因子濃度因子 CONC.CONC.濃度直讀濃度直讀任務一：任務一： 722S722S型分光光度計的操作步驟型分光光度計的操作步驟6v 調整透光率調整透光率 功能鍵放置于功能鍵放置于“T T” 調調100%100%：將用作背景的空白樣：將用作背景的空白樣品置入樣品室光路中蓋下試樣品置入樣品室光路中蓋下試樣蓋（同時打開光門），按下蓋（同時打開光門），按下“100%T100%T”鍵即能自動調整鍵即能自動調整100%T100%T（一次有誤差時可加按一（一次有誤差時可加按一次）。次）。 調調0%0%：打開試樣蓋（關閉光門：打開試樣蓋（關閉光門）或用不透光

5、材料在樣品室中）或用不透光材料在樣品室中遮斷光路，然后按遮斷光路，然后按“0%0%”鍵，鍵，即能自動調整零位。即能自動調整零位。 任務一：任務一： 722S722S型分光光度計的操作步驟型分光光度計的操作步驟7v 測定吸光度測定吸光度 功能鍵放置于功能鍵放置于“A A” 改變試樣槽位置讓不同樣品進入光路改變試樣槽位置讓不同樣品進入光路 儀器標準配置中試樣槽架是四位置的，用儀器前面的儀器標準配置中試樣槽架是四位置的，用儀器前面的試樣槽拉桿來改變，打開樣品室蓋以便觀察樣品槽中試樣槽拉桿來改變，打開樣品室蓋以便觀察樣品槽中的樣品位置最靠近測試者的為的樣品位置最靠近測試者的為“0 0”位置，依次向外拉

6、位置，依次向外拉出相應的為出相應的為“1 1”“”“2 2”“”“3 3”位置，當拉桿到位時有定位置，當拉桿到位時有定位感，到位時請前后輕輕推動一下以確定定位正確。位感，到位時請前后輕輕推動一下以確定定位正確。 讀取數值并記錄。讀取數值并記錄。任務一：任務一： 722S722S型分光光度計的操作步驟型分光光度計的操作步驟8任務二：吸收光譜曲線的繪制任務二：吸收光譜曲線的繪制教師演示教師演示v 標準溶液的配制標準溶液的配制 準確稱取高錳酸鉀（基準）準確稱取高錳酸鉀（基準）0.125g,0.125g,在小燒杯中溶解，定量移入在小燒杯中溶解，定量移入1000mL1000mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻

7、度，搖勻。容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。v 試樣準備試樣準備 吸取上述標準溶液吸取上述標準溶液20mL20mL于于50mL50mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻v 測定測定 1cm1cm比色皿，以蒸餾水作空白比色皿，以蒸餾水作空白 波長選擇：波長選擇：450450、460460、480480、500500、520520、525525（此處多選幾點）、（此處多選幾點）、530530、540540、560560、580580、600600 分別測定個波長下的吸光度分別測定個波長下的吸光度A A。v 繪制吸收光譜曲線繪制吸收光譜曲線 以波長為橫坐標，以吸收

8、度為縱坐標，繪制曲線以波長為橫坐標，以吸收度為縱坐標，繪制曲線 找出最大波長找出最大波長maxmax。0(nm)525A9任務三：標準曲線的繪制任務三：標準曲線的繪制學生分組實訓學生分組實訓v標準系列溶液標準系列溶液 取取6 6只只25ml25ml的容量瓶，分別精密加入高錳酸鉀標準溶液的容量瓶，分別精密加入高錳酸鉀標準溶液0.000.00、1.001.00、2.002.00、3.003.00、4.004.00、5.00ml,5.00ml,加蒸餾水稀釋加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻至刻度，搖勻v測定測定 波長選定為波長選定為maxmax，以以1 1號為空白號為空白 依次測定依次測定2 26 6號標準系

9、列比色液的吸光度號標準系列比色液的吸光度A A值。值。v繪制標準曲線繪制標準曲線 以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。準曲線。10任務四：樣品的測定任務四：樣品的測定學生分組實訓學生分組實訓v樣品試液的配制樣品試液的配制 取取1 1只只25ml25ml的容量瓶，精密加入高錳酸鉀樣品液的容量瓶，精密加入高錳酸鉀樣品液5.00ml,5.00ml,（約含（約含KMnOKMnO4 40.5mg0.5mg）, ,加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。v測定吸光度測定吸光度 在相同條件下，測定樣品的吸光度在相同條件下，測定樣品的吸光度v計算計算

10、 從標準曲線上查出相應濃度的從標準曲線上查出相應濃度的KMnOKMnO4 4 濃度，即為樣品比色液的濃度。濃度，即為樣品比色液的濃度。11概述概述v光譜分析光譜分析含義：根據物質對光的選擇性吸收及光的吸收定律含義：根據物質對光的選擇性吸收及光的吸收定律對物質進行定性和定量分析的分析方法。對物質進行定性和定量分析的分析方法。 分類：比色法、分光光度法分類：比色法、分光光度法v比色法比色法含義：比色分析法（簡稱比色法）就是通過比較有含義：比色分析法（簡稱比色法）就是通過比較有色物質溶液顏色深淺測定物質含量的分析方法。色物質溶液顏色深淺測定物質含量的分析方法。分類：目視比色法、光電比色法分類：目視比

11、色法、光電比色法12v目視比色法目視比色法 標準系列比色液標準系列比色液 樣品液與標準液比色樣品液與標準液比色概述概述一致一致13v 分光光度法分光光度法 含義：含義：根據物質對一定波長光線的吸收程度已確定物質含量的分析方根據物質對一定波長光線的吸收程度已確定物質含量的分析方法。運用棱鏡或光柵作為分光器，用光電管和檢流計測量溶液透射法。運用棱鏡或光柵作為分光器，用光電管和檢流計測量溶液透射光的強度，并直接表示出透光率和吸收度，從而求得被測液濃度或光的強度，并直接表示出透光率和吸收度，從而求得被測液濃度或含量。含量。 分類：紫外可見分光光度法、紅外分光光度法分類：紫外可見分光光度法、紅外分光光度

12、法一、概述一、概述14一、比色法和分光光度法特點一、比色法和分光光度法特點v靈敏度高靈敏度高 適用于測量微量物質，最低濃度為適用于測量微量物質，最低濃度為1010-5-5-10-10-7-7mol/Lmol/L，v有一定的準確度有一定的準確度 比色法相對誤差為比色法相對誤差為5-20%5-20%，分光光度法的相對誤差為，分光光度法的相對誤差為2%-5%2%-5%v操作簡便，測定快速操作簡便，測定快速 只需要幾分鐘到十幾分鐘，甚至更短只需要幾分鐘到十幾分鐘，甚至更短v應用范圍廣應用范圍廣 幾乎所有的無機離子和許多有機化合物均可直接或幾乎所有的無機離子和許多有機化合物均可直接或間接地用比色法或分光

13、光度法測定間接地用比色法或分光光度法測定15二、比色法和分光光度法的原理二、比色法和分光光度法的原理比色法和分光光度法的依據是物質對光的選擇吸收比色法和分光光度法的依據是物質對光的選擇吸收v 光的基本性質光的基本性質光的波長與其能量或頻率成反比關系光的波長與其能量或頻率成反比關系 光的波長越短，頻率或能量越高光的波長越短，頻率或能量越高光的波長越長，頻率或能量越低光的波長越長，頻率或能量越低波粒二象性波粒二象性ChhEE光子的能量；h普朗克常數；C光的傳播速度光的頻率，Hz；光的波長，nm16二、比色法和分光光度法的原理二、比色法和分光光度法的原理v 常用波長來表示各種不同的電磁輻射常用波長來

14、表示各種不同的電磁輻射v 人眼睛能覺察到的波段稱為可見光，波長范圍人眼睛能覺察到的波段稱為可見光，波長范圍400-400-760nm760nmv 紅外線紅外線(760nm)(760nm)、紫外線（、紫外線（400nm400nm）、）、X X射線射線v 按照電磁波波長大小順序可把電磁波劃分成幾個區(qū)按照電磁波波長大小順序可把電磁波劃分成幾個區(qū)域，叫做光譜區(qū)域，由各光譜區(qū)域按順序排成的系域，叫做光譜區(qū)域，由各光譜區(qū)域按順序排成的系列叫做列叫做電磁波譜電磁波譜17電磁波譜電磁波譜181.1.光的性質光的性質v 單一波長的光稱為單色光單一波長的光稱為單色光v 由不同波長的光混合而成的光稱為由不同波長的光

15、混合而成的光稱為復復合光合光v 讓一束白光通過棱鏡，可分解為紅、讓一束白光通過棱鏡，可分解為紅、橙、黃、綠、青、藍、紫七種顏色的橙、黃、綠、青、藍、紫七種顏色的光，這種現象稱為光，這種現象稱為光的色散光的色散v 將兩種適當顏色的單色光按一定強度將兩種適當顏色的單色光按一定強度比例混合可成為白光，這兩種單色光比例混合可成為白光，這兩種單色光稱為稱為互補色光互補色光。19互補色光互補色光202.2.吸收光譜吸收光譜v 吸收光譜曲線吸收光譜曲線v 將不同波長的單色光依次通過一定濃度的溶液，測量每一將不同波長的單色光依次通過一定濃度的溶液，測量每一波長下溶液對各種單色光的吸收程度（吸收度波長下溶液對各

16、種單色光的吸收程度（吸收度A A），然后），然后以波長（以波長（）為橫坐標、吸收度（）為橫坐標、吸收度（A A）為縱坐標作圖，即）為縱坐標作圖，即得一吸收光譜曲線。得一吸收光譜曲線。v 吸收度最大處所對應的波長稱為最大吸收波長，吸收度最大處所對應的波長稱為最大吸收波長，maxmax物質吸收不同波長的光的特性物質吸收不同波長的光的特性只與溶液中只與溶液中物質的結構有關物質的結構有關, ,與溶液的與溶液的濃度無關濃度無關. .不同物質的光譜曲線不同不同物質的光譜曲線不同吸收光譜曲線作為定性的依據吸收光譜曲線作為定性的依據A/nm525021 將不同波長的單色光依將不同波長的單色光依次通過一定濃度的

17、溶液，次通過一定濃度的溶液，測量每一波長下溶液對測量每一波長下溶液對各種單色光的吸收程度各種單色光的吸收程度（A A），以波長（），以波長（）為）為橫坐標，吸光度為縱坐橫坐標，吸光度為縱坐標得到的一條曲線。標得到的一條曲線。濃度越大，吸收峰越高無關與溶液濃度Cmax峰谷吸收光譜曲線吸收光譜曲線max22LI0ItIa I I0 0 = I= Ia a + I+ It t透光率透光率吸光度吸光度%1000IITtTATAlg 1lg或或3.3.光的吸收定律光的吸收定律23朗伯朗伯- -比爾定律比爾定律v 含義含義 當一束平行的單色光通過當一束平行的單色光通過均勻、無散射均勻、無散射現象的溶液時，

18、在單色光強度、溶現象的溶液時，在單色光強度、溶液溫度等條件不變的情況下，溶液的吸光度與溶液的液溫度等條件不變的情況下，溶液的吸光度與溶液的濃度濃度和液層的和液層的厚度厚度的的乘積成正比乘積成正比。v 應用范圍應用范圍 適用于適用于單色光單色光和和一定范圍的一定范圍的低低濃度濃度溶液溶液 溶液濃度過大，透光性質發(fā)生變化，吸光度與濃度不成正比關系溶液濃度過大，透光性質發(fā)生變化，吸光度與濃度不成正比關系 波長較寬的混合光影響光的互補吸收，也會使測定產生誤差波長較寬的混合光影響光的互補吸收，也會使測定產生誤差A = KcL24吸收系數吸收系數(K)(K)也稱吸光系數也稱吸光系數v百分吸收系數（比吸收系

19、數）百分吸收系數（比吸收系數）v摩爾吸收系數摩爾吸收系數 = = v= = A = K c L=c(g/100mL) L(cm)AA c(mol/L) L(cm)10M濃度為濃度為1%(g/100mL)的溶液的溶液厚度為厚度為1cm時的吸光度，時的吸光度，單位是單位是mL/(gcm)濃度為濃度為1mol/L的溶液的溶液厚度為厚度為1cm時的吸光度，時的吸光度，單位是單位是L/(molcm)25v吸收系數在一定條件下是常數吸收系數在一定條件下是常數v與入射光的波長、物質的性質、溶劑、溫度及儀與入射光的波長、物質的性質、溶劑、溫度及儀器的質量等因素有關器的質量等因素有關v數值越大，表明有色溶液對光

20、越容易吸收，測定數值越大，表明有色溶液對光越容易吸收，測定的靈敏度越高的靈敏度越高v一般一般值在值在10103 3以上，即可進行分光光度測定以上，即可進行分光光度測定v吸收系數是定性和定量分析的重要依據吸收系數是定性和定量分析的重要依據26應用應用v氯霉素（氯霉素（M=323.15g/molM=323.15g/mol）的水溶液，在）的水溶液，在278nm278nm處有最處有最大吸收，設用純品配制大吸收，設用純品配制100mL100mL含氯霉素含氯霉素2.00mg2.00mg的溶液的溶液，以，以1cm1cm的吸收池，在的吸收池，在278nm278nm處測得吸光度為處測得吸光度為0.6140.614，求求和和v有一濃度一定的溶