川芎嗪預(yù)處理對(duì)心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷延遲保護(hù)作用

1、川芎嗪預(yù)處理對(duì)心肌細(xì)胞缺血/再灌注損傷延遲保護(hù)作用 09-02-01 15:33:00 作者：古小明,何明編輯：studa20【摘要】 目的 探討川芎嗪預(yù)處理對(duì)心肌缺血/再灌注損傷延遲保護(hù)作用。方法 實(shí)驗(yàn)用SD新生（13 d）大鼠，雌雄不拘，無(wú)菌取出乳鼠心臟，經(jīng)分離附著組織、胰蛋白酶消化及純化制成心肌細(xì)胞培養(yǎng)，第4 天隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照（Control）組、缺氧/復(fù)氧（A/R）組、缺氧預(yù)處理(APC)組、川芎嗪(TMPZ)組。觀察心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率、細(xì)胞存活率（MTT法）、培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶（LDH）活性。結(jié)果 細(xì)胞搏動(dòng)頻率：缺氧/復(fù)氧組(133 )次/min，與正常對(duì)照組相比差異有顯著性（

2、P0.05），與缺氧/復(fù)氧組比較差異有顯著性（P0.05）；細(xì)胞存活率： 缺氧/復(fù)氧組(36.234.05)%，與正常對(duì)照組比較，差異有顯著性（P0.05）；APC組(83.766.92)%，TMPZ組(80.564.65)%分別與缺氧/復(fù)氧組比較，差異有顯著性（P0.05）；LDH活性： 缺氧/復(fù)氧組(36.732.35) U/L與正常對(duì)照組比較，差異有顯著性（P0.05）；APC組（5.700.63 ） U/L、TMPZ組(5.740.34) U/L，分別與缺氧/復(fù)氧組比較，差異有顯著性（P0.05）。結(jié)論 從細(xì)胞水平證實(shí)TMPZ預(yù)處理后24 h心肌細(xì)胞對(duì)再次缺氧/復(fù)氧損傷具有保護(hù)作用。

3、【關(guān)鍵詞】 缺氧/復(fù)氧損傷；缺氧預(yù)適應(yīng)；延遲保護(hù)；川芎嗪Abstract:Objective To investigate the delayed myocardioprotection of TMPZ pre- conditioning. Methods Cultured myocardial cells of neonatal SD rats have been randomly divided into 4 groups: Control group; anoxia reoxygenation (A/R)group;anoxia preconditioning group(APC); T

4、MPZ group; In each group, the cardiomyocytes were subjected to anoxia (3 hr) followed by reoxygenation (1 hr) 24 hr after anoxic (or TMPZ) preconditioning on the model of the cultured cardiomyocytes. At the end of experiment, myocardial cells beating rate, cell viability and the activity of LDH in c

5、ulture were measured. Results Beating rate of ventricular myocytes: The beating rate was significantly slow in A/R group(133 beats/min) compared with that of control group（P0.05）,and compared with A/R , the beating rate was significantly increased（P0.05）;the cell viability:The cell viability of A/R(

6、36.234.05)% was significantly decreased when compared with that of control group（P0.05）; the viability of APC (83.766.92)% ,TMPZ (80.564.65)% was significantly increased when compared with A/R respectively，（P0.05）;LDH activity: LDH activity of A/R (36.732.35 ) U/L was significantly increased when co

7、mpared with Control group（P0.05）； LDH activity of APC（5.700.63 ）U/L or TMPZ (5.740.34 ) U/L was significantly decreased when compared with A/R respectively （P0.05）.Conclusion TMPZ preconditioning can mimic the delayed protection on cultured neonatal rat myocardiocytes with hypoxia/reperfusion injury

8、.Key words: anoxia/reoxygenation; anoxia preconditioning; delayed protection; TMPZ心肌缺血預(yù)適應(yīng)（ischemic precoditioning，IPC）指一次或幾次短暫反復(fù)心肌缺血再灌注可使心肌在此后的持續(xù)缺血再灌注損傷中得到保護(hù)1。這一概念自1986年Murry等提出后，即為缺血心肌的保護(hù)及其機(jī)制的探索開(kāi)辟一個(gè)新的領(lǐng)域，成為許多學(xué)者專家研究的熱點(diǎn)。根據(jù)保護(hù)效應(yīng)出現(xiàn)的時(shí)間，IPC被分為早期(early phase,EP)和延遲期(delayedphase,DP)2個(gè)階段2。EP發(fā)生于缺血后數(shù)分鐘,持續(xù)23 h；

9、DP于缺血1224 h后出現(xiàn)、持續(xù)34 d。由于DP的持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)便于利用,成了臨床和實(shí)驗(yàn)研究的重點(diǎn)。研究者們期望發(fā)現(xiàn)此類藥物或識(shí)別DP中合成的內(nèi)源性保護(hù)蛋白，擬在臨床有效地應(yīng)用IPC。川芎嗪是中藥川芎的主要生物堿，其化學(xué)結(jié)構(gòu)是四甲基吡嗪(trtramethylpyrazine, TMPZ)。本研究在原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷及缺氧預(yù)處理模型上,觀察缺氧預(yù)處理后24 h對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷的延遲保護(hù)作用。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 由江西醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供的SD大鼠的乳鼠（13 d），雌雄不限,合格證號(hào)0219602。1.2主要試劑 5Br2deoxyuridine (BrdU): S

10、igma公司產(chǎn)品；MEM培養(yǎng)基：GIBCO BRL公司產(chǎn)品；4(2hydroxyethyl)1piperazine ethanesulfonic acid (HEPES): Sigma公司產(chǎn)品；胎牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品；川芎嗪粉劑：中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，生產(chǎn)批號(hào)：001026；青霉素鈉鹽：江西東風(fēng)藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；鏈霉素：華美生物有限公司產(chǎn)品。1.3實(shí)驗(yàn)主要儀器和設(shè)備 超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備廠；二氧化碳培養(yǎng)箱:長(zhǎng)沙長(zhǎng)錦應(yīng)用技術(shù)研究所；全自動(dòng)生化分析儀:美國(guó)Beckman公司。1.4方法 取2025只出生13 d的SD乳鼠的心肌細(xì)胞進(jìn)行無(wú)菌分離、純化、培養(yǎng)，參照Spe

11、ctor3等的方法略加改進(jìn)。將培養(yǎng)第4 天的原代心肌細(xì)胞隨機(jī)分4組：正常對(duì)照（Control）組、缺氧/復(fù)氧（A/R）組、缺氧預(yù)處理(APC)組、川芎嗪(TMPZ終溶度為100 mol/L)組；每組重復(fù)8次進(jìn)行缺氧預(yù)處理、TMPZ預(yù)處理和缺氧復(fù)氧實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后于倒置顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)單位時(shí)間內(nèi)各組心肌細(xì)胞搏動(dòng)的頻率；采取MTT比色法檢測(cè)心肌細(xì)胞存活率，美國(guó)Beckman生化自動(dòng)分析儀測(cè)定LDH活性。1.5統(tǒng)計(jì)分析 采用統(tǒng)計(jì)軟件SAS8.0進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)、方差分析（ANOVA），以P0.05為差異有顯著性。2結(jié) 果2.1各處理組心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷后細(xì)胞搏動(dòng)的變化 正常對(duì)照組心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率(993)次min-1相對(duì)恒定，節(jié)律規(guī)則；與正常對(duì)照組相比，缺氧/復(fù)氧組(133)次min-1差異有顯著性（P0.05），表現(xiàn)為搏動(dòng)頻率減慢、搏動(dòng)幅度減弱、節(jié)律不齊，有部分停搏，部分細(xì)胞搏動(dòng)幅度強(qiáng)弱不等；而正常對(duì)照組與APC組(8